煙粉虱中甘薯雙生病毒(sweepoviruses)半巢式PCR快速檢測技術(shù)的建立與應用

秦艷紅 王爽 田雨婷 喬奇 張德勝 王永江 張振臣

摘要

甘薯雙生病毒（sweepoviruses）是侵染甘薯的一類重要病毒，通過煙粉虱以持久方式傳播，我國甘薯上至少存在8種甘薯雙生病毒。本研究根據(jù)我國已報道的8種甘薯雙生病毒基因組保守區(qū)設計了一組引物，建立了單頭煙粉虱中甘薯雙生病毒的半巢式PCR快速檢測方法。特異性和靈敏性分析結(jié)果表明，半巢式PCR具有較高的特異性和靈敏性，以8種不同甘薯雙生病毒重組質(zhì)粒為模板時，該方法能同時檢測出8種甘薯雙生病毒，且半巢式PCR方法的靈敏性比常規(guī)PCR高10～10 000倍。對煙粉虱的檢測結(jié)果表明，該方法能穩(wěn)定地從單頭煙粉虱中檢測出甘薯雙生病毒。該方法具有經(jīng)濟、快速，靈敏性、特異性和穩(wěn)定性均較好等優(yōu)點。

??關鍵詞

甘薯雙生病毒;半巢式PCR;檢測

中圖分類號：

S435.31

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020524

Development of seminested PCR method for rapid detection of sweepoviruses in Bemisia tabaci

QIN Yanhong，WANG Shuang，TIAN Yuting，QIAO Qi，ZHANG Desheng，

WANG Yongjiang，ZHANG Zhenchen*

（Institute of Plant Protection， Henan Academy of Agricultural Sciences， Henan Key

Laboratory of Crop Pest Control， IPM Key Laboratory in Southern Part of North China

for Ministry of Agricultural and Rural Affairs， Zhengzhou450002， China）

?Abstract

Sweepoviruses are the viruses infecting sweet potato and transmitted by Bemisia tabaci in persistent manner. At least eight viruses had been identified in Chinese sweet potato. Primers were designed based on the conserved regions of genome of eight sweepoviruses from China. The rapid seminested PCR detection technology was established for the detection of sweepoviruses in single whitefly. The seminested PCR had high specificity and sensitivity. With the recombination plasmids of eight sweepoviruses as template， eight viruses could be simultaneously detected. The sensitivity of the seminested PCR was higher than that of conventional PCR by 10 10 000 times. Sweepoviruses could be steadily detected from individual whitefly by using the seminested PCR assay. This assay is of economical， rapid， sensitive， specific and stable for rapid detection of sweepoviruses in B. tabaci.

Key words

sweepoviruses;seminested PCR;detection

甘薯雙生病毒是侵染甘薯的一類重要病毒，近年來在我國甘薯上的危害日趨嚴重。感染該類病毒的甘薯主要表現(xiàn)出葉片上卷、葉脈變黃，葉片變厚等癥狀，一般造成的產(chǎn)量損失為26%～63%[1]，在有些品種上甚至造成86%的產(chǎn)量損失[2- 3]。根據(jù)國際病毒分類委員會最新的第十次分類報告，甘薯雙生病毒包括13個種，我國已報道的有8個種，分別為甘薯曲葉病毒Sweet potato leaf curl virus（SPLCV）、甘薯中國曲葉病毒Sweet potato leaf curl China virus（SPLCCNV）、甘薯加那利曲葉病毒Sweet potato leaf curl Canary virus （SPLCCV）、甘薯喬治亞曲葉病毒Sweet potato leaf curl Georgia virus （SPLCGoV）、甘薯河南曲葉病毒Sweet potato leaf curl Henan virus （SPLCHnV）、甘薯山東曲葉病毒Sweet potato leaf curl Shandong virus （SPLCSdV）、甘薯四川曲葉病毒1 Sweet potato leaf curl Sichuan virus? 1 （SPLCSiV1）、甘薯四川曲葉病毒2 Sweet potato leaf curl Sichuan virus? 2 （SPLCSiV2）[4- 8]。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，侵染甘薯的雙生病毒各個分離物聚成一簇，與侵染其他植物的雙生病毒處于不同的分支，因此甘薯雙生病毒被稱為sweepoviruses[9]。

目前甘薯雙生病毒的檢測技術(shù)研究主要有：環(huán)介導恒溫核酸擴增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）快速檢測甘薯曲葉病毒[10];PCR和滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA）方法對我國20多個省市的甘薯雙生病毒的檢測[11]; 甘薯薯塊中甘薯褪綠矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus（SPCSV）和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測[12];甘薯雙生病毒的實時熒光定量PCR檢測[13]。關于煙粉虱Bemisia tabaci中病毒檢測方法的研究有單頭煙粉虱中SPCSV的半巢式RTPCR檢測方法[14]，單頭煙粉虱中番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）、瓜類褪綠黃化病毒Cucurbit chlorotic yellows virus（CCYV）和木爾坦棉花曲葉病毒Cotton leaf curl Multan virus（CLCuMuV）的LAMP檢測方法[15 -17]等。目前，對煙粉虱中甘薯雙生病毒檢測方法的研究還未見報道，因此，本研究擬建立一種快速、靈敏的檢測方法，用于檢測單頭煙粉虱是否攜帶甘薯雙生病毒，為檢測田間煙粉虱的帶毒率提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1供試材料

無毒煙粉虱為本實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)在‘中煙100’煙草上。 將攜帶甘薯雙生病毒的甘薯植株置于養(yǎng)蟲籠中，取無毒煙粉虱放入養(yǎng)蟲籠中飼養(yǎng)，獲得帶毒煙粉虱。SPLCV、SPLCCNV、SPLCCV、SPLCGoV、SPLCHnV、SPLCSdV、SPLCSiV1、SPLCSiV2和SPCSV（對照）等重組質(zhì)粒為本實驗室保存。

1.2主要試劑及試劑盒

DNA膠回收試劑盒和柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司;2×Premix Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD19T載體和DL2000 Marker購自寶生物工程（大連）有限公司;大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞為本實驗室制備并保存于 70℃冰箱;其他常用生化試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3引物設計與合成

根據(jù)GenBank公布的甘薯雙生病毒保守序列，設計3條引物sweepoviruses380F： 5′TATGGGGGGAGACCGGTAAGACGGAG3′，sweepoviruses1280R：5′GACTGGTATTTTGGAACGCC TTAAATGGC3′，sweepoviruses450F： 5′GTCCCAATTGCTGCCCGAAGCTATGTC3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。sweepoviruses380F和sweepoviruses1280R為半巢式PCR第1輪擴增引物，sweepoviruses450F和sweepoviruses1280R為半巢式PCR第2輪擴增引物。第1輪和第2輪PCR預期擴增片段長度分別為915 bp和846 bp。

1.4半巢式PCR的通用性和特異性檢測

將SPLCV、SPLCCNV、SPLCCV、SPLCGoV、 SPLCHnV、SPLCSdV、SPLCSiV1、SPLCSiV2等8種甘薯雙生病毒和SPCSV重組質(zhì)粒分別稀釋1 000倍，以稀釋的質(zhì)粒為模板，進行第1輪PCR擴增，反應體系為：2×Premix Taq DNA聚合酶10 μL，稀釋的重組質(zhì)粒0.5 μL， sweepoviruses380F（10 μmol/L）和sweepoviruses1280R（10 μmol/L）各0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增條件為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

以第1輪PCR反應產(chǎn)物為模板，進行第2輪PCR擴增，反應體系為： 2×Premix Taq DNA聚合酶10 μL，sweepoviruses450F（10 μmol/L）和sweepovirus1280R（10 μmol/L）各0.5 μL，第1輪反應產(chǎn)物0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。 反應條件為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。確定該方法對8種甘薯雙生病毒檢測的通用性和特異性。

1.5半巢式PCR方法的靈敏度檢測

利用超微量核酸蛋白測定儀測定8種甘薯雙生病毒重組質(zhì)粒的濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)將濃度換算為拷貝數(shù)[18]，將質(zhì)粒用超純水梯度稀釋成10 1～10 10，分別以稀釋后的質(zhì)粒為模板，按照1.4中的體系和反應條件進行PCR和半巢式PCR靈敏性的檢測，比較兩種方法之間的靈敏性差異。

1.6單頭煙粉虱中甘薯雙生病毒的檢測

以帶毒煙粉虱為材料，無毒煙粉虱為陰性對照，利用牙簽將單頭煙粉虱在PCR管中搗碎，加入10 μL ddH2O，12 000 r/min離心1 min，取上清作為模板，分別利用常規(guī)PCR和上述建立的半巢式PCR方法對單頭煙粉虱進行檢測。

1.7田間樣品檢測

從田間表現(xiàn)卷葉癥狀的甘薯植株上采集煙粉虱，利用建立的半巢式PCR對單頭煙粉虱進行檢測，隨機挑選陽性目的條帶，割膠純化并克隆至pMD19T載體上，重組質(zhì)粒由TaKaRa公司完成序列測定，對測序結(jié)果進行BLAST比對分析。

2結(jié)果與分析

2.1半巢式PCR的通用性和特異性檢測

分別以8種甘薯雙生病毒和SPCSV重組質(zhì)粒的1 000倍稀釋液為模板，在相同條件下進行半巢式PCR反應，對半巢式PCR的通用性和特異性進

行檢測。結(jié)果表明，以8種甘薯雙生病毒重組質(zhì)粒為模板的樣品均能擴增出846 bp的目的條帶，而以

SPCSV重組質(zhì)粒為模板的 樣品未擴增出相應目的條帶（圖1），表明建立的方法能同時對8種甘薯雙生病毒進行檢測，通用性和特異性均較好。

2.2半巢式PCR的靈敏度檢測

分別以8種甘薯雙生病毒重組質(zhì)粒的10倍梯度稀釋液為模板，進行半巢式PCR檢測，結(jié)果表明（表1），半巢式PCR對SPLCV、SPLCCNV、SPLCCV、SPLCGoV、SPLCHnV、SPLCSdV、 SPLCSiV1、SPLCSiV2 等8種病毒的最低檢測濃度分別為4.62、5.17、7.57、 12.00、9.84、6.48、10.90、8.81拷貝/μL，常規(guī)PCR對這8種病毒的最低檢測濃度分別為4.62×102、5.17×102、 7.57×102、1.2×103、9.84×10、6.48×104、1.09×102、8.81×102拷貝/μL，說明針對不同的甘薯雙生病毒，建立的半巢式PCR檢測靈敏度比常規(guī)PCR高10～104倍，靈敏度較高。

2.3單頭煙粉虱中甘薯雙生病毒的檢測

分別以帶毒煙粉虱為材料，無毒煙粉虱為對照進行半巢式PCR擴增，對單頭煙粉虱進行24次重復檢測結(jié)果表明，半巢式PCR能穩(wěn)定地從單頭帶毒煙粉虱中擴增出大小為846 bp的目的條帶，常規(guī)PCR方法僅檢測到3次陽性結(jié)果，無毒煙粉虱無相應條帶，說明該方法穩(wěn)定性較好（圖2）。

2.4田間樣品檢測

從田間顯癥甘薯上采集煙粉虱，利用半巢式PCR方法對單頭煙粉虱中攜帶的甘薯雙生病毒進行檢測，對40頭煙粉虱的檢測結(jié)果表明，常規(guī)PCR方法從5頭煙粉虱中檢測出甘薯雙生病毒，檢出率僅為12.5%，半巢式PCR從37頭煙粉虱中檢測到甘薯雙生病毒，其中包括常規(guī)PCR檢測為陽性的5個樣品，檢出率為92.5%。隨機挑選陽性樣品的目的條帶，克隆測序后進行BLAST比對分析，結(jié)果表明，所獲得的序列與已報道的SPLCSiV2的Henan742017分離物（GenBank登錄號為MK931317）序列一致性達99.04%，說明該方法擴增出的目的片段為甘薯雙生病毒的特異性片段，表明該方法可應用于田間樣品的檢測。

3討論

甘薯雙生病毒是對侵染甘薯的菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus病毒的總稱，為甘薯上發(fā)生頻率較高的一大類病毒，2006年首次在中國大陸出現(xiàn)[4]，隨后逐漸蔓延，目前在我國南方、北方和長江中下游等甘薯主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[11， 19]。甘薯雙生病毒的傳毒介體為煙粉虱，以持久方式進行傳播，由于煙粉虱個體小，繁殖能力強，擴散迅速，生產(chǎn)上難以根除，已成為引起甘薯雙生病毒快速擴散和流行的重要原因。許多植物雙生病毒的流行和暴發(fā)與煙粉虱的帶毒率和種群數(shù)量密切相關[20 -21]，由于煙粉虱在植物病毒的傳播和流行中起到關鍵作用，要明確田間煙粉虱的帶毒率，進而明確煙粉虱種群動態(tài)對甘薯雙生病毒發(fā)生流行的影響，需要對大量單頭煙粉虱攜帶甘薯雙生病毒的情況進行檢測。因此，建立針對煙粉虱中甘薯雙生病毒快速、準確的檢測方法尤為重要。本研究建立了一種用于檢測單頭煙粉虱中甘薯雙生病毒的半巢式PCR快速檢測方法，該方法可對我國現(xiàn)存的8種甘薯雙生病毒進行檢測，與常規(guī)PCR檢測方法相比，該方法不用提取煙粉虱的DNA，大大降低了檢測成本，節(jié)省了時間，且靈敏度高于普通PCR，結(jié)果穩(wěn)定可靠。與之前建立的煙粉虱中其他雙生病毒檢測方法相比[15， 17]，本研究建立的檢測方法具有經(jīng)濟、準確、靈敏度高、特異性好等特點。本研究建立的方法可應用于田間煙粉虱樣品的檢測，具有較高的應用價值，將為煙粉虱田間帶毒率的檢測提供技術(shù)支撐，對甘薯雙生病毒的流行規(guī)律和預測預報等研究具有重要意義。

參考文獻

[1]ZHANG Shuocheng， LING Kaishu. Genetic diversity of sweet potato begomoviruses in the United States and identification of a natural recombinant between Sweet potato leaf curl virus and Sweet potato leaf curl Georgia virus [J]. Archive of Virology， 2011， 156 （6）： 955 -968.

[2]LING Kaishu， JACKSON D M， HARRISON H， et al. Field evaluation of yield effects on the U.S.A. heirloom sweetpotato cultivars infected by Sweet potato leaf curl virus [J]. Crop Protection， 2010， 29 （7）： 757 -765.

[3]GIBSON R W， KREUZE J K. Degeneration in sweetpotato due to viruses， viruscleaned planting material and reversion： a review [J]. Plant Pathology， 2015， 64 （1）： 1 -15.

[4]LUAN Yushi， ZHANG Juan， AN Lijia. First report of Sweet potato leaf curl virus in China [J]. Plant Disease， 2006， 90 （8）： 1111.

[5]LIU Qili， ZHANG Zhenchen， LI Jianqiang， et al. Complete genome sequence of a novel monopartite begomovirus infecting sweet potato in China [J]. Archive of Virology， 2014， 159 （6）： 1537 -1540.

[6]LIU Qili， ZHANG Zhenchen， QIAO Qi， et al. Complete genome sequence of a novel monopartite begomovirus infecting sweet potato in China [J]. Virus Genes， 2013， 47 （3）： 591- 594.

[7]QIN Yanhong， ZHANG Zhenchen， QIAO Qi， et al. First report of Sweet potato leaf curl Georgia virus on sweet potato in China [J]. Plant Disease， 2013， 97 （10）： 1388 -1389.

[8]LIU Qili， WANG Yongjiang， ZHANG Zhenchen， et al. Diversity of sweepoviruses infecting sweet potato in China [J]. Plant Disease， 2017， 101 （12）： 1 -6.

[9]ZERBINI F M， BRIDDON R W， IDRIS A， et al. ICTV virus taxonomy profile： Geminiviridae [J]. Journal of General Virology， 2017， 98 （2）： 131- 133.

[10]? 李華偉， 劉中華， 張鴻， 等. 甘薯卷葉病毒LAMP快速檢測技術(shù)的建立及應用[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報， 2019， 27（6）： 1133- 1140.

[11] 劉起麗. 中國甘薯雙生病毒種類鑒定、分子變異及檢測方法研究[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)大學， 2015.

[12] 王爽， 田雨婷， 喬奇， 等. 侵染甘薯的菜豆金色花葉病毒屬病毒和甘薯褪綠矮化病毒多重PCR 檢測方法的建立與應用[J]. 植物保護學報， 2018， 45（6）： 1427 -1428.

[13] 田雨婷， 趙曉立， 喬奇， 等. 甘薯雙生病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用[J].江蘇師范大學學報（自然科學版）， 2019， 37（3）： 35 -39.

[14]? 張盼， 宋國華， 喬奇， 等. 煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）的快速檢測技術(shù)[J]. 植物保護， 2012， 38（5）： 84- 87.

[15] 周濤， 梁彥， 師迎春， 等. 檢測單頭煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的試劑盒： CN201210274394.0 [P]. 2012 11- 14.

[16] 梁相志， 施艷， 李靜靜， 等. 利用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）檢測煙粉虱體內(nèi)的瓜類褪綠黃化病毒（CCYV）[J]. 華中昆蟲研究， 2012， 8： 372.

[17] 陳婷， 齊國君， 趙蕊， 等. 煙粉虱體內(nèi)木爾坦棉花曲葉病毒的LAMP快速檢測技術(shù)[J]. 環(huán)境昆蟲學報， 2016， 38（3）： 565- 571.

[18]? UMESAKI Y， SETOYAMA H. Structure of the intestinal flora responsible for development of the gut immune system in a rodent model [J]. Microbes and Infection， 2000， 2（11）： 1343- 1351.

[19] MA Siqi， ZHENG Qiufeng， YE Jiajie， et al. Identification of viruses infecting sweet potato in southern China by small RNA deep sequencing and PCR detection [J]. Journal of General Plant Pathology， 2019， 85 （2）： 122- 127.

[20] 李英梅， 白青， 王周平， 等. 煙粉虱與番茄黃化曲葉病毒病發(fā)生關系研究[J]. 中國農(nóng)學通報， 2019， 35（4）： 102- 107.

[21] 褚棟， 張友軍. 近10年我國煙粉虱發(fā)生為害及防治研究進展[J]. 植物保護， 2018， 44（5）： 51- 55.

收稿日期：2020- 10 -09修訂日期：2020- 12 -25

基金項目：

國家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-10-B13）

* 通信作者

Email：zhangzhenchen@126.com