一株防病促生細(xì)菌HPS-211菌株的分離與初步鑒定

黃 薇，謝媛圓，金利容，周劍雄，熊又升，曾祥國

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，a.植保土肥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室/農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點實驗室；b.經(jīng)濟作物研究所，武漢 430064）

草莓屬多年生草本植物，可鮮食，營養(yǎng)價值高，風(fēng)味好，能制成多種草莓深加工產(chǎn)品，如果醬、果干等，深受廣大消費者的喜愛［1］。中國的草莓產(chǎn)業(yè)在過去十年間發(fā)展迅速，根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）最新統(tǒng)計，2020年中國草莓種植面積為12.72萬hm2，在世界草莓種植面積中占比最高。中國草莓種植主要采用一年一栽的連作模式，導(dǎo)致生產(chǎn)上連作障礙嚴(yán)重，帶來極大的損失，如草莓苗的萎蔫、倒伏或是草莓不掛果，嚴(yán)重時甚至?xí)斐烧麎潘烂?，目前主要依靠土壤熏蒸和化學(xué)防治等多手段進行田間管理［2］。土壤環(huán)境的連作障礙、草莓苗的病蟲害發(fā)生較重以及農(nóng)藥的使用量過多等問題，極大地影響了草莓的品質(zhì)和鮮食安全［3］，草莓灰霉病就是其中的重要影響因素之一。草莓灰霉病對草莓生長和采摘前后都存在較大危害，其病原物為灰葡萄孢（Botrytiscinerea）［4］，以菌絲體、分生孢子隨病殘體或以菌核形式在土壤內(nèi)越冬，翌年通過氣流、澆水或農(nóng)事活動等途徑傳播［5］，分生孢子在溫度0～35℃，相對濕度81%以上均可萌發(fā)［6，7］，且無抗病品種，導(dǎo)致該病害易發(fā)難防。

植物病害的發(fā)生不僅與病原、環(huán)境有關(guān)，亦與植物自身狀態(tài)密切相關(guān)，植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）作為一類可定殖于植物根際系統(tǒng)并能促進植物生長的細(xì)菌，其通過促進植物生長來提高植物抗逆性的報道較為常見［8］，其種類繁多，不僅對植物有顯著促生長作用，對抑制土傳病害的發(fā)生、增強植物抗逆脅迫能力、改善土壤生態(tài)環(huán)境等方面也有重要作用［9-11］。周貝貝［12］在草莓根際篩選中得到4株P(guān)GPR菌株，具有產(chǎn)蛋白酶、解磷和拮抗病原菌的能力。防病和促生作用是生防菌株應(yīng)用于生產(chǎn)實踐必備的兩個功能，也是用于篩選拮抗菌株的重要指標(biāo)，本試驗希望篩選具備促生和拮抗真菌功能的PGPR菌株，擬以梯度稀釋法從草莓連作和休耕土壤中分離得到可培養(yǎng)的細(xì)菌單菌落，通過與真菌對峙共培養(yǎng)篩選，了解其對真菌的拮抗作用并對其進行效果評價，應(yīng)用于盆栽試驗，驗證其促生效果并進行分子鑒定，為新型微生物農(nóng)藥的研制和應(yīng)用提供更多資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌：小麥赤霉病菌（Fusariumgraminearum）HB-11、灰 霉 病 菌（Botrytiscinerea）B05.10、黃連炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）H8-20、稻曲病菌（Ustilaginoideavirens）QJ-1由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物病理團隊和水稻團隊提供；棉花黃萎病菌（VerticilliumdahilaeKieb.）V991、棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporium）均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物病理實驗室分離和保存。

蔬菜品種：番茄、辣椒、茄子種子均購于農(nóng)資公司。培育蔬菜所用的基質(zhì)土為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研發(fā)的育苗專用基質(zhì)土。草莓品種為紅顏，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所韓永超課題惠贈。

供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）及相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。苯丙氨酸解氨酶（PAL）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、過氧化氫（H2O2）試劑盒和葉綠素含量測定試劑盒來自于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 草莓拮抗真菌菌株的分離純化 采用五點取樣法，2021年從武漢市黃陂區(qū)禾盛吉農(nóng)場采回8年連作不結(jié)果和休耕2年的草莓田土樣，取根際周邊10 cm、深度約10 cm的土樣以及草莓灰霉菌典型發(fā)病株若干份，分別裝在采樣袋中帶回實驗室，備用。

根際細(xì)菌的分離：取10 g根際土，加入90 mL無菌水懸浮液，25℃、180 r/min振蕩10 min，獲得10-1稀釋液，依次梯度稀釋，取0.1 mL的10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液涂布于NA平板，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后挑取顏色、光澤、邊緣光滑度和厚度不同的單菌落于新的NA平板上進行劃線培養(yǎng)，對所得菌株編號并斜面保存，備用［13］。

1.2.2 分離細(xì)菌對植物病原真菌的拮抗活性的初篩 采用平板對峙法［14］，將病原菌菌餅接種至PDA平板中央，在平板四面距平板中央各2.5 cm的地方平行劃線接種待測分離細(xì)菌菌株，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個處理3次重復(fù)，2 d后檢查各菌株的抑菌效果。

1.2.3 分離細(xì)菌對草莓灰霉菌拮抗活性的復(fù)篩 將初篩的菌株分別接種于NA中，于28℃、130 r/min的搖床上培養(yǎng)48 h。在PDA平板中央接種培養(yǎng)72 h的灰霉菌菌餅（直徑5 mm），用無菌的打孔器在距離中央2 cm處三點對稱打孔，每孔中分別注入0.1 mL待測菌株的菌液，以接種等體積的NB為對照，每個處理3次重復(fù)，平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照平板中灰霉菌菌絲即將長滿全皿時，測量各處理組的抑菌帶大小。

1.2.4 細(xì)菌HPS-211抑菌譜的測定 參照J(rèn)eong等［15］的方法并稍作改進，制備細(xì)菌HPS-211發(fā)酵3 d的無菌濾液，將無菌濾液混入冷卻至55℃左右的PDA培養(yǎng)基中，使其終濃度為10%，倒成平板。以混入相同體積的NA為對照。在PDA平板中央接入待測病原菌菌餅，28℃倒置培養(yǎng)。每處理4次重復(fù)。待對照組菌絲幾乎長滿培養(yǎng)皿時，采用十字交叉法，測量各組的病原菌菌落直徑，計算相對抑制率［16］。

1.2.5 HPS-211對3種植株生理及生長指標(biāo)的測定 番茄、辣椒、茄子的種植采用常規(guī)管理方法，生防菌液的制備同“1.2.4”。以接種等體積的NA為對照，每處理12株植株，3次重復(fù)。將植株放在（25±2）℃溫室中培養(yǎng)，光照∶黑暗=14 h∶10 h，30 d后，通過測定植物的株高、根重、生物量（鮮質(zhì)量和干質(zhì)量）以及含水量，分析接種細(xì)菌對植物生理生長的影響。取植物第三片真葉，采用PAL、葉綠素、丙二醛、過氧化氫酶試劑盒分別測定葉片中的苯丙氨酸解氨酶含量、葉綠素含量、丙二醛含量和過氧化氫酶的含量。

1.2.6 細(xì)菌對草莓灰霉病的影響 待草莓苗長至4～5片真葉后，將其從基質(zhì)移栽至塑料盆里。設(shè)置4個處理：①病原菌B05.10+提前3 d接種細(xì)菌；②病原菌B05.10+同時接種細(xì)菌；③病原菌B05.10+NA；④清水對照?；颐共≡鶥05.10接種到PDB中，28℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，經(jīng)4層紗布過濾得到1×108CFU/mL的孢子懸浮液，對草莓植株頂葉噴施孢子懸浮液。

制備HPS-211懸浮液（2×108CFU/mL），接種時對草莓幼苗進行灌根，每株接種20 mL。以接種等體積的NA為對照，每個處理22株草莓苗，3次重復(fù)。草莓植株均置于（25±2）℃溫室中培養(yǎng)，光照：黑暗=14 h∶10 h。接種病原菌B05.10后，從接種后15 d開始調(diào)查草莓植株的發(fā)病嚴(yán)重度，并計算相應(yīng)的病情指數(shù)。

1.2.7 細(xì)菌的分子鑒定 參照沈萍等［17］的方法，對細(xì)菌進行革蘭氏染色。使用OMEGA細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌的總DNA，采用16SrDNA基因通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進 行PCR擴增。反應(yīng)體系：PCR preMix 12.5μL、正引物1.0μL、反引物1.0μL、DNA 2.0μL和ddH2O 8.5μL；擴增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s、58℃退火90 s、72℃延伸60 s，變性、退火和延伸循環(huán)35次；72℃繼續(xù)延伸10 min；4℃保存。取少量PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。所得序列在NCBI的GenBank中進行比對分析，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件進行Duncan’s多重比較，檢驗組間差異顯著性，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓灰霉病拮抗真菌的分離和初篩

由表1可知，從草莓8年連作和休耕土樣中分離得到了465株細(xì)菌，經(jīng)平板對峙初篩，得到若干株可拮抗赤霉菌或灰霉菌的細(xì)菌，其中5株在平皿上可以同時拮抗赤霉菌和灰霉菌，可以進一步對其拮抗活性進行研究。

2.2 草莓拮抗菌株的復(fù)篩

拮抗活性復(fù)篩（表2）發(fā)現(xiàn)，抑菌帶寬超過5 mm的菌株共有9株，其中細(xì)菌HPS-211和HPS-32對灰霉病菌B05.10的抑制活性最強，形成的抑菌帶寬達10 mm左右，且對赤霉菌HB1-1的抑制活性也較強，本試驗選擇HPS-211作為后續(xù)研究菌株。

表2 拮抗細(xì)菌的復(fù)篩

2.3 抑菌譜的測定

由表3可以看出，HPS-211的無菌濾液在10%濃度下對6種供試病原菌有不同程度的抑制作用，其中，對赤霉菌HB-11抑制活性較弱，而對其他5種真菌生長的抑制率為29.47%～57.50%，對大麗輪枝菌的抑制率最高。細(xì)菌發(fā)酵液對小麥赤霉菌HB-11的抑制率最低，為6.06%，其次為黃連炭疽菌ES-3、灰霉菌B05.10、棉花枯萎菌S3-8和稻曲菌QJ-1，細(xì)菌發(fā)酵液對棉花黃萎病菌V991的抑制率達57.50%。細(xì)菌發(fā)酵液對6種真菌菌落生長組間存在極顯著差異。

表3 10%濃度的HPS-211發(fā)酵液對真菌的影響

2.4 細(xì)菌對真菌的拮抗作用

如圖1所示，細(xì)菌HPS-211對小麥赤霉菌HB-11的生長基本無影響，菌落和氣生菌絲的生長均無抑制作用；對灰霉菌B05.10有一定的抑制作用，但隨著培養(yǎng)時間的延長，對菌落生長的抑制作用逐漸減弱；對棉花黃萎病菌、黃連炭疽菌、棉花枯萎病菌和稻曲菌的菌落生長可產(chǎn)生較為明顯的抑制，且可持續(xù)一段時間。其中，對棉花黃萎病菌的抑制效果最為明顯。

圖1 細(xì)菌HPS-211對6種真菌的拮抗作用

2.5 細(xì)菌對植物生理及生長指標(biāo)的影響

由表4可知，接種細(xì)菌HPS-211 30 d后，對3種植物的生理指標(biāo)均產(chǎn)生了一定的影響。與對照相比，3種植物葉片中的葉綠素含量均有提高，但差異不顯著；苯丙氨酸解氨酶含量在3種植物中均有所下降，番茄和茄子中的苯丙氨酸解氨酶含量均顯著低于對照，且以番茄葉片中的苯丙氨酸解氨酶含量下降幅度最大；接種細(xì)菌HPS-211對番茄的株高和單株鮮重有促進作用，平均分別提高了14.5%和26.9%，但對辣椒的株高無顯著影響，且鮮重略有下降，對茄子株高和鮮重的影響均不顯著。

表4 接種細(xì)菌HPS-211 30 d后對3種植物生理及生長指標(biāo)的影響

2.6 細(xì)菌對草莓灰霉病的影響

由表5可知，接種細(xì)菌HPS-211和灰霉病菌的草莓苗與僅接種灰霉菌的草莓苗相比，在病情指數(shù)上都存在顯著性差異，且差異均達極顯著水平。接種15 d后的病情指數(shù)已出現(xiàn)顯著性差異，接種25 d后僅接種灰霉菌草莓苗的病情指數(shù)是接種細(xì)菌HPS-211和灰霉菌處理的2倍多。根據(jù)調(diào)查結(jié)果，推測接種期間細(xì)菌HPS-211對草莓植株的影響能持續(xù)發(fā)揮作用。

表5 接種25 d內(nèi)菌株HPS-211對草莓灰霉病病情指數(shù)的影響

2.7 細(xì)菌HPS-211對草莓生長的影響

如圖2所示，與清水對照相比，草莓植株在接種細(xì)菌HPS-211后，能正常開花、結(jié)果，表明接種細(xì)菌HPS-211并不影響草莓的掛果，且草莓植株的株高、葉色、葉面積等指標(biāo)還出現(xiàn)較大的改觀。接種細(xì)菌HPS-211 25 d后，噴施灰霉菌孢子懸浮液且同時接種細(xì)菌HPS-211的草莓植株平均株高為28.4 cm，葉綠素含量平均為2.82 mg/g；清水對照草莓植株平均株高約為24.7 cm，葉綠素含量平均為2.63 mg/g，噴施B05.10+HPS-211處理的株高和葉綠素含量均極顯著高于清水對照（表6）。而未接種細(xì)菌HPS-211的草莓葉片呈深綠色，植株葉片的成熟度更高，老化程度高于接種細(xì)菌HPS-211的植株。

表6 草莓植株的株高和葉綠素含量

圖2 噴施接種灰霉菌孢子液和清水對照的草莓植株

2.8 HPS-211的分子鑒定

HPS-211菌株的菌落為淡黃色，表面平整干燥，呈半透明狀態(tài)，邊緣規(guī)則，菌落略有異味。經(jīng)革蘭氏染色判斷其為革蘭氏陰性菌，為桿菌，經(jīng)芽孢和鞭毛染色鏡檢后，發(fā)現(xiàn)有鞭毛結(jié)構(gòu)，但無芽孢。通用性引物27F/1492R經(jīng)基因擴增后發(fā)現(xiàn)，HPS-211菌株的16SrDNA序列長度為1 423 bp，經(jīng)Blast分析表明，其與偶氮假單胞菌（Pseudomonasazotoformansstrain，KGGI16）的16SrDNA序列具有99%的相似度。系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3）顯示，菌株HPS-211與偶氮假單胞在同一分支上，將該菌株初步鑒定為偶氮假單胞菌。

圖3 細(xì)菌HPS-211的系統(tǒng)進化樹

3 小結(jié)與討論

3.1 細(xì)菌HPS-211的生物學(xué)特性和抑菌效果

細(xì)菌HPS-211為革蘭氏陰性桿菌，其菌落為淡黃色，表面干燥呈半透明狀態(tài)，邊緣規(guī)則，菌落略有異味。經(jīng)染色鏡檢后，發(fā)現(xiàn)有鞭毛，無芽孢。細(xì)菌HPS-211對赤霉菌的抑制作用不明顯，但對灰霉菌存在一定的抑制作用，對峙試驗中菌液可對真菌形成明顯的抑菌圈，且細(xì)菌發(fā)酵液對灰霉菌的生長抑制率為29.47%，對6種真菌，除赤霉菌外，均存在一定的抑制效果，對棉花黃萎病菌的生長抑制作用最強。由于稻曲菌和黃萎病菌屬于生長較緩慢的真菌，可能易受到外界環(huán)境的擾動，而對赤霉菌和灰霉菌這類生長速度較快的真菌影響效果則不顯著，隨著培養(yǎng)時間的延長，氣生菌絲仍會覆蓋到接種細(xì)菌的平皿部位。

3.2 HPS-211菌株對番茄葉片中多種酶類的影響

HPS-211菌株對番茄的生理影響最為顯著，處理后番茄葉片中的苯丙氨酸解氨酶、過氧化氫酶、丙二醛含量均低于對照，其中，苯丙氨酸解氨酶含量極顯著低于對照，而葉綠素含量高于對照，但差異不顯著。苯丙氨酸解氨酶是一類與植物抗逆性相關(guān)的酶類，它的活性與木質(zhì)素、花青素、類黃酮等次生代謝物質(zhì)的積累呈顯著性正相關(guān)［18］。本研究表明，細(xì)菌HPS-211能顯著提高番茄的株高，且極顯著提高番茄的鮮重，是否能提高番茄的抗逆性還有待進一步的研究。

植物在正常狀態(tài)下，植物中活性氧的產(chǎn)生和清除過程呈平衡狀態(tài)，當(dāng)受到蟲害或是機械損傷時，體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)平衡會受影響，細(xì)胞膜脂結(jié)構(gòu)遭到破壞。MDA含量是植物細(xì)胞膜脂過氧化的一個重要指標(biāo)，MDA含量的大量增加，表明體內(nèi)細(xì)胞受到較嚴(yán)重的破壞［19］。梁鄲娜等［20］發(fā)現(xiàn)蚜蟲侵染黃瓜后，抗感品系葉片中MDA含量均有上升。接種細(xì)菌HPS-211 30 d后，番茄葉片中的MDA與對照相比有所降低，但二者之間差異未達顯著性水平，表明接種細(xì)菌HPS-211后并未對植物細(xì)胞膜脂結(jié)構(gòu)造成明顯的干擾。在正常狀態(tài)下，植物中H2O2的產(chǎn)生和清除過程呈平衡狀態(tài)，H2O2含量與植物的抗病防御反應(yīng)密切相關(guān)［21］。過氧化氫酶可催化過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水，降低H2O2對植物體產(chǎn)生的傷害，是生物體防御反應(yīng)體系的重要酶類之一。在一定程度內(nèi)，H2O2含量越高，過氧化氫酶的分解速度越快。接種細(xì)菌HPS-211后降低了番茄葉片中過氧化氫酶的含量，表明接種細(xì)菌HPS-211可能并不會誘發(fā)番茄的抗病防御。

3.3 細(xì)菌HPS-211對幾種植物的促生效果

促生菌可以通過直接機制，如產(chǎn)生植物生長素或是促進養(yǎng)分的吸收和利用，或通過間接機制，如影響酶活性，促進營養(yǎng)競爭和產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等，進而促進植物的生長［22］。通過接種HPS-211菌株到番茄、辣椒、茄子和草莓上，發(fā)現(xiàn)與對照相比，其對番茄和草莓植株的株高、葉色、葉面積和根系均有較顯著的促進作用，株高更高，葉色更加鮮嫩翠綠，葉面也更寬大。對辣椒的促生作用不顯著，但提高了辣椒葉片的葉綠素含量，葉色更加有光澤，接種HPS-211可能提高了辣椒葉片的光合效率，促進光合作用。但接種細(xì)菌HPS-211對茄子的促生作用不明顯。

葉綠素是植物進行光合作用的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是反映植物光合能力和健康狀態(tài)的重要指標(biāo)，對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有顯著影響［23］，有研究表明在病原菌的脅迫下，植物的葉綠素含量與植物抗性呈正相關(guān)［24］。與清水對照相比，草莓在接種細(xì)菌HPS-211后，也能正常開花、結(jié)果，表明接種細(xì)菌HPS-211不影響草莓的掛果。對照草莓植株葉片的成熟度更高，老化程度高于接種細(xì)菌HPS-211的植株。細(xì)菌HPS-211對其他植物是否也存在類似的促生作用，還有待進一步的研究來證實。