西瓜種子EMS誘變技術(shù)

申賽亞，曾紅霞，任 儉，柴姍姍，孫玉宏，張 娜

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，武漢 430345；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢 430070；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018）

西瓜（CitrulluslanatusL.）作為世界性的園藝作物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值十分豐富，受到人們廣泛喜愛。但其自身抵抗生物脅迫和非生物脅迫能力脆弱，很大程度上制約了品質(zhì)和產(chǎn)量的提高［1］。且育種學(xué)家長(zhǎng)期帶有偏好性的選育造成一些性狀丟失使得西瓜多樣化育種進(jìn)展緩慢，難以實(shí)現(xiàn)育種效率的突破，而借助誘變技術(shù)創(chuàng)建飽滿突變體庫可為西瓜育種提供嶄新的種質(zhì)資源，推動(dòng)種質(zhì)創(chuàng)新，有效打破當(dāng)前西瓜育種工作所面臨的現(xiàn)狀［1，2］。

誘變技術(shù)包括物理誘變［3］、化學(xué)誘變［4-6］、生物誘變和空間誘變［5］等。其中，化學(xué)誘變技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、誘變劑量容易控制且對(duì)基因組損傷小、突變頻率高、突變范圍廣、時(shí)間周期短的特點(diǎn)，在多種作物中均有應(yīng)用［7-15］，已成為近年來運(yùn)用最為廣泛的誘變技術(shù)，產(chǎn)生了較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益［16-18］。甲基磺酸乙酯（EMS）是應(yīng)用最多、效果最為明顯的化學(xué)誘變劑［2，15，19-22］，具有高效穩(wěn)定、易點(diǎn)突變、染色體畸變頻率低、誘變效果好及可針對(duì)性改良某種特殊性狀等優(yōu)勢(shì)，在多種作物中均有應(yīng)用，如水稻［23-25］、玉米［26］、白菜［27］、茄子［28］、甜瓜［29］、番茄［30，31］等。經(jīng)過EMS誘導(dǎo)后的突變體庫對(duì)于功能基因研究具有重要意義［7，32，33］。種子作為最常見的誘變材料具有操作簡(jiǎn)便、對(duì)操作環(huán)境要求不高、無需無菌操作、工作量小并在誘變后變異性狀經(jīng)幾代積累后可長(zhǎng)期穩(wěn)定遺傳的優(yōu)點(diǎn)，便于大批量誘變研究［15，21，34］。相比于其他作物，西瓜利用EMS構(gòu)建突變體庫起步較晚，2015年朱娜娜［1］研究發(fā)現(xiàn)1.0%濃度下誘導(dǎo)9 h為西瓜W1-17種子的最佳誘變條件，之后通過觀察M1代、M2代的農(nóng)藝性狀，構(gòu)建出具有48種變異類型的突變體庫。明確EMS最佳處理?xiàng)l件是進(jìn)行誘變育種研究的關(guān)鍵，公認(rèn)的最佳誘變劑量是經(jīng)誘變處理后植株存活50%的半致死劑量，可在保證產(chǎn)生較大變異的基礎(chǔ)上不過大損傷誘變材料從而達(dá)到良好的誘變效果［35］，并且研究表明誘變濃度、誘變時(shí)間及誘變材料等因素對(duì)誘變效率均會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響［12，35-38］。

本研究以武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院西甜瓜研究室供給的高代自交西瓜‘97103’為研究對(duì)象，利用EMS對(duì)其種子進(jìn)行誘變處理，分析其西瓜發(fā)芽率、成苗率，進(jìn)而獲得西瓜種子誘變的適宜處理組合，為西瓜種質(zhì)資源的創(chuàng)新提供種質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為高代自交的西瓜‘97103’種子，由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院西甜瓜研究室供給。該西瓜品種特點(diǎn)有花皮、中果、果肉紅、肉質(zhì)酥脆，適應(yīng)性強(qiáng)。

EMS試劑購自Sigma公司，為無色溶液，微溶于水。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 用KH2PO4和K2HPO4·3H2O配制成pH為7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖溶液后，將EMS誘變劑稀釋成不同濃度，Na2S2O3為誘變終止劑和解毒劑。

1.2.2 EMS誘變處理 試驗(yàn)共設(shè)置18個(gè)誘變處理組合，每處理50粒種子，3次重復(fù)。在通風(fēng)櫥中使用25 mL EMS試劑浸種，共設(shè)置6個(gè)EMS濃度梯度（0%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%），以磷酸緩沖液浸泡種子作為對(duì)照，標(biāo)記為0，將各組種子分別置于28℃、90 r/min搖床上避光振蕩誘導(dǎo)4、8、12 h。誘變完成后倒掉誘變劑，用Na2S2O3溶液進(jìn)行解毒處理：加入配制好的25 mL 1 mol/L Na2S2O3溶液，混勻后棄去；然后加入25 mL 100 mmol/L的Na2S2O3溶液，混勻5 min后棄去溶液，再用100 mmol/L Na2S2O3溶液沖洗種子3遍；注入25 mL去離子水混勻5 min后，棄去溶液，去離子水反復(fù)沖洗種子3次；最后用流水沖洗種子2 h后進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)。

結(jié)合發(fā)芽、成苗的半致死率來確定最佳誘變組合。

1.2.3 催芽方法和發(fā)芽率測(cè)定 采用培養(yǎng)皿濾紙法進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，將誘導(dǎo)后的種子置于有吸水紙的培養(yǎng)皿中，微微潤(rùn)濕，種子上附一層遮光紙，28℃的恒溫箱催芽，觀察記錄發(fā)芽情況。當(dāng)種子露白2 mm時(shí)記作發(fā)芽，共計(jì)催芽7 d（當(dāng)天發(fā)芽的種子需當(dāng)天播種），每天統(tǒng)計(jì)各處理發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率。

發(fā)芽率=（種子總發(fā)芽數(shù)量/供試種子數(shù)量）×100% （1）

1.2.4 出苗率和成苗率的測(cè)定 播種于70孔的育苗穴盤中，每天早上觀察記錄種子出苗情況。子葉露出土層1.5 cm記作萌發(fā)，兩葉一心作為成苗依據(jù)，于30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理成苗數(shù)，計(jì)算成苗率。

成苗率=（成活苗總數(shù)/供試種子數(shù)）×100%（2）

本試驗(yàn)將經(jīng)過最佳誘變處理后的種子長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)進(jìn)行定植，觀察記錄西瓜植株的全生育期性狀，2021年5月進(jìn)行自花授粉，6月單瓜收種。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Excel、Origin 2019 b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同EMS誘變處理對(duì)西瓜種子發(fā)芽率的影響

由圖1、表1可知，1.5%和2.0%濃度處理下的發(fā)芽率變動(dòng)幅度較小，而當(dāng)EMS誘導(dǎo)濃度超過3.0%時(shí)，發(fā)芽率下降趨勢(shì)增強(qiáng)。5.0%濃度處理4 h的發(fā)芽率為90%，相較于0濃度處理下的4 h發(fā)芽率降低了10.00個(gè)百分點(diǎn)；而相同5.0%濃度處理12 h的發(fā)芽率僅51.33%，相較于4 h的5.0%濃度降低了38.67個(gè)百分點(diǎn)，相較于0濃度下處理4 h的發(fā)芽率降低了48.67個(gè)百分點(diǎn)。說明誘變時(shí)間越長(zhǎng)發(fā)芽抑制效果越明顯。

圖1 EMS不同濃度對(duì)西瓜‘97103’種子發(fā)芽率的影響

由圖2和表1可知，在一定范圍內(nèi)，隨著處理濃度的增大，西瓜種子發(fā)芽率下降趨勢(shì)明顯。其中，不同誘變濃度誘導(dǎo)4 h，整體發(fā)芽率下降幅度較小，5.0%濃度處理下的發(fā)芽率較0濃度處理降低了10.00個(gè)百分點(diǎn)；而當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間超過8 h時(shí)，不同誘導(dǎo)濃度處理下發(fā)芽率下降較快，其中，1.5%濃度處理8 h時(shí)發(fā)芽率為99.33%，而5.0%濃度處理8 h發(fā)芽率下降至60.67%，較處理4 h降低了29.33個(gè)百分點(diǎn)，相較于0濃度處理8 h降低了38.66個(gè)百分點(diǎn)。表明在一定范圍內(nèi)，隨著EMS處理濃度的增大，西瓜種子發(fā)芽所受的制約作用增強(qiáng)。

表1 不同EMS處理對(duì)西瓜種子‘97103’發(fā)芽率的影響（單位：%）

圖2 不同EMS誘變時(shí)間對(duì)西瓜‘97103’種子發(fā)芽率的影響

綜上可知，隨著EMS誘變處理時(shí)間的延長(zhǎng)，誘變濃度的增大，西瓜種子發(fā)芽率下降趨勢(shì)明顯。誘變濃度愈大及誘變時(shí)間愈長(zhǎng)，對(duì)西瓜種子發(fā)芽抑制作用越強(qiáng)。

2.2 不同EMS誘變處理對(duì)西瓜種子成苗率的影響

由表2可知，當(dāng)誘變時(shí)間為12 h時(shí)，誘變濃度5.0%的成苗率相較于1.5%濃度顯著降低49.33個(gè)百分點(diǎn)。隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，EMS誘變對(duì)西瓜種子成苗的抑制效果更加明顯。在5.0%誘變濃度下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間從4 h增至12 h，西瓜種子成苗率降低了45.33個(gè)百分點(diǎn)。

由圖3和表2可知，1.5%和2.0%濃度處理下的成苗率變動(dòng)幅度較小，而當(dāng)EMS誘變濃度達(dá)到或超過3.0%時(shí)，成苗率下降趨勢(shì)明顯。5.0%濃度處理8 h成苗率為53.33%，接近半致死數(shù)，而當(dāng)相同處理濃度下處理12 h成苗率跌至40.67%，遠(yuǎn)超出半致死數(shù)。說明在一定濃度范圍內(nèi)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，EMS誘變對(duì)西瓜種子成苗的抑制作用增強(qiáng)。

圖3 不同EMS誘變時(shí)間對(duì)西瓜‘97103’種子成苗率的影響

由圖4和表2可知，不同誘變濃度誘變4 h，整體成苗率下降較緩，5.0%濃度處理下的成苗率較對(duì)照僅降低了13.33個(gè)百分點(diǎn)。而當(dāng)誘變時(shí)間超過8 h時(shí)，不同誘導(dǎo)濃度下成苗率下降較快，其中，2.0%濃度下處理12 h成苗率為88.00%，而5.0%濃度處理下成苗率下降至40.67%，降低了47.33個(gè)百分點(diǎn)。可見，在一定范圍內(nèi)，隨著處理濃度的增大，EMS誘變對(duì)西瓜種子成苗的抑制作用增強(qiáng)。

圖4 不同EMS誘變濃度對(duì)西瓜‘97103’種子成苗率的影響

表2 不同EMS處理對(duì)西瓜種子‘97103’成苗率的影響（單位：%）

綜上所述，隨著EMS誘變濃度的增大，處理時(shí)間的延長(zhǎng)，西瓜種子成苗率呈下降趨勢(shì)。EMS誘變濃度愈大及誘變時(shí)間愈長(zhǎng)，對(duì)西瓜種子成苗的抑制作用越強(qiáng)。

3 小結(jié)

EMS作為主流的化學(xué)誘變劑，具有誘變頻率高、誘變效率好、誘變范圍廣、易產(chǎn)生點(diǎn)突變、染色體畸變少等特點(diǎn)，較常見的誘變材料有種子［32］、花粉［26，39］、葉片［40，41］、莖段［16，42］、愈傷組織［20］、叢生芽［43］等。種子具有其他材料不可比擬的優(yōu)勢(shì)：第一，其操作簡(jiǎn)便、無需大型儀器［21］；第二，相對(duì)于運(yùn)用組織培養(yǎng)的方式而言，誘變?nèi)~片、莖段、愈傷、叢生芽對(duì)操作環(huán)境要求低，無需無菌操作；第三，經(jīng)誘變后變異性狀經(jīng)幾代積累后能長(zhǎng)期穩(wěn)定遺傳，可進(jìn)行大批量誘變研究。故本研究以‘97103’種子為研究材料進(jìn)行EMS誘變處理。

EMS誘變育種的目的是獲得變異材料進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，因此確定最佳的誘變條件至關(guān)重要。這就需要盡可能在保證產(chǎn)生較大變異的基礎(chǔ)上又不過大損傷誘變材料從而保證產(chǎn)生足夠的誘變率和成活率，現(xiàn)廣為認(rèn)可的最佳誘變條件是經(jīng)誘變處理后存活50%的半致死劑量。關(guān)于存活的定義出現(xiàn)多種理解，其中，宋燕妮［37］、程蛟文等［36］、尚娜［44］采用發(fā)芽率作為分析指標(biāo)，但這不能保證一定的存活株數(shù)，無法產(chǎn)生足夠大的突變?nèi)后w。王春霞等［45］、王學(xué)征等［2］、薛紅霞等［46］以成苗率作為半致死劑量指標(biāo)構(gòu)建了突變?nèi)后w?？紤]到以上因素本研究在關(guān)注發(fā)芽率的同時(shí)也關(guān)注成苗率，并以兩葉一心作為成苗標(biāo)準(zhǔn)，以此確定最佳誘變條件，進(jìn)而保證一定的誘變率和成活率。

本試驗(yàn)通過設(shè)置18個(gè)誘變組合（3個(gè)時(shí)間，6個(gè)濃度梯度）處理西瓜‘97103’種子，統(tǒng)計(jì)分析不同處理?xiàng)l件下西瓜種子的發(fā)芽率及成苗率，發(fā)現(xiàn)5.0%的EMS處理8 h的發(fā)芽率、成苗率接近半致死劑量，從而明確了西瓜‘97103’種子誘變的理想條件是5.0%的EMS處理8 h。而現(xiàn)有的構(gòu)建西瓜突變體庫的研究中，EMS最佳誘變劑量均小于2.5%。除受種子開殼與否、浸種時(shí)間的因素影響外，也可能與西瓜‘97103’種子本身具有較強(qiáng)的EMS耐受性有關(guān)。前人研究認(rèn)為EMS濃度和誘變時(shí)間皆會(huì)對(duì)發(fā)芽率、成苗率產(chǎn)生影響，濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)下降愈顯著［45］，本研究得出相同結(jié)論。將誘變后的植株進(jìn)行全生育期的觀察，可以看到皺縮葉、葉緣變圓、縮小葉、葉色變藍(lán)、葉變狹長(zhǎng)、畸形葉、嵌合體、節(jié)間縮短等多種類型突變體。隨著測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，西瓜全基因組學(xué)研究已進(jìn)入后基因組學(xué)時(shí)代。通過西瓜突變體庫的構(gòu)建與測(cè)序技術(shù)的結(jié)合可明確突變基因及功能，有助于西瓜分子育種及進(jìn)行相關(guān)農(nóng)藝性狀基因分子機(jī)制的研究。本研究結(jié)果為構(gòu)建西瓜突變體庫及西瓜相關(guān)功能基因組學(xué)研究提供了材料基礎(chǔ)。