基于正交設計的西洋梨‘Conference’愈傷組織誘導研究

楊 立，伍 濤，劉 政，程寅勝，李謝雨，聶顯雙，秦仲麒

（湖北省農業(yè)科學院果樹茶葉研究所/湖北省梨工程技術研究中心，武漢 430070）

梨（PyrusL.）屬于薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）或梨亞科（Pomideae）［1］，是世界五大水果之一，深受人們青睞。隨著現代水果產業(yè)的發(fā)展，消費市場對梨綜合品質的要求不斷升級。因此，利用基因工程手段定向培育農藝性狀優(yōu)良的品種是現代果樹育種長期關注的重點。

遺傳轉化是植物基因工程的重要環(huán)節(jié)，高效、穩(wěn)定的轉化受體系統(tǒng)是進行果樹遺傳轉化研究的關鍵。盡管梨樹中山梨、碭山酥梨等品種已建立了遺傳轉化再生植株體系［2，3］，但普遍存在轉化效率低的問題。愈傷組織是已分化的細胞回到脫分化的分生細胞狀態(tài)，更易于接受外源基因，在理論上作為受體的轉化效率更高。隨著愈傷組織在果樹遺傳轉化功能分析中的成功應用［4-6］，有必要在‘Conference’梨中建立一套高效且可持續(xù)擴大培養(yǎng)的愈傷組織無性系。

正交設計是研究與處理多因素試驗的一種科學方法，可以實現最少的試驗次數達到與大量全面試驗等效的結果［7］。因此，本研究以‘Conference’為試材，通過正交設計研究不同外植體和生長調節(jié)劑組合對愈傷組織形成的影響，以期篩選得到最佳試驗方案，建立一套成熟穩(wěn)定的梨無性培養(yǎng)系，為后期開展遺傳轉化的基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為西洋梨品種‘Conference’無菌苗，為華中農業(yè)大學洪霓教授贈予，后實驗室繼代保存。在無菌條件下，選擇長勢良好的植株作為試驗接種的對象，分別剪取葉片（5 mm×5 mm）、葉柄（約0.5 mm）及帶芽的莖段（5～10 mm）為外植體。

1.2 正交試驗設計

采用3因素3水平正交試驗，3因素為外植體和加入培養(yǎng)基中的TDZ和IBA，3水平因素與水平見表1［7］。

表1 L 9（34）正交試驗因素與水平

1.3 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為MS，含6.5 g/L瓊脂、30 g/L蔗糖，pH為5.8～5.9，培養(yǎng)溫度（25±0.2）℃，24 h暗培養(yǎng)。每個處理設置4～5個培養(yǎng)瓶，每瓶各接種10～15個外植體。培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計各處理的外植體愈傷組織誘導率。試驗數據采用SPSS19軟件分析。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導率統(tǒng)計

對愈傷誘導情況進行統(tǒng)計，因為部分處理組的脫分化率不在30%～70%，為提高顯著性檢驗的準確度，對誘導率進行反正弦平方根轉換［8］（表2）。

表2 正交試驗試驗結果統(tǒng)計

經過外植體、TDZ、IBA 3因素3水平共9個組合的正交試驗，不同組合對誘導愈傷組織再生影響各不相同。組內因素水平極差值（R）反映了該因素對試驗結果的影響程度。由表3可知，設計的3個因素對愈傷組織誘導作用主次關系為B＞A＞C，即培養(yǎng)基中TDZ的濃度＞外植體的類型＞IBA濃度。根據各因素平均值（Ki）的大小，可得出最優(yōu)組合為A1B3C3，即以莖段為外植體，置于培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L IBA的組合條件下培養(yǎng)，愈傷組織的誘導率最高。

表3 愈傷組織正交試驗結果的直觀分析（單位：%）

2.2 愈傷組織誘導結果的方差分析及多重比較

2.2.1 試驗結果方差分析 試驗結果sin-1X的方差分析見表4。因素B對試驗結果的影響具有顯著性（P＜0.05），在本試驗組合中，TDZ濃度的高低能顯著影響梨組織的愈傷組織形成，同時，外植體類型（A）和生長調節(jié)劑IBA（C）對愈傷組織是否形成的影響不顯著。

表4 正交試驗結果的方差分析

2.2.2 不同水平間的多重比較 不同水平之間多重比較的結果見表5，A1和A3、A3和A1、B1和B2、B1和B3、B2和B1、B3和B1水平之間呈顯著差異（P＜0.05）。但平均誘導率B3（62.21%）比B2（57.12%）高5.09個百分點，C3（63.85%）比C1（37.84%）高26.01個百分點，盡管B3和B2、C3和C1之間無顯著差異，但可以獲得更多的愈傷組織，因此因素B、C的最佳選項為B3和C3水平。

表5 不同水平間的多重比較分析

3 小結與討論

植物的再生途徑有多種方式，可通過根［9］、胚胎和子葉［10］、原生質體［11，12］再生，或愈傷組 織再分化［13，14］等。王關林等［15］認為，用于基因轉化的受體系統(tǒng)，其再生率一般80%～90%。其中，愈傷組織是經歷了脫分化的分生細胞，分裂周期短、擴大培養(yǎng)后易獲得大量受體細胞，因此，具有更明顯的轉化優(yōu)勢。

在本試驗中，TDZ和IBA對試驗結果有影響，誘導率由大到小依次為B3、B2、B1，C3、C2、C1，證明在適宜濃度范圍內，愈傷誘導率與培養(yǎng)基中TDZ或IBA的濃度呈正比。盡管生長素在細胞脫分化過程中起主要作用，但當配合一定濃度細胞分裂素時，誘導效果更明顯。例如，在IBA（C）濃度為0.1 mg/L時，B3C1組合中愈傷組織誘導率最高，為77.78%，當IBA濃度為0.5 mg/L時，誘導效率達到100%。本研究獲得了‘Conference’梨大量的愈傷組織，以用于植物瞬時表達分析或優(yōu)化構建植物再生轉化體系，為后期深入開展基因功能研究奠定了良好基礎。