血小板衍生物在骨關(guān)節(jié)炎治療中的應(yīng)用

劉哲 唐千 位曉娟 張長(zhǎng)青 朱振中

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種好發(fā)于中老年人群的關(guān)節(jié)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬及活動(dòng)受限[1]。隨著疾病進(jìn)展，患者晚期關(guān)節(jié)功能嚴(yán)重受限，只能接受關(guān)節(jié)置換治療，給個(gè)人生活及社會(huì)經(jīng)濟(jì)都帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[2]。而隨著人口結(jié)構(gòu)的老齡化，OA發(fā)病率顯著提高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)40歲以上人群中，OA患者總數(shù)已超過(guò)1億人，占比高達(dá)46.3%[3-4]。然而，目前臨床上早中期OA的保守治療手段如口服非甾體類抗炎藥和關(guān)節(jié)腔封閉治療（透明質(zhì)酸鈉、糖皮質(zhì)激素、局麻制劑等）雖然可一定程度上緩解疼痛癥狀，但對(duì)損傷軟骨的修復(fù)作用欠佳，且無(wú)法延緩疾病進(jìn)展[5]。

近年，血小板衍生物被逐漸應(yīng)用于治療早中期OA并取得了可觀的療效[6]。目前根據(jù)制備工藝，應(yīng)用于OA的血小板衍生物主要有“三代”產(chǎn)品，即富血小板血漿（PRP）、血小板裂解液（PL）及血小板源性外泌體（PL-exo）[7]。PRP是通過(guò)對(duì)自體外周血進(jìn)行梯度離心而獲得的濃縮血小板產(chǎn)物，經(jīng)凝血酶或鈣劑的激活，濃縮的血小板可釋放豐富的生物活性因子如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等以修復(fù)損傷軟骨。同時(shí)，PRP可通過(guò)下調(diào)白細(xì)胞介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α等促炎因子的表達(dá)，減輕早中期OA炎性反應(yīng)[8]。目前PRP已廣泛應(yīng)用于OA的臨床治療[9-10]。PL是在PRP基礎(chǔ)之上進(jìn)一步凍融、裂解、離心后所得的濃縮生長(zhǎng)因子產(chǎn)物。由于去除了細(xì)胞成分，PL免疫源性進(jìn)一步降低。而PL-exo則是在活化的PRP和PL基礎(chǔ)上進(jìn)行超速離心后獲得的含有血小板活性成分的細(xì)胞外囊泡，其均質(zhì)性更佳，有效成分得到進(jìn)一步濃縮[11]。目前PL和PL-exo尚處于基礎(chǔ)研究階段。

1 PRP

PRP的定義最早由Kingsley等于1954年提出[12-13]，并隨著其內(nèi)含生長(zhǎng)因子的發(fā)現(xiàn)，于20世紀(jì)90年代開(kāi)始應(yīng)用于頜面外科手術(shù)中組織修復(fù)以及一些慢性創(chuàng)面的治療。其后，PRP逐漸用于治療肌骨運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病，特別是一些慢性運(yùn)動(dòng)損傷及退行性疾病[14]。PRP因被證實(shí)可以修復(fù)損傷軟骨，緩解局部炎癥反應(yīng)，近年成為早中期OA治療的主流手段之一[15]。

目前已知PRP中包含1 500多種生物活性物質(zhì)，其中各種生長(zhǎng)因子、趨化因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在OA軟骨修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8,16]。軟骨組織區(qū)別于其他組織，缺少有效的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)方式，其損傷后修復(fù)較為困難且緩慢[17]。維持軟骨細(xì)胞活性、促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)及減輕炎癥反應(yīng)對(duì)改善OA患者預(yù)后，延緩疾病進(jìn)展具有重要作用[18]。Dos Santos等[19]的實(shí)驗(yàn)表明，PRP可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，提高軟骨細(xì)胞中糖胺聚糖及Ⅱ型膠原的表達(dá)。Ragab等[20]則在大鼠OA模型上驗(yàn)證了PRP可抑制軟骨細(xì)胞凋亡信號(hào)并下調(diào)脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）及TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達(dá)水平。Ihnatouski等[21]通過(guò)原子力顯微鏡發(fā)現(xiàn)并證實(shí)經(jīng)PRP治療可有效改善兔OA軟骨組織形變。

Migliorini等[22]在薈萃分析中共計(jì)納入了30項(xiàng)有關(guān)比較關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PRP與其他傳統(tǒng)生物制劑對(duì)OA治療效果的隨機(jī)對(duì)照研究，指出在治療后第3、6、12個(gè)月，相較于傳統(tǒng)腔內(nèi)注射制劑（透明質(zhì)酸或類固醇激素），PRP可明顯緩解關(guān)節(jié)疼痛并改善運(yùn)動(dòng)功能，是更為理想的治療制劑。而Abbas等[23]的薈萃分析進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析白細(xì)胞濃度對(duì)于PRP治療OA效果的影響，認(rèn)為不同白細(xì)胞濃度的PRP對(duì)于OA的治療效果并無(wú)明顯區(qū)別。

雖然PRP對(duì)OA有著積極的治療效果，但作為血小板衍生物的“第一代”產(chǎn)品，PRP仍有一定的局限性。PRP本質(zhì)為濃縮的自體血小板，仍保留著較強(qiáng)的免疫原性，所以目前應(yīng)用于臨床治療的PRP大多采用自體回輸?shù)姆绞?，這使得一些本身患有血小板相關(guān)疾病的患者無(wú)法使用。OA的治療通常需要多次注射，反復(fù)采血對(duì)于患者也是不小的負(fù)擔(dān)，同時(shí)會(huì)增加醫(yī)源性感染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，由于PRP的有效成分多為蛋白組分，其有效半衰期短且體外易降解，治療的穩(wěn)定性仍有待提高[8]。

2 PL

PL是血小板衍生物的“第二代”產(chǎn)品，作為PRP的進(jìn)一步加工制品，其很大程度上去除了富有免疫源性的血小板膜成分，同時(shí)保留了具有生物活性的生長(zhǎng)因子等蛋白組分。因此，PL被認(rèn)為與PRP具有相似的生物活性，在基礎(chǔ)和臨床研究中均被證實(shí)可以有效治療OA[24]。

P?tter等[25]比較PRP與PL在靜態(tài)和機(jī)械應(yīng)力下對(duì)體外軟骨細(xì)胞表型和功能的作用，發(fā)現(xiàn)PRP組與PL組軟骨糖胺聚糖的表達(dá)無(wú)顯著差異；但在應(yīng)力環(huán)境下，與PRP組相比，PL組軟骨細(xì)胞亞硝酸鹽生成顯著減少，而TGF-β1表達(dá)則明顯增加，提示PL在體外緩解炎癥反應(yīng)及促軟骨生成方面更具優(yōu)勢(shì)。Gilbertie等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PL可抑制滑膜細(xì)胞炎癥介質(zhì)分泌并促進(jìn)透明質(zhì)酸合成；用PL干預(yù)的滑膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理滑膜細(xì)胞可促進(jìn)其細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分泌。Yan等[27]在體內(nèi)大鼠OA模型中驗(yàn)證了PL可通過(guò)抑制TNF-α介導(dǎo)核因子-κB（NF-κB）信號(hào)，從而抑制炎癥反應(yīng)。此外，Yan等[28]研究發(fā)現(xiàn)，相比于PRP，PL促干細(xì)胞增殖和遷移的作用更為顯著，其分子機(jī)制可能與自噬效應(yīng)蛋白（Beclin-1）依賴性的細(xì)胞自噬相關(guān)。聯(lián)合PL與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能在OA治療中發(fā)揮協(xié)同作用。

Al-Ajlouni等[29]通過(guò)前瞻性的臨床試驗(yàn)研究PL對(duì)早中期OA的治療效果，在治療第32、52周，通過(guò)僵硬、疼痛、癥狀、日常生活和運(yùn)動(dòng)功能5個(gè)評(píng)分量表進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射自體PL可緩解早中期OA患者疼痛癥狀，提高患者生活質(zhì)量，改善疾病預(yù)后，是一種相對(duì)有效且安全的治療手段。雖然該試驗(yàn)樣本量偏小，但卻是第一個(gè)在臨床試驗(yàn)方面評(píng)價(jià)PL對(duì) OA治療效果的研究。然而，由于目前PL并未廣泛應(yīng)用于OA的臨床治療中，所以尚缺少其與PRP療效對(duì)比的研究。雖然異體來(lái)源的PL尚未有應(yīng)用于OA治療的報(bào)道，但其在角膜病和神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用已進(jìn)入前臨床實(shí)驗(yàn)階段[30]。

總體而言，相較于PRP，PL的制備工藝顯著降低了自身的免疫原性，為異體應(yīng)用提供了可能性，擴(kuò)大了其臨床應(yīng)用。此外，PRP對(duì)儲(chǔ)存溫度較敏感，生物有效周期短，而PL則可穩(wěn)定地儲(chǔ)存在0℃以下的冷凍環(huán)境中，可多次使用。這一定程度上降低了存儲(chǔ)及維護(hù)成本，以及反復(fù)穿刺帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，有效降低了血小板衍生制品在臨床應(yīng)用中的浪費(fèi)率[31]。相較于第一代的PRP，第二代的PL具有相當(dāng)甚至更優(yōu)的軟骨修復(fù)作用及更靈活的使用場(chǎng)景，未來(lái)有望取代PRP在臨床實(shí)踐中成為新一代的關(guān)節(jié)腔注射制劑[24,32]。

3 PL-exo

作為細(xì)胞外囊泡的重要組成部分之一，外泌體是一種直徑在30～150 nm的含有多種蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)等生物活性成分的微小囊泡[33]。外泌體是細(xì)胞間傳遞生物信息的重要紐帶，在各種生理及病理過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。多種細(xì)胞來(lái)源的外泌體如骨髓、滑膜和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體及PL-exo等均已在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中被報(bào)道能夠有效治療OA[34-35]。有研究對(duì)PL進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡為其主要組分，因此推測(cè)PLexo可能是PL發(fā)揮生物學(xué)功能的主要途徑[36]。目前報(bào)道的PL-exo的獲取來(lái)源主要有對(duì)PRP進(jìn)行提取和直接對(duì)PL進(jìn)行進(jìn)一步的超速離心加工[37]。由于免疫源性的存在以及血細(xì)胞的殘留，PRP無(wú)法進(jìn)行多人份的混合（可能會(huì)導(dǎo)致凝血），每次只能進(jìn)行單人份PRP的外泌體提取，獲取量較少且成本較高。而PL由于免疫成分的剔除，可以進(jìn)行一次性的大量提取，但PL制備過(guò)程中需要反復(fù)凍融PL，這使得所獲得的外泌體膜可能會(huì)出現(xiàn)破裂。因此，PRP與PL各有優(yōu)勢(shì)，標(biāo)準(zhǔn)化的制備工藝仍有待進(jìn)一步研究[11]。

2014年，Torreggiani等[38]首次成功從人PL中分離純化出外泌體，并對(duì)該外泌體組分進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)PL-exo保留了堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、TGF-β、PDGF-BB等多種組織再生相關(guān)生物因子。相較于PL，PL-exo白蛋白等血清成分被剔除，使得有效成分進(jìn)一步濃縮，是更為理想的組織修復(fù)制劑。隨后，Liu等[39]在體內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)來(lái)源于PRP或激活PRP的PL-exo擁有相似的軟骨保護(hù)作用，其潛在分子機(jī)制可能與激活Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制軟骨細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)。Otahal等[40]比較單純PL-exo與超急性期血清來(lái)源外泌體對(duì)于軟骨細(xì)胞的調(diào)控，結(jié)果提示兩者均能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝，但PL-exo可以顯著降低IL-1等炎性因子的表達(dá)水平。

作為血小板衍生物的進(jìn)一步加工產(chǎn)品，PL-exo具有良好的均質(zhì)性、較低的免疫原性及更為濃縮的生物活性組分。此外，得益于天然的磷脂雙分子層的膜結(jié)構(gòu)，PL-exo能夠更好地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮作用。雖然目前尚無(wú)有關(guān)PL-exo應(yīng)用于OA的臨床對(duì)照研究，但美國(guó)梅奧診所的學(xué)者們已成功制備了PL-exo凍干粉，復(fù)溶后仍能保持良好的囊泡結(jié)構(gòu)，并對(duì)創(chuàng)面愈合及肌腱具有修復(fù)作用[41-42]。因此，PL-exo有望成為一種批量生產(chǎn)的血小板衍生物產(chǎn)品，可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和異體使用，有著廣闊的臨床前景。

4 展望

血小板衍生物目前在OA治療上已取得了許多突破。無(wú)論是最初的PRP還是后來(lái)的PL及PLexo都被證實(shí)是相對(duì)理想的軟骨損傷修復(fù)制劑。但是目前針對(duì)血小板衍生物仍缺乏相對(duì)統(tǒng)一的制備工藝、準(zhǔn)確的行業(yè)規(guī)范及基于此的臨床應(yīng)用指南。同時(shí)，目前仍有許多問(wèn)題如注射后的局部代謝降解、組織在位性及靶向性等亟待解決。此外，血小板衍生物成分復(fù)雜，其治療OA的具體分子機(jī)制仍尚未闡明，對(duì)相關(guān)機(jī)制的探索有助于對(duì)其進(jìn)一步的優(yōu)化提純。相信未來(lái)基于血小板衍生物的治療手段將不斷完善，并使越來(lái)越多的OA患者受益。