外排泵系統(tǒng)與幽門螺桿菌抗生素耐藥性的研究進(jìn)展

童 靜，李昌平

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，HP)是一種革蘭陰性慢性感染性致病菌，2017年有研究報(bào)道全球HP感染率已超過(guò)50%，被認(rèn)為是全球常見的感染細(xì)菌之一[1]。HP可引起胃十二指腸疾病及血液系統(tǒng)疾病等[2]，而通過(guò)根除HP感染，不僅可以減少消化性潰瘍等疾病治愈后的的復(fù)發(fā)，還能在一定程度上降低胃癌發(fā)生率[3]?！禡aastricht V/Florence幽門螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告》提出，一旦感染HP應(yīng)進(jìn)行根治性治療[4]。在我國(guó)，耐藥菌株發(fā)生率隨著抗生素的不規(guī)范使用呈現(xiàn)逐步上升趨勢(shì)。甲硝唑、克拉霉素以及左氧氟沙星等常用抗生素對(duì)HP的耐藥率分別為 40%～70%、20%～50%以及 20%～50%，且存在一定的區(qū)域差異性，同時(shí)HP多重耐藥率正處于逐年上升中[5]。因此，解決HP感染的根本在于如何解決相關(guān)抗生素的耐藥性。本文就HP抗生素耐藥性及其外排泵系統(tǒng)的研究進(jìn)展作一綜述，旨在為臨床治療耐藥HP感染提供一定思路。

1 抗生素耐藥性

抗生素耐藥性可以通過(guò)開發(fā)新的抗生素或減少細(xì)菌耐藥性來(lái)解決，然而抗生素耐藥性持續(xù)增加，最終可能會(huì)超過(guò)新的抗生素被開發(fā)的數(shù)量。HP通常是一種細(xì)胞外的非侵襲性致病菌，它可以通過(guò)復(fù)雜的過(guò)程改變胃上皮細(xì)胞之間緊密的細(xì)胞連接，藏在細(xì)胞內(nèi)，以保護(hù)它不受抗生素根除治療的影響[6]；HP還具有較高的遺傳變異性，易產(chǎn)生抗生素耐藥基因，對(duì)各種抗生素具有很強(qiáng)的耐藥性，常導(dǎo)致根除失敗。因此，患者不得不接受許多后續(xù)治療，增加了治療成本和時(shí)間。當(dāng)?shù)?次治療失敗后，患者體內(nèi)容易產(chǎn)生抗生素耐藥性，為后續(xù)相關(guān)治療增加了一定難度[7]。細(xì)菌耐藥性是宿主和細(xì)菌之間一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，可能與藥物靶點(diǎn)突變，外排泵表達(dá)增強(qiáng)，膜通透性改變等機(jī)制有關(guān)[8]。事實(shí)上，細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程中，一些關(guān)鍵功能蛋白會(huì)發(fā)生突變，如核酸合成、氧化還原系統(tǒng)和蛋白質(zhì)翻譯等，從而導(dǎo)致抗生素耐藥[9]。外排泵活性和細(xì)胞膜通透性的改變將影響抗生素在細(xì)胞中的積累，進(jìn)而影響抗菌藥物的活性[10]。此外，細(xì)菌可以通過(guò)產(chǎn)生使抗生素失活的酶或釋放毒力因子來(lái)影響抗生素的活性[11]。以上機(jī)制在細(xì)菌耐藥過(guò)程中并不是孤立存在的，外排泵活性的增加可能會(huì)增加細(xì)菌耐藥基因的突變率[12]。

2 外排泵系統(tǒng)的介紹

2.1 細(xì)菌外排泵系統(tǒng)的組成 細(xì)菌外排泵是細(xì)菌耐藥性的主要機(jī)制之一[13]。細(xì)菌外排泵系統(tǒng)包括一系列轉(zhuǎn)運(yùn)體，也稱為多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體，其作用機(jī)制是將抗菌藥物排出細(xì)胞外，大大降低了該抗菌藥物的濃度，繼而產(chǎn)生耐藥性。目前研究發(fā)現(xiàn)，與HP相關(guān)的外排泵系統(tǒng)可分為五大家族：RND家族、MFS家族、ABC家族、SMR家族與MATE家族[14]。其中外排作用最強(qiáng)的是RND家族，目前認(rèn)為該家族只存在于革蘭陰性菌中[15]。2000年首先發(fā)現(xiàn)了hefABC、hefDEF和hefGHI 3種RND外排泵系統(tǒng)，研究得最多的為hefABC-RND外排泵系統(tǒng)[16]。

2.2 HP相關(guān)外排泵系統(tǒng)的特點(diǎn) HP相關(guān)外排泵系統(tǒng)的特點(diǎn)是由轉(zhuǎn)位酶、TolC同源基因和跨膜連接其他2種組分的附屬組件組成。其中最具特色的是HP0605-HP0607轉(zhuǎn)運(yùn)體，也被稱為hefABC或Acra/B/TolC系統(tǒng)。已有研究表明，HP菌株中存在大量hefA外排泵基因，且其與HP的多重耐藥關(guān)系密切[17]。治療HP的一些常用抗生素如阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑和四環(huán)素的耐藥性與外排泵皆有密切關(guān)系[18]。對(duì)大腸桿菌外排泵的研究表明，革蘭陰性菌的RND外排泵大多屬于TolCAcrAB和OprM-MexAB系統(tǒng)[19]，RND家族在HP的多藥耐藥中發(fā)揮著重要作用。Kutschke等[20]分別測(cè)定了野生菌株和基因突變菌株種12種抗生素的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，發(fā)現(xiàn)基因突變菌株中有超過(guò)一半抗生素的MIC出現(xiàn)了下降，推測(cè)細(xì)菌耐藥性與外排泵之間存在著一定關(guān)系。該研究還表明，敲除HEFC基因可增加青霉素、頭孢噻肟、紅霉素、克拉霉素和四環(huán)素等對(duì)HP的有效性[21]。外排泵與HP生物膜的形成也有一定關(guān)系。有研究表明，相比于浮游菌株，有生物膜形成的菌株外排泵基因明顯高表達(dá)，推測(cè)生物膜可能與外排泵系統(tǒng)共同發(fā)揮作用增加抗生素耐藥性。臨床多藥耐藥的HP菌株中，外排泵基因的表達(dá)水平高于該菌的敏感菌株，表明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的產(chǎn)生與耐藥表型有直接關(guān)系[22]。也有研究表明，SpoT基因作為一種HP生長(zhǎng)的潛在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其在球形HP中具有較高水平的表達(dá)，敲除外排泵Glup增加了HP對(duì)抗生素的敏感性[23]。此外，外排泵基因HP0605、HP0971、HP1327在有生物膜形成的菌株中的表達(dá)顯著高于浮游菌株，表明外排泵和生物膜可以通過(guò)協(xié)同作用增加抗生素耐藥性[21]。

3 外排泵與HP抗生素耐藥性的關(guān)系

3.1 外排泵與克拉霉素 克拉霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其耐藥性通常由23SrRNA點(diǎn)突變引起，HP對(duì)克拉霉素的耐藥率已達(dá)20%～50%[5]?？死顾啬退幮耘c外排泵系統(tǒng)緊密相關(guān)，KefB參與了HP對(duì)克拉霉素的耐藥[24]。Zhong等[25]的研究進(jìn)一步表明，在MIC劑量克拉霉素的刺激下，外排泵基因在HP1870中表達(dá)顯著，而在標(biāo)準(zhǔn)菌株中表達(dá)不顯著，說(shuō)明HP耐藥菌株中外排泵基因發(fā)揮著重要作用。此外，在突變型菌株中RND家族的基因突變率明顯高于野生型菌株的基因突變率[26]。安瑩[27]通過(guò)敲除hefABC、hefDEF、hefGIH等外排泵基因研究其與克拉霉素耐藥的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)基因敲除后的MIC顯著低于野生菌株，表明hef外排泵系統(tǒng)在克拉霉素耐藥中發(fā)揮重要作用。

3.2 外排泵與甲硝唑 甲硝唑的細(xì)菌耐藥性主要是由基因突變引起。但也有研究發(fā)現(xiàn)，hefA基因的過(guò)表達(dá)可減少甲硝唑在HP中的含量，推測(cè)hefA可能與甲硝唑耐藥有關(guān)[28]。TolC同源基因?qū)ν馀疟没钚缘纳险{(diào)至關(guān)重要，該同源基因過(guò)表達(dá)與甲硝唑的濃度有關(guān)，且呈正相關(guān)，通過(guò)增加藥物的排出，從而導(dǎo)致甲硝唑耐藥，這可能是甲硝唑耐藥的關(guān)鍵[29]。

3.3 外排泵與左氧氟沙星 左氧氟沙星三聯(lián)或四聯(lián)療法為臨床治療HP感染提供了明顯的優(yōu)勢(shì)，但氟喹諾酮類藥物的濫用，使得HP對(duì)左氧氟沙星耐藥的發(fā)生率增加。大多數(shù)左氧氟沙星耐藥HP的克隆已被確定與gyrA的Ala88、Ala97和Met191位，以及gyrB的Phe438、Glu463、Asp481和Arg484位的突變有關(guān)[30]。此外，革蘭陰性細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性是通過(guò)主動(dòng)排出抗生素獲得的，在大腸桿菌分離菌株中，外排泵基因表達(dá)的抑制降低了氟喹諾酮類藥物的MIC。Ye等[31]通過(guò)Sanger測(cè)序推測(cè)HP0970(hefE)和HP1329(hefI)中的12種突變可能會(huì)降低對(duì)左氧氟沙星的耐藥性。

3.4 外排泵與四環(huán)素 四環(huán)素是一種殺菌性的抗生素，四環(huán)素的耐藥性主要是由于其在16 S核糖體RNA初級(jí)結(jié)合位點(diǎn)上的堿基發(fā)生替換所致。事實(shí)上，導(dǎo)致四環(huán)素耐藥的另外一個(gè)重要因素也可能與外排泵的介導(dǎo)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，由于hefAB外排泵的介導(dǎo)參與，四環(huán)素的殺菌效果會(huì)發(fā)生一定程度的降低。還有研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素的耐藥性可能還與依賴質(zhì)子動(dòng)力的外排機(jī)制有一定關(guān)系[28]。此外，某些外排泵基因如HP1165和 hefA的過(guò)表達(dá)，也會(huì)加強(qiáng)HP對(duì)四環(huán)素的耐藥性[32]。

4 HP外排泵抑制劑

目前發(fā)現(xiàn)的外排泵抑制劑主要是通過(guò)抑制細(xì)菌對(duì)藥物的排出，從而恢復(fù)耐藥性細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，其作用機(jī)制主要?dú)w為以下3點(diǎn)：(1)干擾外排泵的組成；(2)阻斷外排泵能量供給；(3)干擾底物通過(guò)外排泵[33]。羰基氰氯苯是一種通過(guò)質(zhì)子驅(qū)動(dòng)的解偶聯(lián)劑，主要是通過(guò)抑制外排泵系統(tǒng)的動(dòng)力，使其恢復(fù)細(xì)菌對(duì)抗生素的應(yīng)答從而發(fā)揮作用。二胺類化合物(PAbN)是一種RND型外排泵抑制劑，可能是通過(guò)第3類機(jī)制，來(lái)達(dá)到恢復(fù)細(xì)菌對(duì)多種抗生素的敏感從而發(fā)揮作用。Hirata等[34]報(bào)道PAbN能降低克拉霉素耐藥菌株中的MIC，且隨著PAbN劑量的增加，克拉霉素的MIC表現(xiàn)出依賴性降低，表明外排泵與克拉霉素的耐藥性存在一定聯(lián)系。質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)作為一種質(zhì)子動(dòng)力解偶聯(lián)劑，被廣泛用來(lái)抗HP感染，也是通過(guò)阻斷外排泵能量供給來(lái)恢復(fù)細(xì)菌對(duì)抗生素的應(yīng)答。鄭鵬遠(yuǎn)等[33]研究指出，泮托拉唑濃度為10 μg/ml時(shí)可顯著降低耐藥菌株對(duì)四環(huán)素、克林霉素等的MIC，同時(shí)可以增加敏感菌株對(duì)部分抗生素如琥乙紅霉素和頭孢曲松的敏感性，表明PPIs在HP根治中可能通過(guò)抑制外排泵的排出能力，從而提高殺菌力。此外有研究表明，在常用的PPIs中，雷貝拉唑?qū)δ退幘牦w外實(shí)驗(yàn)的影響最大，其次是泮托拉唑，說(shuō)明雷貝拉唑能更好地抑制外排泵和逆抗藥性[35]。但國(guó)內(nèi)外將PPIs作為外排泵抑制劑的研究還比較少，有待進(jìn)一步探討。

5 小結(jié)與展望

HP耐藥率持續(xù)上升，且出現(xiàn)多藥耐藥菌株，外排泵與HP多重耐藥性有著密不可分的關(guān)系。外排泵抑制劑可以通過(guò)抑制細(xì)菌對(duì)藥物的排出，達(dá)到降低某些抗生素MIC的作用。對(duì)HP外排泵進(jìn)行研究，一方面可以在基因水平上抑制蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)，另一方面可以開發(fā)出有效的外排泵抑制劑，這對(duì)解決HP抗生素耐藥性提供了新思路。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)外排泵系統(tǒng)及外排泵抑制劑與HP抗生素耐藥性的研究還值得進(jìn)一步探索，以幫助臨床實(shí)施更規(guī)范、更精準(zhǔn)的治療，控制耐藥菌株的形成和播散，進(jìn)而提高HP的根除率。