蒺藜苜蓿cation/H+exchanger基因家族鑒定及表達特征分析

吳彤，劉云苗，金軍，董偉峰，才曉溪，孫明哲，賈博為，孫曉麗

（黑龍江八一農(nóng)墾大學作物逆境分子生物學實驗室，黑龍江 大慶 163319）

苜蓿（Medicago truncatula）屬于豆科模式植物，因其營養(yǎng)豐富、蛋白含量高、可生物固氮等優(yōu)點，享有“牧草之王”的美稱。除了作為重要的飼料作物外，也是生態(tài)環(huán)境建設中重要的植物材料，具有改良土壤、保持水土的功能［1］。苜蓿的種植水平在一定程度上反映了一個國家畜牧業(yè)的發(fā)展水平［2］。但是，隨著環(huán)境問題的凸顯，如土壤鹽堿化、干旱、低溫等逆境脅迫，苜蓿產(chǎn)業(yè)受到了嚴重的威脅。隨著生物技術的飛速發(fā)展，通過分子設計育種培育抗逆苜蓿新品種是提高苜蓿產(chǎn)量的有效途徑之一。然而，其關鍵在于挖掘抗逆關鍵調(diào)控基因。

由于植物的固定性、不可移動性以及與自然環(huán)境的統(tǒng)一性，在遭受外界不利因素的影響時，通過調(diào)控自身生理生化變化來緩解脅迫傷害。鉀是植物重要的必需元素，在維持細胞電荷平衡、離子平衡、細胞膨壓、酶活性調(diào)節(jié)等方面具有重要的功能［3］。CHX（cation/H+exchanger）家族是CPA超家族的一個亞家族，參與植物細胞K+轉(zhuǎn)運［4］。CPA超家族分為CPA 1和CPA 2兩個亞家族，CPA 1亞家族包括NHX家族，而CPA 2亞家族包括KEA和CHX家族［5］。研究發(fā)現(xiàn)CHX家族成員都包含約800個氨基酸，其中N端約有400個氨基酸組成了CHX家族的疏水性保守結(jié)構(gòu)域cation/H+exchanger。目前多個物種的CHX家族已被鑒定，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）CHX家族有28個成員，在K+穩(wěn)態(tài)、滲透調(diào)節(jié)、花粉發(fā)育等方面起著重要作用［6］。AtCHX13和AtCHX14都作為鉀離子內(nèi)向轉(zhuǎn)運體發(fā)揮功能［7—8］。AtCHX17也參與調(diào)控K+轉(zhuǎn)運，缺K+時，atchx17突變體根部K+積累低［9］。AtCHX20調(diào)控K+轉(zhuǎn)運在細胞滲透調(diào)節(jié)中扮演重要角色［10］。大豆（Glycine max）共有40個CHX基因，在花中高表達［11］。野生大豆（Glycine soja）包含有34個CHX成員，其中GsCHX19.3在花中高表達，并響應中性鹽和蘇打鹽堿脅迫，GsCHX19.3超量表達能夠顯著提高過表達擬南芥鉀離子含量［12］。水稻（Oryza sativa）CHX家族有17個成員，OsCHX14的表達受JA通路影響，調(diào)控水稻開花期鉀離子穩(wěn)態(tài)［13］。蘋果（Malus pumila）中發(fā)現(xiàn)了33個CHX成員，在K+的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，超過60%的成員在根中表達量高，這也說明了CHX家族成員對K+吸收的重要作用［14］。

現(xiàn)有研究表明CHX在對K+轉(zhuǎn)運方面具有重要作用，但是目前苜蓿CHX基因家族的研究尚未見報道。本研究通過對蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）CHX基因家族的生物信息分析，了解其發(fā)育、結(jié)構(gòu)及表達特征，為后續(xù)苜蓿CHX基因抗逆功能研究及抗逆苜蓿新品種培育提供寶貴的基因資源。

1 材料與方法

1.1 蒺藜苜蓿CHX基因篩選與結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)已發(fā)表的擬南芥CPA家族蛋白序列，利用HMMER軟件構(gòu)建隱馬爾可夫模型［5—6］。在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）［15］數(shù)據(jù)庫下載蒺藜苜蓿全基因組和蛋白組序列信息，通過命令提示符在HMM文件里輸出蒺藜苜蓿CPA家族基因OUT文件。進一步通過擬南芥和蒺藜苜蓿CPA家族的系統(tǒng)發(fā) 生 分 析、Pfam（http：//pfam.xfam.org）［16］、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）［17］和 基于NCBI的CD search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）［18］核實保守結(jié)構(gòu)域，去除冗雜基因，最終獲得蒺藜苜蓿CHX家族成員。并利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）網(wǎng)站預測跨膜結(jié)構(gòu) 域，綜 合SoftBerry（http：//linux1.softberry.com/all.htm）、PSORT（https：//www.genscript.com/psort.html）［19］以及CELLO（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）網(wǎng)站預測蛋白亞細胞定位。利用ClustalX進行序列比對。

1.2 蒺藜苜蓿CHX基因染色體定位及同源性分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫獲取蒺藜苜蓿、擬南芥和水稻全基因組注釋文件，通過TBtools［20］提取染色體位置信息。利用OrthoVenn2（https：//orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home）［21］分析CHX家族基因物種間及物種內(nèi)的直系同源、旁系同源關系，結(jié)合染色體長度和基因位置信息，利用TBtools軟件進行可視化［20］。

1.3 蒺藜苜蓿CHX基因進化關系分析

利用MEGA-X軟件對47個蒺藜苜蓿，28個擬南芥CHX成員進行ClustalW多重序列比對，采用極大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建蒺藜苜蓿和擬南芥CHX系統(tǒng)進化樹，并采用自展法（bootstrap）進行檢驗，數(shù)值設置為1000［22］。

1.4 蒺藜苜蓿CHX基因結(jié)構(gòu)分析

基于Phytozome獲取的蒺藜苜蓿CHX序列信息，采用TBtools分析基因外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。并利用NCBI的CD search分析47個蒺藜苜蓿CHX保守結(jié)構(gòu)域，采用MEME（https：//meme-suite.org/meme/）［23］分析保守基序，通過TBtools進行可視化［20］。

1.5 蒺藜苜蓿CHX基因順式作用元件分析

通過TBtools軟件提取47個蒺藜苜蓿CHX基因啟動子序列，利用Plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）［24］預測順式作用元件，并將結(jié)果用TBtools可視化［20］。

1.6 蒺藜苜蓿CHX基因表達分析

基于ePlant（http：//bar.utoronto.ca/eplant_medicago/）［25］獲取蒺藜苜蓿CHX基因在不同組織器官的表達數(shù)據(jù)，基于測序數(shù)據(jù)獲得脅迫下蒺藜苜蓿CHX基因脅迫表達，利用TBtools可視化［20］。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并利用TBtools作圖［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒺藜苜蓿CHX基因家族鑒定

利用已發(fā)表的擬南芥CPA成員（AtCHXs、AtKEAs、AtNHXs）蛋白序列信息［26—28］，基于HMMER分析，構(gòu)建隱馬爾可夫模型，并以此來搜索蒺藜苜蓿蛋白數(shù)據(jù)，初步獲得了62個蒺藜苜蓿CPA基因。進一步利用MEGA—X將其與擬南芥CPA成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖1），其中48個基因?qū)儆贑HX亞家族，8個與AtNHXs屬于同一分枝，其余6個與AtKEAs聚合在一起。進一步利用Pfam、SMART和基于NCBI的CD search對48個苜蓿CHX蛋白序列分析，核實其Na+/H+exchanger結(jié)構(gòu)域的準確性和完整性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Medtr3g083860基因蛋白序列全長只有232個氨基酸，且序列上不存在任何結(jié)構(gòu)域，最終共獲得47個苜蓿CHX。

圖1 蒺藜苜蓿與擬南芥CPA成員進化關系分析Fig.1 Evolutionary analysis of CPA family members between M.truncatula and A.thaliana

鑒于大豆和蘋果CHX成員按照其與擬南芥CHX相似性命名［11，14］，據(jù)此將蒺藜苜蓿CHX成員重新命名（MtCHX1-MtCHX28.2），具體信息見表1。氨基酸序列長度從729～920不等，其中MtCHX3.8、MtCHX3.10、MtCHX4.1、MtCHX4.2、MtCHX4.3和MtCHX15.5這6個基因的轉(zhuǎn)錄序列（transcript sequence）、編碼序列（coding sequence，CDS）、蛋白序列長度完全一致。經(jīng)過序列比對，發(fā)現(xiàn)6個基因序列相似度達到78.71%（圖2）。尤其是MtCHX3.10、MtCHX4.2、MtCHX4.3基因序列只有幾個堿基的差別，相似度高達99.31%。相似度較高暗示了這些基因間存在緊密的復制關系，新成員的產(chǎn)生可能來自基因組的大規(guī)模復制，繼而形成了基因簇。進一步的蛋白亞細胞定位預測結(jié)果顯示，MtCHXs作為質(zhì)膜蛋白發(fā)揮功能。

表1 蒺藜苜蓿CHX基因家族成員信息Table 1 Information of CHX family genes from M.truncatula

2.2 蒺藜苜蓿CHX基因家族同源性分析

進一步對47個MtCHXs染色體定位分析，通過圖3可以看出，47個成員分布在8條染色體上。其中，3號和5號染色體上的基因數(shù)目均高達13個，7號染色體上也有8個成員，其余染色體上均有1～4個基因不等，而MtCHX23.4未定位在任何染色體上，未在圖中展示。通過蒺藜苜蓿、擬南芥和水稻CHX成員同源性分析，在蒺藜苜蓿物種內(nèi)獲得108對旁系同源基因?qū)Α４送膺€發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿和擬南芥中有16對直系同源基因，蒺藜苜蓿和水稻中檢測出6對直系同源基因，水稻和擬南芥中檢測出4對直系同源基因，由此可以看出，雙子葉植物蒺藜苜蓿和擬南芥親緣關系近，而與單子葉植物水稻的親緣關系遠。親緣關系越近，直系同源基因相對多，也可能表現(xiàn)出更相似的功能。

圖3 蒺藜苜蓿CHX與擬南芥、水稻直系和旁系同源基因分布Fig.3 Paralogous and orthologous analysis of CHX family from alfalfa，Arabidopsis and rice

續(xù)表Continued Table

2.3 蒺藜苜蓿CHX基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為進一步了解蒺藜苜蓿CHX基因進化關系，利用MtCHXs和AtCHXs蛋白序列，基于MEGA-X，采用極大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果如圖4所示，與已發(fā)表的AtCHXs分組一致，蒺藜苜蓿CHX家族也分為5組（GroupⅠ-Ⅴ）［28］。其中，GroupⅣ基因數(shù)量最多，高達19個，而GroupⅤ只有3個成員。與基因同源關系結(jié)果一致，MtCHXs與同源關系近的AtCHXs在同一組，暗示它們可能具有相似的功能。

圖4 蒺藜苜蓿CHX基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of MtCHXs

2.4 蒺藜苜蓿CHX基因結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分析

進一步對蒺藜苜蓿CHX基因結(jié)構(gòu)分析（圖5），各組內(nèi)成員呈現(xiàn)相似的基因結(jié)構(gòu)。特別是MtCHX3.8、MtCHX3.10、MtCHX4.2、MtCHX4.3的內(nèi)含子—外顯子結(jié)構(gòu)幾乎完全一樣。整個蒺藜苜蓿CHX家族非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）只有7個成員包含3′-UTR區(qū)，9個成員有5′-UTR區(qū)。其中GroupⅣa成員基因內(nèi)含子序列最長，多數(shù)基因都具有3′-UTR區(qū)和5′-UTR區(qū)。只有MtCHX18.2和MtCHX19.1沒有UTR區(qū)。

圖5 蒺藜苜蓿CHX基因家族結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Gene str uctur e analysis of MtCHXs

保守的內(nèi)含子—外顯子結(jié)構(gòu)可能會產(chǎn)生保守的蛋白序列，進一步對47個蒺藜苜蓿CHX的保守基序和保守結(jié)構(gòu)域分析。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，47個蒺藜苜蓿CHX蛋白的N端均有完整Na+/H+exchanger結(jié)構(gòu)域，約400～500個氨基酸（圖6A）。結(jié)合蛋白保守基序可以看出，檢測的15個保守基序中，N端的Motif 5、7、9、11、12、13和14構(gòu)成了保守的Na+/H+exchanger結(jié)構(gòu)域，緊鄰Na+/H+exchanger結(jié)構(gòu)域的C端還包含有保守的AANHlike結(jié)構(gòu)域，由Motif 1、3、6、8、10構(gòu)成（圖6B）。此外，在蒺藜苜蓿CHX蛋白的C末端還包括保守的Motif 2、4和15，可能參與蛋白活性的調(diào)控。

圖6 蒺藜苜蓿CHX基因家族保守性分析Fig.6 Conservation analysis of MtCHXs

2.5 蒺藜苜蓿CHX基因家族順式作用元件分析

為深入了解蒺藜苜蓿CHX的功能，對其上游啟動子2000 bp序列進行順式作用元件分析（圖7和圖8）。除了大量的核心元件TATA-box和CAAT-box，還包括較多的光響應和激素響應元件。其中光響應元件包含AE-box、G-box、TCT-motif、TCCC-motif、GATA-motif、GA-motif等23種。激素響應元件包括調(diào)控赤霉素、生長素、脫落酸、水楊酸和茉莉酸甲酯響應元件，以茉莉酸甲酯響應元件數(shù)量居多。同時，還包括調(diào)控細胞周期、晝夜節(jié)律、類黃酮生物基因合成、光敏色素表達在內(nèi)的細胞活動調(diào)控元件，以及胚乳表達、分生組織表達、種子發(fā)育、柵欄葉肉細胞生長相關的植物組織表達響應元件。此外，厭氧、缺氧特異性誘導、低溫響應元件LTR、干旱誘導元件MBS、創(chuàng)傷響應元件WUN-motif、防御與應激響應元件TC-rich repeats也存在于MtCHXs啟動子區(qū)。其中，MtCHX19.2啟動子區(qū)順式作用元件數(shù)量最多，可能在生長發(fā)育和脅迫應答方面起到關鍵調(diào)控作用。

圖7 蒺藜苜蓿CHX基因家族啟動子順式作用元件分布Fig.7 Distribution of the putative cis-acting elements predicted in promoters of MtCHXs

圖8 蒺藜苜蓿CHX基因家族啟動子順式作用元件分析Fig.8 Analysis of the putative cis-acting elements in MtCHXs promoter regions

2.6 蒺藜苜蓿CHX基因家族表達特性分析

進一步基于公共數(shù)據(jù)庫對47個MtCHX組織表達特性進行分析（圖9）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MtCHXs主要表達在花中，可能參與調(diào)控生殖生長。GroupⅢ整體上在花中都有較高的表達量。序列及基因結(jié)構(gòu)都極度相似的同源基因MtCHX3.8、MtCHX3.10、MtCHX4.1、MtCHX4.2呈現(xiàn)的組織表達模式也有很高的相似度，在葉、根、根瘤和莢中表達量高于其他組織，而在營養(yǎng)芽和莖中表達量低。GroupⅣ中成員根據(jù)同源關系遠近，呈現(xiàn)相似的表達模式，如MtCHX23.5和MtCHX 23.6這兩個基因雖不是同源基因，卻有相同的組織表達模式，主要在種子和根瘤中表達。

圖9 蒺藜苜蓿CHX基因家族組織表達特性分析Fig.9 Expression profile of MtCHXs genes in different tissues

除去沒有數(shù)據(jù)的成員，圖10顯示了14個蒺藜苜蓿CHX基因脅迫表達情況。GroupⅣa、GroupⅡb和GroupⅢ的大部分成員在遭受低溫脅迫（包括冷害和凍害）時仍能保持較高表達量。在遭受冷害和凍害脅迫時，GroupⅢ、GroupⅡb以及大部分GroupⅣa成員（尤其是MtCHX18.1）均呈上調(diào)趨勢，而GroupⅣ的MtCHX20.3/15.7/23.5均呈下調(diào)表達。干旱脅迫下，只有GroupⅣa的MtCHX20.1和MtCHX20.3呈上調(diào)表達，而GroupⅣb的MtCHX15.7表達量下降。鹽脅迫下，GroupⅢ和GroupⅡb成員上調(diào)表達，而GroupⅣ均呈現(xiàn)下調(diào)表達。ABA處理后，除GroupⅣa的MtCHX18.3略有上調(diào)外，其余均是下調(diào)表達。綜上，GroupⅣb的MtCHX15.7表達情況與其他成員有差異，其在受到ABA處理、鹽、低溫和干旱脅迫時表達量均呈下調(diào)表達趨勢，而其他成員至少在遭受一種非生物脅迫時會呈現(xiàn)表達量上調(diào)。上述結(jié)果說明MtCHXs參與抗鹽、抗寒、抗旱和應答ABA處理。

圖10 蒺藜苜蓿CHX基因家族非生物脅迫表達模式分析Fig.10 Expression patter n of MtCHXs genes in r esponse to various abiotic stress

3 討論

廣義的農(nóng)業(yè)是包括農(nóng)、林、牧、副、漁和養(yǎng)殖［29］。我國疆域遼闊，農(nóng)業(yè)的各個行業(yè)都發(fā)展得如火如荼，苜蓿享有“牧草之王”的美譽，在畜牧業(yè)發(fā)展中具有重要作用。隨著環(huán)境問題日益嚴重，畜牧業(yè)面臨的最大問題便是草原退化及牧草越冬艱難，改進牧草品種品質(zhì)，培育抗寒抗旱牧草，對畜牧業(yè)的發(fā)展也相當重要。環(huán)境惡化加劇加上政府支持，通過苜蓿生物信息學分析挖掘抗逆關鍵調(diào)控基因，解析抗逆應答學分子機制，培育抗逆苜蓿新品種已刻不容緩［30］。

蒺藜苜蓿作為豆科作物的模式植物，早在1994年，其基因組序列已公布［31］。隨著基因組學和生物信息學的蓬勃發(fā)展，越來越多的蒺藜苜?；蚣易灞昏b定分析，如蒺藜苜蓿MtCAO［32］、PYL［33］、TCP［34］、DUF221［35］等基因家族，為后續(xù)苜?？鼓骊P鍵調(diào)控基因的挖掘和功能解析提供理論依據(jù)。

本研究利用生物信息學，在全基因組范圍內(nèi)鑒定得到47個蒺藜苜蓿CHX基因家族成員。根據(jù)已有研究將其分為5組，為GroupⅠ至GroupⅤ。擬南芥CHX家族有28個成員，水稻CHX家族有17個成員，大豆CHX家族有40個成員，蒺藜苜蓿CHX家族成員數(shù)量幾乎達到擬南芥與水稻的兩倍，與大豆數(shù)目差不多，成員之間相似度特別高，其中有幾個成員的序列相似度達到了99.31%，與擬南芥CHX成員相似度也較高。蒺藜苜蓿CHX基因家族成員在染色體上分布較為分散，說明了在進化過程中存在遺傳變異［36］。在進行同源性分析時發(fā)現(xiàn)，苜蓿CHX基因內(nèi)部存在大量旁系同源關系，物種內(nèi)部的旁系同源是指物種分化后經(jīng)基因復制產(chǎn)生新基因［37］，說明苜蓿CHX內(nèi)存在大量復制關系。幾個成員之間存在互相復制關系，導致了多個基因簇的形成，在進化過程中，新成員的產(chǎn)生可能來自老成員的片段復制［11］。47個成員全部定位在質(zhì)膜上，這有利于它們進行離子的轉(zhuǎn)運，進而發(fā)揮功能。系統(tǒng)發(fā)育分析中發(fā)現(xiàn)苜蓿CHX家族與擬南芥和大豆的特性相同，GroupⅡ中成員分別是各物種所特有的，這也說明了CHX家族進化的保守性［38］。

在遭受外界刺激時，植物會調(diào)動元件啟動各種響應來應對刺激［39］。蒺藜苜蓿CHX家族在啟動子處有多種順式作用元件，干旱和低溫響應元件說明基因表達受非生物脅迫調(diào)控，激素響應元件說明基因表達受植物生長發(fā)育影響［40］。DNA位點的多樣性使基因功能多樣性，但也可能導致功能冗余［41］。劉佳佳等［42］研究發(fā)現(xiàn)，MYB（vmyb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）轉(zhuǎn)錄因子可以特異性調(diào)控類黃酮合成，蒺藜苜蓿CHX家族成員的啟動子處，MYB轉(zhuǎn)錄因子不止能特異性結(jié)合類黃酮生物合成基因調(diào)控MYB結(jié)合位點（MYB binding site consensus I，MBSI）參與類黃酮生物合成基因的調(diào)控，還能結(jié)合元件MYB結(jié)合位點（MYB binding site，MBS）特異性誘導干旱響應。水楊酸參與植物的抗病過程并發(fā)揮重要作用［43］，21個成員中有參與水楊酸響應的元件TCA-element，這21個成員均勻的分布在5個分組中。MtCHX3.5啟動子區(qū)含有大量的茉莉酸甲酯調(diào)控元件，可能這個基因的表達會受到茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）通路的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的MeJA可以通過提高植物的過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等酶活性來清除體內(nèi)活性氧，進而增強植物的耐逆性［44］。在低溫脅迫時，根系各氧化酶的活性不盡相同。苜蓿對低溫脅迫的耐受程度，與其根頸部的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性與CAT酶活性呈正相關［45］。在受到非生物脅迫時，根系氧化物的酶活性根據(jù)環(huán)境改變有所變化，結(jié)合或釋放離子，從而維持細胞膜上離子平衡［46］。蒺藜苜蓿CHX家族中有22個成員分別有1～3個參與低溫響應的元件，其中遭受冷脅迫和在根中表達量較高的幾個成員均有該元件。

在非生物脅迫下表達量仍舊與未處理相持平的幾個基因，除MtCHX15.7只有3′-UTR區(qū)、MtCHX23.5只有5′-UTR區(qū)，其他基因都具有3′-UTR區(qū)和5′-UTR區(qū)。非編碼區(qū)既然不能表達參與功能結(jié)構(gòu)，便預測其起到占據(jù)空間保護表達元件的作用。GroupⅢ中成員整體上在各種條件下的表達量均高于其他分組，這與前人的研究一致。大豆CHX家族GroupⅣ中同源基因GmCHX18.1和GmCHX18.2有相似的組織表達模式［11］，葡萄（Vitis vinifera）CHX家族GroupⅣ中同源基因Vv CHX16與VvCHX18有相似的表達模式，GroupⅠ中同源基因VvCHX4和VvCHX5也具有相似的表達模式［47］。蒺藜苜蓿CHX在GroupⅣ中也有一對基因表達模式相似，此外，在GroupⅡ中更是有4個同源基因有著相似的表達模式。特別是MtCHX4.3與MtCHX3.10在序列、結(jié)構(gòu)、順式作用元件組成分布上都極其相似。這些基因在非生物脅迫下的表達情況，說明CHX在響應鹽、干旱及低溫脅迫應答方面有重要作用。

4 結(jié)論

本研究基于生物信息學的方法，在全基因組水平下分析了蒺藜苜蓿CHX基因家族的序列、結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、復制關系、順式作用元件及表達水平。鑒定了蒺藜苜蓿CHX基因家族成員47個，分布在8條染色體上，其中有一個成員未定位在染色體上。將47個成員分為5組，其中GroupⅡb成員是苜蓿所特有的基因。蒺藜苜蓿CHX基因家族內(nèi)旁系同源關系較多，存在大量復制關系，且與擬南芥親緣關系較近，與水稻較遠。有較多的參與光響應和激素響應的順式作用元件，還有與干旱、低溫等非生物脅迫相關的元件。GroupⅢ及GroupⅣa中成員整體上表達量均高于其他分組。低溫脅迫下大多數(shù)成員表達量與未脅迫時相當，說明CHX家族在植物耐寒耐旱及耐鹽中起著重要作用。蒺藜苜蓿CHX成員在花和莢中的表達量較高，說明可能參與植物生殖生長。