除草劑芐嘧磺隆降解菌Hansschlegelia zhihuaiae S113菌劑的研發(fā)①

滕 曉，徐銘陽，李錦濤，田雁寧，陳 洋，黃 星

除草劑芐嘧磺隆降解菌Hansschlegelia zhihuaiae S113菌劑的研發(fā)①

滕 曉，徐銘陽，李錦濤，田雁寧，陳 洋，黃 星*

(南京農業(yè)大學生命科學學院，南京 210095)

磺酰脲類除草劑芐嘧磺隆殘留期較長，造成農田土壤的殘留污染問題。以芐嘧磺隆高效降解菌株S113為材料制備降解菌劑，優(yōu)化液體菌劑的保護劑種類與配比，篩選固體菌劑的最佳載體，初步應用固體菌劑并評價修復效果。研究結果表明：①向液體菌劑中添加合適的保護劑(0.30% 檸檬酸鈉、0.20% 羧甲基纖維素、0.10% CaCl2)可使活菌數提高37.25%，保存30 d的液體菌劑對50 mg/L芐嘧磺隆的降解率為94.25%；②篩選出豬糞有機肥為固體菌劑的最佳載體，保存60 d時固體菌劑活菌數為7.45×107cfu/g，對土壤中10 mg/kg芐嘧磺隆的降解率為91.22%；③固體菌劑的添加可有效減輕土壤中芐嘧磺隆殘留對玉米的藥害。

S113；芐嘧磺??；菌劑；微生物修復

通過施用除草劑來提高單位面積糧食產量是現代農業(yè)生產的重要舉措之一。芐嘧磺隆因其殺草譜廣、生物活性高等特點，被廣泛應用于稻田雜草防除[1-2]。其機制為抑制植物體內乙酰乳酸合成酶活性，從而阻斷支鏈氨基酸的合成，最終達到除草的目的[3]。芐嘧磺隆的土壤半衰期長達數月到一年以上，田間生產中由于其長期大量施用，在土壤中沉積，造成了比較嚴重的殘留問題[4]。芐嘧磺隆殘留物會影響后茬作物的出苗率和產量，降低土壤菌群群落結構

多樣性，通過滲透等方式進入水體后，在直接影響大型水生植物和浮游藻類的同時，給魚類等非靶標生物帶來一定的毒理效應[5-6]。微生物代謝在芐嘧磺隆除草劑的降解過程中起到關鍵作用，通過合理運用農藥殘留高效降解菌株，有望改善土壤中芐嘧磺隆的殘留污染問題[7-8]。

目前，將微生物修復土壤農藥殘留投入實際應用的主要途徑是將農藥殘留高效降解菌株加工成為液體劑型或固體劑型。液體劑型的特點是生產耗時短、工序少，菌種純度高，但在運輸和保存的過程中菌種易失活[9-11]。通過添加保護劑以提供營養(yǎng)物質、減小胞內外滲透壓、防止雜菌污染等，可延長液體菌劑的貨架期，常用的保護劑類型有糖類、氨基酸、表面活性劑、大分子有機物等[12-13]。研發(fā)降解菌劑的固體劑型一方面可以提高菌劑穩(wěn)定性而有利于保藏和運輸，另一方面可以促進廉價農副產品的資源化利用[14]。目前國內外固體菌劑的制備方法多樣，如凍干法、包埋法、交聯(lián)法、載體吸附法等，綜合考慮制備成本和應用場景，本研究選用載體吸附法制備芐嘧磺隆降解菌株的固體劑型[15]。在應用方面，微生物降解作為一種理想的污染降解技術，近年來已成為水體污染和土壤污染治理領域的研究熱點。隨著對微生物菌劑作用機理的深入研究和應用經驗的總結，其在土壤修復領域中的開發(fā)和應用前景廣闊[16]。

S113是本實驗室分離保藏的一株磺酰脲除草劑高效降解菌，其編碼的水解酶基因sul E，能通過去酯化反應將噻吩磺隆、甲磺隆、氯嘧磺隆等含有酯結構的磺酰脲除草劑轉化為相應的無除草活性的酸，其中對芐嘧磺隆的降解效率為80.9%[17]。本研究以S113為供試菌株，優(yōu)化液體菌劑保護劑的配比參數，篩選固體菌劑的最佳載體，并利用玉米苗期試驗初探固體菌劑的修復效果，以期為土壤芐嘧磺隆的污染修復提供修復制劑及理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、材料與培養(yǎng)基

芐嘧磺隆購自上海源葉生物科技有限公司(純度98%)，供試菌株S113由本實驗室分離并保藏。供試載體包括泥炭、米糠、秸稈肥、花生殼粉、雞糞有機肥、蚯蚓糞有機肥、豬糞有機肥，均自然風干3 d并過40目篩，121 ℃ 高溫滅菌2次后備用。供試玉米品種為“美玉4號”。供試土壤取自南京農業(yè)大學牌樓實驗基地(32°03′N，118°86′E)，壤質黏土，未施用過芐嘧磺隆等除草劑。取樣時去掉表層土，將土樣去除雜物后風干待用。

LB培養(yǎng)基：酵母浸出物5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，pH 7.0。TY培養(yǎng)基：酵母浸出物3.0 g，蛋白胨5.0 g，CaCl20.6 mmol/L，pH 7.2。無機鹽培養(yǎng)基：NH4Cl 1.0 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖9.0 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO40.9 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，NH4Cl 0.8 g，NaCl 0.6 g，pH 7.0 ～ 7.2。以上分別添加去離子水定容至1 L，固體培養(yǎng)基加入1.8% 的瓊脂。

1.2 液體菌劑保護劑的篩選

1.2.1 保護劑的單因素試驗 S113菌種活化后挑取單菌落于液體LB中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)至對數生長期，按1% 接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，作為發(fā)酵液。將發(fā)酵液分裝至100 ml錐形瓶中，其他條件保持一致，分別添加檸檬酸鈉、乙酸鈉、糊精、羧甲基纖維素、KCl、CaCl2等保護劑，使其終濃度分別為1、2和3 g/L，對照將保護劑替換為等體積的無菌水，每組處理設3個重復，常溫避光保存30 d后計算菌株存活提高率。存活提高率(%)=(處理組活菌數–對照組活菌數)/對照組活菌數×100。

1.2.2 保護劑最佳組合的篩選 根據單因素試驗的結果，將優(yōu)化出的保護劑分為3類：A，有機物(檸檬酸鈉和乙酸鈉)；B，穩(wěn)定劑(糊精和羧甲基纖維素)；C，無機鹽(KCl和CaCl2)，作為3個因素，每類保護劑選擇上述兩種物質作為兩個水平，進行三因素兩水平L4(23)的正交試驗。

1.2.3 保護劑組合的最佳濃度篩選 根據三因素兩水平試驗篩選出的最佳保護劑組合，選擇3種保護劑(A：檸檬酸鈉；B：羧甲基纖維素；C：CaCl2)作為3種因素，每種保護劑設置3個終濃度作為3種水平，進行三因素三水平L9(33)正交試驗篩選最佳使用濃度組合。

1.3 液體菌劑對除草劑的降解效果

將優(yōu)化出的4個最佳保護劑組合分別添加到S113發(fā)酵液中，常溫避光保存30 d后，按2% 接種量加入到終濃度50 mg/L芐嘧磺隆的20 ml無機鹽培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)3 d后，使用HPLC測定芐嘧磺隆濃度，并計算降解率。高效液相色譜條件：色譜柱為Thermo scientific AcclaimTM120 C18(4.6 mm × 250 mm)，流動相為乙腈和水(/=60/40，水中加入1% 乙酸)，柱溫40 ℃，流速1 ml/min，檢測波長280 nm，進樣量20 μl。降解率(%)=(芐嘧磺隆初試濃度–終濃度)/初始濃度×100。

1.4 液體菌劑的保存效果

將優(yōu)化出的最優(yōu)保護劑組合添加至S113發(fā)酵液中，常溫保存30、60 d后進行梯度稀釋涂布，培養(yǎng)3 d后計算活菌數。

1.5 固體菌劑載體的篩選

1.5.1 不同載體對菌株生長的影響 S113菌液以2% 接種量接入100 ml TY液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)至對數生長期。菌液5 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌3次重懸菌體，作為種子液。各取2 g載體加入20 ml滅菌水，30 ℃、160 r/min搖床振蕩24 h，得到載體懸濁液。將100 μl S113種子液接種至5 ml載體懸濁液中，再次振蕩培養(yǎng)，于第2、4 天取樣測定不同載體處理下的活菌數，試驗設置3個平行，判斷載體對菌株生長的影響。

1.5.2 固體菌劑有效菌釋放率的測定 稱取各固體菌劑2 g至含有18 ml無菌水的滅菌三角瓶中，渦旋混勻后進行梯度稀釋，取100 μl均勻涂布于固體LB，培養(yǎng)并計算有效菌釋放率。有效菌釋放率(%)=固體菌劑釋放的有效菌數量/初始接種菌數量(cfu)×100。

1.6 固體菌劑的保存效果

將各固體菌劑常溫保存30、60 d，對其分別進行稀釋涂布，30 ℃ 培養(yǎng)3 d后測定活菌數。

1.7 固體菌劑對除草劑的降解效果

供試土壤中加入芐嘧磺隆使其含量為10 mg/kg，充分混勻后常溫靜置5 h，將固體菌劑以質量比1︰9與上述土壤充分混勻，裝入黑色塑料杯中置于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為：光照12 h、溫度26 ℃，黑暗12 h、溫度20 ℃(24 h交替進行)。通過補加水分調節(jié)土壤含水量為25% ～ 30%，在第1、3、5和7 天分別取5 g土樣檢測芐嘧磺隆殘留量。同時設置不加固體菌劑的對照組，對照與處理均設3個重復。

1.8 固體菌劑的應用

分別稱取500 g供試土壤于0.7 L盆缽中，玉米種子消毒萌發(fā)后，挑取長勢一致的3顆發(fā)芽種子移栽至盆缽，設置正常土壤空白對照、10 mg/kg芐嘧磺隆、10 mg/kg芐嘧磺隆+10% 固體菌劑的3組處理，置于培養(yǎng)箱中如步驟1.7中所述條件培養(yǎng)，期間補加水分調節(jié)土壤含水量為25% ～ 30%，第14 天隨機取樣，測定根長、莖葉長、鮮重等生理指標。

1.9 數據統(tǒng)計與分析

使用Microsoft ExcelTM軟件對數據初步處理，采用IBM SPSS statistical Ver. 25.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 液體菌劑保護劑的篩選

2.1.1 保護劑的單因素試驗 如表1所示，各保護劑在各濃度梯度均能不同程度地提高菌株存活率。保護劑有效使用濃度與存活提高率呈正相關，各保護劑均在濃度為3 g/L時效果最佳，1 g/L的使用濃度時活菌提高率均在10% 以下。其中，3 g/L的KCl對S113的存活提高率最高，為24.71%。

2.1.2 保護劑最佳組合的篩選 如表2，通過分析極差值發(fā)現各因素對菌株S113存活提高率的影響作用順序為：C>B>A，即無機鹽的影響較為顯著，穩(wěn)定劑和有機物影響程度次之。綜合分析3種因素的值，其最優(yōu)水平是A1B2C2，即與其他物質組合相比，檸檬酸鈉、羧甲基纖維素、CaCl2組合對菌株生長影響最大。由活菌提高率結果可知，該組合對菌株保護效果最佳，為26.57%。因此，選擇該組合作為最佳保護劑組合開展后續(xù)濃度配比的研究。

表1 液體菌劑保護劑對菌株S113的影響

表2 菌株S113液體菌劑保護劑最佳物質組合正交表

2.1.3 保護劑組合的最佳濃度篩選 不同的濃度組合對S113活菌數的提高效果差異明顯。由表3，各因素間的主次順序為：A>B>C，最優(yōu)水平為A3B2C1，即3 g/L的檸檬酸鈉、2 g/L的羧甲基纖維素和1 g/L的CaCl2。且該濃度組合下的菌株存活提高率為37.25%，保護效果最佳。由此確定該濃度組合為S113液體菌劑保護劑的最佳使用濃度組合。

表3 菌株S113液體保護劑的濃度組合正交表

2.2 液體菌劑對除草劑的降解效果

將在上述濃度篩選試驗中存活提高率較高的保護劑濃度組合1、2、3和8進行芐嘧磺隆降解效果驗證。如圖1，加入4種保護劑保存30 d后的S113液體菌劑對芐嘧磺隆的降解效果均高于對照組，降解率均達到80%左右，由此可見，提高活菌數可有效提高降解菌劑的降解效果。其中，組合2對芐嘧磺隆降解率最高，達94.25%，組合8對芐嘧磺隆降解率為79.49%。綜合考慮液體菌劑的活菌數與降解率，認為組合8為S113液體菌劑的最佳保護劑組合。

圖1 不同保護劑組合對芐嘧磺隆的降解效果

2.3 液體菌劑的保存效果

對已篩選出的最佳保護劑組合8進行S113液體菌劑的保存試驗。如圖2，在沒有保護劑的情況下，活菌數在30 d內即出現明顯下降，由109cfu/ml下降至104cfu/ml。而隨著保存期的延長，添加了3 g/L檸檬酸鈉、2 g/L羧甲基纖維素和1 g/L CaCl2保護劑的液體菌劑仍保持較高的生物量，60 d活菌數仍達到4.53×107cfu/ml。篩選得到液體菌劑的最佳保護劑組合，可以在儲存期內將活菌數維持在較高水平，從而延長液體降解菌劑的貨架期，確保其在有效期內施用的降解效果。

圖2 S113液體菌劑儲存期內活菌數變化

2.4 固體菌劑載體的篩選

2.4.1 不同載體對菌株的影響 如圖3，向各載體中接種S113后，菌株均可生存及繁殖。儲存4 d后發(fā)現豬糞有機肥載體中所含活菌數最高，達到4.73×108cfu/g，米糠和泥炭所含活菌數較少，為1.35×108cfu/g左右。豬糞有機肥等載體本身含有其他類型載體無法提供的豐富有機質，可以為菌體生長提供良好的環(huán)境和營養(yǎng)，以便后續(xù)試驗的開展。研究表明，有機肥配合微生物菌劑的施用模式不僅能夠達到降解效果，還能部分替代化肥，減少環(huán)境污染[18]。

圖3 不同載體對菌株S113生長的影響

2.4.2 固體菌劑有效菌釋放率的測定 固體菌劑中微生物的釋放率決定了菌劑能否最大化地發(fā)揮效用，是除活菌數之外衡量固體菌劑質量的重要指標。如圖4，豬糞有機肥載體的有效菌釋放率最高，為96.67%，秸稈肥的有效菌釋放率最低，僅為33.70%。豬糞有機肥作為載體不僅活菌數最高，其釋放率也最好，認為可作為固體菌劑載體的最佳候選?？梢钥闯?，同一菌種在不同載體中的釋放量存在明顯差異，釋放量過低可能是由于載體內部微孔結構中可利用的有效營養(yǎng)物質太少而導致微生物無法生存。

圖4 不同載體中菌株S113的有效菌釋放率

2.5 固體菌劑的保存效果

菌劑載體是微生物生存的微環(huán)境，合適的載體通過改變其傳質特性以保持微生物活性。如圖5所示，隨著固體菌劑儲存期的延長，幾種載體中的活菌數均呈現不同程度的下降趨勢。30 d和60 d時，活菌保存效果最好的均為豬糞有機肥，所含S113活菌數均保持在107cfu/g以上?；罹鷶底鳛樵u估固體菌劑質量的首要指標，在后續(xù)的降解試驗和應用中都將優(yōu)先考慮。

2.6 固體菌劑對除草劑的降解效果

圖6為保存30 d后的各固體菌劑對芐嘧磺隆的7 d內降解情況。添加各固體菌劑后，土壤中芐嘧磺隆降解率均明顯上升。在相同條件下CK降解率只能達到13.86%，而4組固體菌劑的7 d降解率都高于80%，其中以豬糞有機肥為載體的固體菌劑降解效果最優(yōu)，為91.22%。綜合考慮保存期活菌數和降解效果，選擇以豬糞有機肥為載體的固體菌劑開展后續(xù)初步應用。

圖5 S113固體菌劑不同載體的活菌數變化

圖6 S113固體菌劑對芐嘧磺隆的降解

2.7 固體菌劑的應用

由表4可知，除草劑對玉米產生了持續(xù)的藥害，除草劑處理組在培養(yǎng)期內玉米根系長度、莖葉長度等指標均顯著低于其他處理。向含有除草劑殘留的盆缽中加入固體菌劑，14 d后，作物各生理指標與CK相近，認為施加固體菌劑可有效降解土壤中除草劑殘留，減輕作物所受藥害。

表4 S113固體菌劑對玉米除草劑藥害的解除作用

注：同列小寫字母不同表示處理間差異達<0.05顯著水平(鄧肯檢驗)。

3 討論

微生物液體菌劑因其制備工藝簡單、易于噴施、生產成本低等特點被廣泛應用于畜牧業(yè)、廢水處理、水產養(yǎng)殖中。液體菌劑中的微生物活性主要受溫度、紫外線照射和雜菌污染等因素影響，在微生物液體菌劑中添加保護劑有利于菌體的代謝和生存。篩選出的液體菌劑保護劑中，檸檬酸鈉屬于典型的防腐劑，也稱抑菌劑。抑菌劑的作用原理一方面是借助本身的親油性，阻礙細胞膜對氨基酸的吸收；另一方面可以通過調節(jié)環(huán)境pH，抑制微生物的呼吸酶活性，起到防腐作用[19]。試驗表明，將檸檬酸鈉控制在合理范圍時，對S113菌株的生長代謝并未產生抑制作用，可以作為S113菌株的菌劑保護劑。研究表明微生物失活的根本原因在于，菌體與外界環(huán)境直接接觸后，空氣或水中的氧激活酶活性中心，產生羥自由基和超氧陰離子，發(fā)生氧化還原反應破壞細菌細胞的代謝增殖[20-21]。篩選出的羧甲基纖維素充當穩(wěn)定劑成分，可以在菌體周圍形成一層以纖維素多糖為主要成分的抗氧化保護膜，避免菌體直接暴露于環(huán)境而迅速失活。CaCl2能夠通過調節(jié)細胞滲透壓維持酶結構及功能，緩解外界環(huán)境對菌體產生的脅迫，達到保護目的[22]。此外，諸多研究表明，添加鈣離子可以有效降低細菌細胞壁損傷程度，通過增加細胞膜的不飽和脂肪酸含量以保持膜的流動性和通透性，從而提高細菌存活率、增強貯藏穩(wěn)定性[23-24]。本研究中，檸檬酸鈉、羧甲基纖維素和CaCl2在3個不同的層面保護S113菌體，三者協(xié)同互補，以延長液體菌劑儲存期。

微生物資源的劑型化是高效利用微生物及其代謝產物的重要方式。微生物菌劑的主要成分是活體生物，只有保證高生物量和生物活性的前提下，才能在真正施用時達到理想的降解效果[25]。本研究表明，S113固體菌劑最佳載體豬糞有機肥在活菌數和有效菌釋放率指標方面均最高，菌劑保存試驗和芐嘧磺隆降解試驗中同樣表現良好。此外，豬糞有機肥是無害化處理出料后經高溫發(fā)酵生產出的安全、優(yōu)質有機肥料，不僅作為微生物菌劑的良好載體，而且含有豐富的可溶性有機質，能夠部分替代化肥，提高作物氮素、磷素、速效鉀等利用率[26]。在微生物菌劑載體的篩選過程中，同一載體對于不同性質的微生物的生物相容性可能相去甚遠，因此菌劑最佳載體的選擇往往需要具體分析兩者的匹配程度[27]。

目前，微生物固體菌劑已廣泛應用于農業(yè)生產中，在改善作物生長、提高產量、增加作物抗逆性等方面效果顯著。微生物菌劑在田間施用時，需要在一定的濃度范圍內有效定殖并建立起優(yōu)勢種群才能發(fā)揮其生物作用[28]?；罹鷶怠⒅苿╊愋?、性質和貯存條件以及田間環(huán)境等諸多因素影響著農用微生物制劑的應用，科學合理地評價這些影響，并研究其形成原因和內在規(guī)律，有益于微生物制劑的深入研究開發(fā)，本研究為利用不同類型微生物制劑修復芐嘧磺隆污染土壤提供了理論基礎和應用依據。

4 結論

芐嘧磺隆降解菌S113液體菌劑添加合適的保護劑(3 g/L檸檬酸鈉、2 g/L羧甲基纖維素、1 g/L CaCl2)后，活菌數提高37.25%，保存30 d對50 mg/L芐嘧磺隆的降解率為94.25%，保存60 d活菌數仍達4.53×107cfu/ml。篩選得到固體菌劑的最佳載體為豬糞有機肥，保存60 d活菌數為7.45×107cfu/g，對土壤中10 mg/kg芐嘧磺隆的降解率為91.22%。玉米苗期試驗表明，芐嘧磺隆殘留對玉米生長產生嚴重藥害，添加固體菌劑可有效減輕藥害作用。

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Study of Bensulfuron-degrading StrainS113 Microbial Agents

TENG Xiao, XU Mingyang, LI Jintao, TIAN Yanning, CHEN Yang, HUANG Xing*

(College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Sulfonylurea herbicide bensulfuron-methyl has a long residue period, which causes residual pollution in farmland soil. In this study,S113 was used as the material to prepare microbial agents, the preservation conditions of liquid agent were optimized, the best carrier of solid agent was screened and preliminary application of the agent was taken. The results show that : 1) Adding suitable protective agents (0.30% sodium citrate, 0.20% carboxymethyl cellulose, 0.10% CaCl2) to liquid agent can increase the number of viable bacteria by 37.25%, and the 50 mg/L bensulfuron can be degraded by 94.25% after stored for 30 days. 2) Pig manure fertilizer is screened as the best carrier of solid agent. After 60 days of storage, the viable bacteria number is 7.45×107cfu/g, bensulfuron-methyl can be degraded by 91.22%. 3) The addition of solid bacterial agent can effectively reduce the bensulfuron-methyl toxicity to the maize.

S113; Bensulfuron-methyl; Microbial agent; Microbial remediation

X172

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.06.013

滕曉, 徐銘陽, 李錦濤, 等. 除草劑芐嘧磺隆降解菌S113菌劑的研發(fā). 土壤, 2022, 54(6): 1193–1200.

國家自然科學基金項目(42277016)、江蘇省重點研發(fā)計劃社會發(fā)展項目(BE2020692)和南京農業(yè)大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(202110XX06)資助。

通訊作者(huangxing@njau.edu.cn)

滕曉(1998—)，女，山東濟寧人，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物學研究。E-mail: tengxiao98@qq.com