淺談精子介導基因轉移在畜牧業(yè)中的應用

金紅梅,張 亮

吉林省龍井市智新鎮(zhèn)綜合服務中心，吉林龍井 133400

1 精子介導基因轉移的發(fā)展

1.1 精子可結合外源DNA

1944年Avery,Macleod和McCarty發(fā)現(xiàn)了DNA是遺傳信息的遺傳庫，而不是蛋白質(zhì)[1]。1953年Watson和Crick提出了DNA是雙螺旋結構，這些影響了現(xiàn)代生物學的方向，并為當前基因組學研究的暴發(fā)提供了基礎。動物體的遺傳性狀和細胞特性都可以通過在細胞內(nèi)轉移外源DNA片段來修飾。利用外源DNA對細胞性狀進行基因修飾的實驗反映了自然界中目前存在的一種稱為水平或橫向基因轉移的現(xiàn)象，它包括遺傳信息跨越遠親生物（如真核生物和低等真核生物）之間的交配障礙的傳遞，隨著不斷地研究，動物中也有報道[2]。

在眾多已被證明可接受轉染的細胞中，成熟的精子一直是一個例外。精子細胞在基因傳遞實驗中沒有被測試為可能的受體細胞，甚至在理論上也沒有被認為是外源DNA傳染的合理候選者。這種先入為主的排斥長期以來一直沒有受到科學界的質(zhì)疑，但后來被認為是一種不需要實驗證明就能解釋的證據(jù)，即精子是高度緊湊的細胞、代謝緩慢、外源分子幾乎無法穿透。這種觀點是由于精子與其它體細胞在細胞形態(tài)上截然不同導致的，這種形態(tài)上的不同包括：提供運動能力的長管狀鞭毛，其內(nèi)幾乎完全無細胞質(zhì)、高度濃縮的染色質(zhì)組織緊密包裹在精子頭部的核-精蛋白復合體。這些獨特的結構特征似乎與復雜的生物化學功能或細胞活動不相容，這導致了精子是代謝緩慢細胞的想法[3]。其獨特的和唯一的功能是受精過程中傳遞父系基因組。隨著對精子細胞深入研究，應用微球菌和胰腺核酸酶消化法處理海膽精子染色質(zhì)組織中發(fā)現(xiàn)，無論是使用基于細胞核分離的經(jīng)典方案，還是通過簡單地將核酸添加到緩沖的海水中（完整的精子具備活性），染色質(zhì)裂解都能同樣良好地產(chǎn)生，在后一種情況下，精子迅速停止移動，DNA提取后，產(chǎn)生經(jīng)典的核小體。這些觀察結果表明，在沒有任何處理精子的情況下，添加到培養(yǎng)基中的核酸酶能夠穿過血漿和核膜，并獲得活精子的染色體DNA。

1.2 精子具有結合外源DNA的能力

盡管精子的轉錄狀態(tài)明顯是惰性的，但它實際上儲存了大量的異質(zhì)RNA種群，其中包括數(shù)前信使RNA和micRNA。成熟精子中轉錄序列的鑒定與異質(zhì)RNA也存在轉錄因子集合的發(fā)現(xiàn)是一致的，這種RNA的一部分被認為是通過線粒體核糖體裝備在精子細胞內(nèi)，另一部分則是在受精時被傳遞到卵母細胞中，這意味著精子對合子的貢獻不限于父代的基因組，還包括基本的RNA細胞[4]。事實上，現(xiàn)在人們已經(jīng)承認受精過程中精子在遺傳信息的傳遞過程中扮演者重要的作用及角色。例如，發(fā)現(xiàn)精子RNA分子可介導小鼠表觀遺傳性狀的非孟德爾遺傳，就引出了這種復雜的作用。此外，精子內(nèi)源性逆轉錄酶依賴機制可以在整個發(fā)育過程中產(chǎn)生和繁殖具有轉錄能力的逆轉錄基因。

轉基因動物：是指應用特定的轉基因方法改變動物遺傳信息進而導致表觀特征的發(fā)生改變?，F(xiàn)今，轉基因動物廣泛的應用于臨床疾病的診治及藥物的開發(fā)中，小鼠作為臨床上應用最為廣泛及常見的動物模型，有著諸多的局限性。例如，壽命、體型、生理及病理特性和組織結構等。而豬和牛作為大型哺乳類動物，在生理及病理學上更加接近人，為人類疾病的研究及診治提供了更好的生物模型。因此開發(fā)出穩(wěn)定便捷高效的轉基因技術，生產(chǎn)出大型轉基因哺乳動物可進一步了解疾病的發(fā)病機理及機制，為治療提供了有效的動物模型。

SMGT是基于精子在受精過程中結合、內(nèi)化和轉運外源DNA到卵母細胞的能力。研究表明，精子可自發(fā)的與外源DNA結合并將其轉運到卵母細胞，后代可表達外源DNA。SMGT或多或少的參與了轉基因胚胎和動物的生產(chǎn)，雖然已經(jīng)使用SMGT獲得了轉基因動物，但這種技術的重復性極低[5]。此外，外源性DNA在精子內(nèi)結合和轉化的機制、受精時的傳播方式及外源DNA在胚胎、胎兒和后代中的持久性，這些問題尚未完全闡明。

2 畜牧業(yè)中SMGT的應用

2.1 精子介導轉基因牛的生產(chǎn)

在轉基因牛的生產(chǎn)中，外源性DNA可與精子結合，應用SMGT技術可繁育出轉基因胚胎或犢牛，但外源性DNA與精子的結合和內(nèi)化機制尚不明確，且生產(chǎn)出轉基因動物的效率極低、相關研究結論差異較大。為增加介導效率及探究作用機制，人們應用電穿孔轉染、化學轉染試劑（脂質(zhì)體、FuGene6）方法來增加外源DNA進入精子的吸收和融和能力。Gagne等應用電穿孔轉染方法增強了外源DNA進入牛精子的能力，且使質(zhì)粒結合的百分比增加了5倍。Rieth等也得出了相似的結果，但發(fā)現(xiàn)電穿孔轉染后精子活力明顯下降。Hoelker等研究表明，脂質(zhì)體處理并不能提高精子結合外源DNA的能力，但應用FuGene6可顯著提高結合能力。但也有報道表明，脂質(zhì)體或FuGene6均能提高轉染率，這兩種不同的處理方法對卵裂率和囊胚率均無影響，盡管應用FuGene6時，轉染率提高了7～8倍。根據(jù)以上結果表明，精子質(zhì)膜的脂質(zhì)結構可能影響外源DNA的結合。

在已經(jīng)確認影響SMGT效率的因素中。已知哺乳動物的精漿可阻斷外源DNA的結合，附睪精子與牛精子的結合比例較高。有報道指出，液氮保存牛精子在解凍后結合外源DNA的效果高于新鮮精子，這直接導致了低溫保存誘導質(zhì)膜發(fā)生變化的假說，從而促進了外源DNA的結合和內(nèi)化。應用流失細胞儀檢測了牛精子結合外源DNA能力和活力動態(tài)，這使我們能夠確定攜帶外源DNA?；罹訑?shù)量，這些精子可以在傳統(tǒng)的體外受精或人工智能系統(tǒng)中使卵母細胞受精。這些研究表明，一部分精子可以結合外源DNA（大約15%的精子群體具備這種能力）。在結合能力研究表明，精子與外源DNA的結合可能需要超過30 min的孵育時間。然而在牛精液能更快地結合外源DNA，這個過程在30 min內(nèi)完成。這些結果表明，在授精前與外源DNA進行長時間的孵育并不是獲得最大受精結果的必要條件，特別是考慮到長時間的孵育會對精子活力產(chǎn)生負面影響。精子在與外源DNA的結合能力上，雄性精子之間觀察到顯著的差異。目前外源DNA對精子功能的影響尚不明確。運動性是精子的一種特殊特性，它對精子的生物學功能是絕對必要的。假設DNA結合對運動的負面影響可以解釋許多SMGT的失敗。之前的研究報道了與DNA效果相反的結果，已有研究報道指出牛精子與外源DNA結合后，精子運動參數(shù)曲線速度、直線速度、平均路徑速度、曲線軌跡的線性都等均降低。

2.2 精子介導轉基因豬的生產(chǎn)

近年來，轉基因豬已成為生物醫(yī)學研究的重要工具，例如異種器官移植研究及人類疾病動物模型等。但目前轉基因動物的生產(chǎn)主要依賴原核顯微注射、病毒載體及核移植技術，這些方法均需要昂貴的設備及熟練的技術，在大型農(nóng)場中使用的效率極低。因此應用SMGT在大型農(nóng)場生產(chǎn)轉基因動物是未來發(fā)展的方向。Gandolfi等在1989年首次在豬中應用了SMGT技術，并在生產(chǎn)的子代中檢測出了外源DNA表達。但往后的子代中并無轉基因動物。而Sperandio等表明通過人工授精技術，將應用SMGT方法攜帶外源DNA的精子注入母豬中，在動物胚胎中有0%～5.7%具有轉基因，且轉基因動物基因可穩(wěn)定遺傳。Lavitrano等也通過人工授精導入通過SMGT處理的精液生產(chǎn)出了轉基因動物，但在70～90 d過后外源DNA消失，他們猜測這是由于胎兒發(fā)育早期階段對DNA進行了修復。

幾種因素可以決定使用該技術的成功率，包括豬供體、使用的結構物、培養(yǎng)基等，這種技術的效率取決于所使用的結構類型和DNA數(shù)量。因此，Sciamanna等在2000年報道稱，大于50～100 ng DNA/106個精子會對胚胎產(chǎn)生致命的影響，并減少人工授精后產(chǎn)仔數(shù)量。眾所周知，外源DNA的存在會對精子功能產(chǎn)生毒性作用。但在其他的研究中發(fā)現(xiàn)，精子與外源DNA的孵育并不涉及精子參數(shù)的改變。這種不同結果的產(chǎn)生需要更多的研究進行驗證并證明。

3 結語

轉基因動物的生產(chǎn)對人類疾病的診治及藥物開發(fā)具有重要意義，且對畜牧業(yè)動物的發(fā)展具有促進作用。目前生產(chǎn)轉基因動物所需的技術過于繁瑣且價格昂貴，在大型牧場應用率極低。而應用SMGT來生產(chǎn)轉基因動物具有明顯的優(yōu)勢，是未來生產(chǎn)轉基因動物發(fā)展的方向。