非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者NK細胞的表型與功能

魏舒生，馬帥，吳成玉，吳水蕓，許克慶，陶鈞

(1.安徽理工大學第一附屬醫(yī)院(淮南市第一人民醫(yī)院)骨科，安徽 淮南 232000；2.安徽省蕪湖市第二人民醫(yī)院檢驗科，安徽 蕪湖 241000)

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(NONFH)是一種罕見的致殘性骨科疾病，通常因股骨頭細胞壞死，導致關(guān)節(jié)面塌陷最終引起髖關(guān)節(jié)破壞[1]。NONFH的病因和發(fā)病機制仍然不清楚，主要包括血運障礙、骨內(nèi)壓增高、脂質(zhì)代謝紊亂及免疫因素等學說。NONFH典型的病變過程骨壞死發(fā)生—死骨吸收—新骨形成，在骨修復和重建過程中成骨細胞和破骨細胞之間的平衡失調(diào)，破骨細胞數(shù)量及活性均強于成骨細胞，骨的吸收大于骨的再生，最終引起股骨頭塌陷變形。

免疫細胞與骨細胞有共同的起源，可直接或間接的通過RANKL/RANK/OPG通路影響骨分化，而這樣的影響又與免疫細胞亞群、細胞因子和局部因素等有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)T、B細胞均與NONFH相關(guān)，對NONFH的進展起到促進或抑制的作用。然而，尚未查到關(guān)于NK細胞在NONFH中的作用機制相關(guān)性研究?；诖?，對比研究NONFH患者與無股骨頭壞死對照組外周血及關(guān)節(jié)液中NK細胞表型變化，并測定RANKL/RANK/OPG通路表達變化，確定NK細胞在NONFH的進展過程中，起到一定的作用，豐富NONFH的免疫學機制，為早期診斷及治療NONFH提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2021年2月至2021年12月于安徽理工大學第一附屬醫(yī)院擬行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)NONFH患者10例為實驗組，其中男性6例，女性4例，平均年齡(64.70±13.63)歲，所有患者均符合NONFH診斷標準，且術(shù)后均行病理學檢查。對照組為10例同期無NONFH病史股骨骨折患者，其中男性5例，女性5例，平均年齡(58.60±15.59)歲，并經(jīng)高年資主任醫(yī)師確認。排除標準：(1)髖關(guān)節(jié)細菌性感染患者；(2)類風濕患者；(3)血沉、類風濕因子以及抗“O”升高患者；(4)合并自身免疫疾病患者；(5)近2周內(nèi)曾服用過非甾體類抗炎藥物患者；(6)癌癥患者。本研究通過安徽理工大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(2020-倫審-012)，所有實驗對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與設備

1.2.1 試劑：FITC anti-human CD3、PE anti-human CD56、APC anti-human CD337、PerCP/Cyanine5.5 anti-human HLA-DR(人類白細胞抗原-DR)(均購自BioLend公司)，人骨保護素(OPG)ELISA檢測試劑盒(上海邦奕生物)，人核因子κB受體激活因子(RANK)ELISA檢測試劑盒(上海邦奕生物)，人核因子κB受體激活因子配體(RANKL)ELISA檢測試劑盒(上海邦奕生物)。

1.2.2 設備：BD FACSCalibur流式細胞儀，振蕩器(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)，酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS 儀器型號：352型)，洗 板 機(芬蘭Thermo Labsystems 儀器型號：AC8)，離心機：微量高速離心機(國產(chǎn)儀器型號：TG16W)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國產(chǎn)儀器型號：GNP-9080型)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集：(1)外周血采集：對照組及實驗組外周血在獲得患者本人同意后于手術(shù)日當日清晨空腹狀態(tài)下采集；(2)關(guān)節(jié)液標本采集：①實驗組關(guān)節(jié)液標本于手術(shù)時采集，打開皮膚及皮下組織后，在進入關(guān)節(jié)腔前以細針穿刺抽吸關(guān)節(jié)液；②對照組關(guān)節(jié)液在腰麻起效后局部嚴格消毒，在C臂機引導下，以腰麻包導管針穿刺抽取。

1.3.2 外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclearcells，PBMC)的制備：從乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)二鉀鹽(EDTAK2)管中抽取20 μL外周血，加入CD3、CD56、CD337及Anti-HLA-DR單克隆抗體共孵育，隨后加入1 mL破紅液破紅，平衡液清洗多余單克隆抗體及破紅液后待測。

1.3.3 關(guān)節(jié)液PBMC的制備：將關(guān)節(jié)液標本經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾后離心機2800 r/min離心5 min去除上清液，加入CD3、CD56、CD337及HLA-DR單克隆抗體共孵育，隨后加入1 mL破紅液破紅，平衡液清洗多余單克隆抗體及破紅液后待測。

1.3.4 流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞亞群的分布及表型特征：將待測樣本順序經(jīng)BD Calibur流式細胞儀檢測,采用Beckman Coulter(美國)公司Kaluza 2.1版流式分析軟件進行分析。

1.3.5 ELISA檢測:ELISA實驗過程中設置標準品孔，樣本孔，空白對照孔。具體步驟：(1)標準品：將6個水平的標準品依次加入標準品孔中，每孔各50 μL；(2)樣本：在樣本孔中加入樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；(3)每孔加入酶標試劑100 μL；(4)37 ℃溫育60 min；(5)棄去液體，置于洗板機中洗板后甩干，重復3次；(6)每孔先后加入顯色劑A及顯色劑B各50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃下避光放置15 min；(7)各孔加50 μL終止液；(8)測定：通過空白孔進行調(diào)零，在450 nm波長處測量各孔的吸光度(OD值)。

1.4 統(tǒng)計學方法

計量資料以均數(shù)±標準差表示，并使用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，NONFH組和對照組之間的數(shù)據(jù)差異采用t檢驗進行分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 NONFH組NK細胞比例增加

首先我們分別對比分析10例NONFH患者與對照組外周血及髖關(guān)節(jié)液中CD3-CD56+NK細胞的比例，與對照組相比，實驗組NK細胞比例明顯升高(P<0.05)，見圖1A、圖1C,圖2A、圖2C。

2.2 NONFH組NK細胞表面天然毒性受體NKp30(CD337)表達下降

為明確NK細胞是否參與NONFH病程中免疫行為，我們測定NK細胞表面受體NKp30的表達情況，對比分析發(fā)現(xiàn)，實驗組NKp30表達較對照組明顯下降(P<0.05)，見圖1B、圖1D、圖2B、圖2D。

2.3 NONFH組NK細胞表面活化分子HLA-DR表達升高

為進一步了解NK細胞在NONFH中的活化情況，我們測定表面活化分子HLA-DR表達情況，對比發(fā)現(xiàn)，實驗組表面活化分子HLA-DR表達較對照組明顯升高(P<0.05)，見圖1B、圖1D、圖2B、圖2D。

ABCD

ABCD

2.4 NONFH組NK細胞表面OPG/RANK/RANKL通路表達情況

為了解NK細胞在NONFH病程中的作用機制，通過ELISA測定兩組外周血及髖關(guān)節(jié)液中OPG/RANK/RANKL的表達情況對比發(fā)現(xiàn)，實驗組外周血OPG表達較對照組表達明顯降低(P<0.05)，而關(guān)節(jié)液中表達無明顯變化，RANK及RANKL表達較對照組表達明顯升高(P<0.05 )見表1、表2。

表1 外周血標本RANK、RANKL及OPG對比結(jié)果

表2 關(guān)節(jié)液標本RANK、RANKL及OPG對比結(jié)果

3 討 論

NK細胞作為天然免疫的第一道防線被人熟知，其在腫瘤、感染及自身免疫性疾病中的作用被大量研究，我們查閱到NK細胞在風濕性關(guān)節(jié)炎中促進炎癥及關(guān)節(jié)破壞等相關(guān)報道，尚未查到關(guān)于NK細胞在NONFH中的作用機制相關(guān)性研究；但同樣作為免疫細胞的T、B細胞均與NONFH相關(guān)，對NONFH的進展起到促進或抑制的作用；基于此，我們對比研究NONFH患者與健康對照組外周血及關(guān)節(jié)液中NK細胞表型變化，并測定RANKL/RANK/OPG通路表達變化，以探尋NK細胞與NONFH的相關(guān)性。首先，我們通過流式細胞學技術(shù)測定NONFH患者與無NONFH對照組外周血及關(guān)節(jié)液中NK細胞表型和其功能受體的表達情況，結(jié)果顯示NONFH組CD3-CD56+NK細胞表達量明顯高于對照組(P<0.05)，這表明NK細胞在NONFH的發(fā)生發(fā)展過程中有著重要的作用，這與之前報的NK細胞在骨性關(guān)節(jié)炎(OA)中的結(jié)果相一致[3]。NK細胞根據(jù)其表面標記物不同，可分為CD56Bright和CD56Dim兩個亞群；其中CD56DimNK細胞具有很強的細胞毒性，而CD56BrightNK細胞則可以產(chǎn)生大量的細胞因子，如干擾素γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等[4]。我們的結(jié)果顯示NONFH組CD56+NK細胞較健康對照組顯著升高，這表明在NONFH體內(nèi)NK細胞可能以分泌細胞因子的方式促進炎癥反應，從而影響著NONFH的進展。

HLA-DR作為NK細胞的晚期活化標志，在健康者外周血中表達較少，而在肝臟中大量表達，當處于慢性炎癥狀態(tài)如人類免疫缺陷病毒引起的免疫缺陷、多發(fā)性硬化癥、IgA 腎病[5]時，其表達量會顯著增加；HLA-DR與其他非主要組織相容性抗原復合體II(major histocompatibility complexII，MHC-II)型分子一樣，參與抗原呈遞，所以其在抗原呈遞細胞中高度表達，如：巨噬細胞、樹突狀細胞及B細胞[6]。我們的檢測結(jié)果顯示NONFH患者NK細胞表面HLA-DR較健康對照組明顯升高，這表明NONFH體內(nèi)NK細胞處于激活狀態(tài)。

NK細胞在免疫過程中，無需抗原提前刺激，在自身表面抑制性及刺激性免疫受體的復雜的整合調(diào)節(jié)下與靶細胞直接進行免疫反應。激活性受體通過識別靶細胞表面MHC-I調(diào)控NK細胞活性，其主要包括天然細胞毒性受體(NCRs)(NKp30，NKp46和NKp44)，c型凝集素受體(NKG2C，NKG2D)[7]。NK細胞表面激活性受體被刺激后，可有效增強NK細胞對靶細胞的殺傷能力，因此我們對比檢測了NONFH患者與對照組NK細胞表面刺激性受體NKp30的表達情況，然而，我們的結(jié)果顯示NONFH組NKp30的表達較對照組明顯下調(diào)，這與NK細胞在晚期腫瘤患者的免疫過程是相似的。在腫瘤早期免疫中，當靶細胞表面MHC-I表達量下降或活化性配體表達量增加，會引起干擾素及細胞因子等趨化因子的分泌增加，最終導致NK細胞NKp30表達增加、活性增強，使其以不同形式對腫瘤細胞進行靶向殺傷，其中以穿孔素/顆粒酶介導的細胞毒性作用為最有效的途徑[8]。穿孔素可穿透腫瘤細胞膜，有利于絲氨酸蛋白酶進入腫瘤細胞內(nèi)部分解大分子物質(zhì)進而發(fā)揮其生理作用，從而引起腫瘤細胞的壞死溶解[9];在晚期腫瘤免疫過程中,腫瘤細胞似乎進化出多種逃避免疫的途徑，如下調(diào)腫瘤細胞表面激活性配體的表達量、下調(diào)NK細胞表面天然毒性受體的表達量，從而達到逃避NK細胞免疫攻擊的目標，近年來有多項研究證明NKp30的表達的減少程度與腫瘤嚴重程度呈正相關(guān)[10-11]。我們的結(jié)果同樣顯示NKp30在NONFH患者中表達下調(diào)，這是否說明在NONFH中是否也存在“免疫逃逸”相似的機制，有待我們進一步的研究發(fā)掘。

骨細胞壞死、吸收及新骨形成，不斷的發(fā)生在NONFH的疾病過程中，但是新骨形成的速度無法與壞死吸收達到平衡，最終造成股骨頭塌陷變形。RANK主要表達于破骨細胞前體、成熟破骨細胞和免疫細胞，其與配體RANKL結(jié)合后促進破骨細胞分化和成熟，OPG可以結(jié)合RANKL，抑制破骨細胞分化，這意味著上調(diào)OPG/RANKL比值可以阻止破骨細胞的發(fā)生[12]。骨保護素又稱破骨細胞抑制因子，屬于腫瘤壞死因子家族，研究發(fā)現(xiàn)局部產(chǎn)生的OPG對骨骼、胸腺和腸道系統(tǒng)穩(wěn)定，起到至關(guān)重要的作用，其可抑制所有通過1,25(OH)2D3，PTH和IL-11刺激的3個不同信號通路誘導的破骨細胞形成[13]，在對骨平衡的維持中起到至關(guān)重要的作用。RANKL同樣屬于腫瘤壞死因子家族成員，可直接與破骨細胞祖細胞結(jié)合，對破骨細胞的分化、融合、存活和活化至關(guān)重要。免疫細胞與骨細胞有共同的起源，可直接或間接的通過RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)影響骨分化，而這樣的影響又與免疫細胞亞群、細胞因子和局部因素等有關(guān)[14]。2000年Arron 及Choi通過對既往研究的總結(jié)，首次提出針對骨骼細胞、免疫細胞以及相關(guān)因子和通路的骨免疫學的概念，用以闡述生理及病理狀態(tài)下骨骼與免疫系統(tǒng)的相互作用及機制[15]。破骨細胞受到多種信號通路調(diào)控，包括RANKL/RANK/OPG通路、Wnt/β-catenin通路等,其中以RANKL/RANK/OPG通路最為重要，T、B 淋巴細胞均可通過RANKL/RANK/OPG通路調(diào)節(jié)破骨細胞的分化發(fā)育。同樣，NK細胞表面也表達RANKL/RANK/OPG通路[16]，尚未見到關(guān)于NK細胞在NOFNH中的作用機制的研究。因此我們對比分析了NONFH患者與健康對照組外周血及關(guān)節(jié)液中RANK、RANKL及OPG的表達情況，結(jié)果顯示NONFH組OPG表達較對照組表達明顯降低，RANK及RANKL表達較對照組表達明顯升高。這與早期相關(guān)性研究的結(jié)果一致[17]，這說明在NONFH的疾病發(fā)生發(fā)展中RANK/RANKL/OPG同樣起到至關(guān)重要的作用。然而遺憾的是，我們并沒能夠?qū)K細胞敲除而定量分析NONFH患者NK細胞表達RANK/RANKL/OPG對其疾病發(fā)生發(fā)展的影響，這仍需我們進一步設計實驗進行深入的探討。

綜上所述，我們的結(jié)果顯示NONFH患者外周血及關(guān)節(jié)液中NK細胞比例明顯增加，且以中CD3-CD56+NK細胞為主，同時其HLA-DR的表達量明顯上調(diào)，提示在NONFH中NK細胞處于激活狀態(tài)，其殺傷行為增加，加速股骨頭塌陷；而NKp30表達下調(diào)，提示NONFH在病程進展過程中存在與惡性腫瘤相似的免疫逃逸情況；同時在 RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)中，OPG表達明顯下調(diào)，RANK、RANKL表達上調(diào)，這表明在NONFH的病程進展過程中破骨細胞處于活躍狀態(tài)，骨平衡被打破，骨細胞死亡分解增加，促進骨質(zhì)破壞吸收，加速股骨頭塌陷。從我們的研究中可以發(fā)現(xiàn)，NK 細胞在NONFH患者中起到了加速疾病進展的作用，那么我們是否可以相關(guān)技術(shù)人為或藥物，靶向NK細胞，降低其殺傷活性，或者上調(diào)OPG、下調(diào)RANK、RANKL的表達，抑制破骨細胞的活性，從而達到抑制股骨頭中骨細胞的壞死與吸收，最終達到延緩股骨頭壞死、塌陷、變形的目的。