EZH2抑制劑EPZ-6438對胃癌細胞侵襲和轉移的作用研究

潘浩磊，張凱赟，李楠，張佳博，賀武斌

(1.錦州醫(yī)科大學第一臨床學院；2.錦州醫(yī)科大學藥學院；3.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

胃癌是十大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率已經躍居第二位[1]。在一些偏遠欠發(fā)達地區(qū)和胃癌早期篩查普及率低的地區(qū)，胃癌發(fā)病率和死亡率已經超過了肺癌[2]。胃癌由于早期癥狀不明顯不能被早期診斷，往往出現明顯癥狀時到醫(yī)院診斷已是晚期，導致治愈率大大降低。同時，胃癌患者的生存期由于其術后的復發(fā)和轉移受到嚴重制約。因此，侵襲轉移也是胃癌治療的重點和難點，胃癌細胞侵襲轉移的大致過程包括上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、偽足形成、促侵襲轉移因子分泌等[3]。

EZH2是PcG基因家族中一種果蠅zeste基因增強子(E(z))的人類同源物[4]。研究表明，EZH2過表達于如肺癌、腸癌、多發(fā)性骨髓瘤、 頭頸部癌等腫瘤組織中,并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。EZH2的高表達能增加胃癌細胞的增殖和抗凋亡能力[6]。EPZ-6438作為一種有效的選擇性EZH2抑制劑，能抑制野生型和突變型EZH2，有研究報道，EZH2抑制劑能通過抑制EZH2來抑制腫瘤細胞的增殖[7]。在結直腸癌中，EZH2抑制劑EPZ-6438通過抑制EZH2介導的STAT3啟動子上的H3K27me3水平，抑制結直腸癌細胞的增殖[8]。GSK126 通過阻斷Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑抑制干細胞樣骨髓瘤細胞的增殖，并通過在異種移植小鼠模型中使用RPMI8226細胞證實GSK126的體內抗腫瘤作用[9]。由于EZH2抑制劑的研究多是圍繞EZH2來展開研究的，其非抑制EZH2方面的研究報道較少。因此，我們用EZH2抑制劑EPZ-6438來研究其對胃癌細胞的侵襲和轉移，并初步從EMT的角度解釋其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

人胃癌細胞株HGC-27、MKN-28、MGC-803、MKN-45、AGS細胞購自中國科學院上海細胞庫，胎牛血清、胰酶、1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，EPZ-6438(純度：99.84%,selleck，美國)，8 μm孔徑Transwell培養(yǎng)小室、基質膠(美國康寧公司)，DMSO(二甲基亞砜)購自天津佰倫斯生物科技有限公司，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9和β-actin抗體(CST,美國)，辣根標記的二抗(中國中杉金橋公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

HGC-27、MKN-28、MGC-803、MKN-45、AGS細胞用含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素雙抗的1640培養(yǎng)基，置于5% CO237 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理

將EPZ-6438按照說明書用DMSO配置后進行分裝，長期保存于-80 ℃冰箱，實驗時取分裝母液用DMSO 進行稀釋，Control組溶劑對照組，加入同等體積的DMSO。

1.2.3 MTT實驗

將對數生長期的細胞按每孔5000個接種于96孔板中，待細胞貼壁后按照給藥不同濃度加入EPZ-6438，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，以每孔20 μL的體積加入MTT溶液，孵育4 h。取出96孔板，吸掉含MTT的培養(yǎng)基，加DMSO 150 μL溶解，室溫放搖床震蕩至結晶完全溶解。在490 nm 波長處用酶標儀測定各孔的OD(吸光度值)，計算細胞存活率。

1.2.4 Transwell侵襲實驗

(1)將實驗細胞培養(yǎng)液預先更換為無血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；(2)按照說明書將培養(yǎng)基與基質膠以1∶6的比例配置成可鋪板的基質膠，注入Transwell小室的上室，緩慢吸出，勿產生氣泡，鋪好膠的小室放入培養(yǎng)箱中待其凝固；(3)將實驗細胞用無血清培養(yǎng)基重懸后接入小室上室中，置于與小室對應大小的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中提前加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，即小室下室浸泡在10%胎牛血清的1640培養(yǎng)中；(4)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；(5)取出培養(yǎng)板，用棉簽小心擦去小室上室內層殘余細胞，經過3次PBS浸泡清洗后4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸泡清洗3次，結晶紫染色10 min，PBS浸泡清洗3次，待干；(6)倒置顯微鏡下觀察并計數3個視野細胞數，計算侵襲率，實驗重復3次，用Graphpad Prism 6.0軟件進行分析并制圖。

1.2.5 細胞劃痕實驗

(1)將實驗細胞重懸為單細胞懸液后進行鋪板；(2)細胞長至鋪滿90%時，用10 μL無菌槍頭以培養(yǎng)板孔的中間標記作為參照沿培養(yǎng)板蓋進行劃痕，一次劃痕，勿重復，盡可能使劃痕均勻，用PBS浸洗掉漂浮細胞后，無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；(3)分別于0、24 h拍照；(4)根據0、24 h細胞劃痕圖片用image J軟件分析計算遷移率，重復3次實驗。

1.2.6 Western Blot實驗

(1)收集實驗細胞樣品,提取蛋白,按照BCA試劑盒進行蛋白定量,制成相同蛋白濃度的樣品；(2)蛋白電泳,轉膜后封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜；(3)二抗常溫孵育1 h，顯影，保存圖片并進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 6.0軟件對數據進行分析并作圖，計量資料多組間比較采用方差分析，組間比較采用q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Transwell侵襲實驗檢測并篩選高侵襲力的胃癌細胞

我們將 HGC-27、MKN-28、MGC-803、MKN-45、AGS細胞重懸后進行細胞計數，以相同數量的細胞用Transwell實驗進行侵襲能力檢測，我們發(fā)現，4種胃癌細胞中，HGC-27細胞的侵襲力最高，見圖1。因此，我們選擇HGC-27細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 Transwell實驗檢測胃癌細胞系的侵襲力

2.2 EPZ-6438對HGC-27細胞增殖的影響

EPZ-6438的濃度在20 μmol/L以下時，對HGC-27細胞的增殖影響不大，為了排除EPZ-6438對HGC-27細胞增殖的影響，我們后續(xù)試驗選擇EPZ-6438的濃度范圍為0～20 μmol/L，見圖2。

圖2 不同濃度EPZ-6438對HGC-27細胞毒性的影響

2.3 EPZ-6438對HGC-27細胞侵襲和轉移的影響

根據前期MTT實驗結果，我們選擇EPZ-6438的作用濃度為0、5、10、15 μmol/L，用含0、5、10、15 μmol/L的EPZ-6438的無血清培養(yǎng)基處理24 h，Transwell結果發(fā)現，隨著濃度的逐漸增加，EPZ-6438能明顯抑制HGC-27細胞的侵襲(F=28.812，P<0.05)，見圖3。細胞劃痕實驗結果發(fā)現，依濃度遞增，EPZ-6438能明顯抑制HGC-27細胞的轉移(F=44.621，P<0.05)，見圖4。

與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01

與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01

2.4 Western Blot檢測EPZ-6438對HGC-27細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達

與對照組相比，EPZ-6438能明顯降低HGC-27細胞中N-cadherin(F=47.761,P<0.05)和Vimentin(F=100.52，P<0.05)的表達，并促進E-cadherin的表達(F=16.613,P<0.05)，見圖5。

注與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01

2.5 Western Blot檢測EPZ-6438對HGC-27細胞中基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達

與對照組相比，EPZ-6438能明顯降低HGC-27細胞中MMP-2(F=24.472,P<0.05)和MMP-9(F=35.611，P<0.05)的表達，見圖6。

與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01

3 討 論

胃癌在我國消化系統(tǒng)腫瘤中的發(fā)病率居高不下，除了與感染幽門螺桿菌和EB病毒有關外，還與過量食用紅肉等不良的飲食習慣以及吸煙、酗酒相關[10]。此外，遺傳易感性也被認為是胃癌發(fā)生和發(fā)展的主要原因[11]。EZH2是是多梳抑制復合物2的核心催化亞基,是一種能夠催化組蛋白H3的27號位點賴氨酸3甲基化(H3K27me3)的甲基轉移酶[12]。研究證實，EZH2在胃癌等多種腫瘤組織及細胞中存在高表達[13]。以往對EZH2抑制劑的研究均是圍繞EZH2對腫瘤細胞的增殖及凋亡的研究，其非抑制EZH2的功能方面的研究較少。因此，本實驗中，我們用EZH2的抑制劑EPZ-6438，并選擇高侵襲力的HGC-27細胞作為研究對象，來研究EPZ-6438對胃癌細胞侵襲和轉移的影響。根據MTT結果，EPZ-6438在20 μmol/L以下時，對HGC-27細胞沒有明顯的毒性，因此后續(xù)試驗我們選擇EPZ-6438的濃度范圍為0～20 μmol/L。

通常，胃癌的復發(fā)和轉移的異常生物學進程包括原癌基因的異常激活、抑癌基因發(fā)生突變或失活、DNA堿基發(fā)生錯配以及修復功能失調、表觀遺傳學修飾、EMT(上皮間質轉化)等[14]。EMT是上皮極性細胞由于受周圍環(huán)境改變發(fā)生生理或病理變化后轉變?yōu)殚g質型特征的細胞的過程，形態(tài)學改變主要表現為細胞形態(tài)由多邊形變?yōu)樗笮?，EMT被證實在胚胎發(fā)育、組織修復、炎癥以及癌癥進展中存在異常激活[15]。既往研究認為，腫瘤細胞在上皮間質轉化進程，因獲得間質表型而具有更強的運動能力及細胞外基質降解能力，最終導致腫瘤細胞的局部和遠處轉移。上皮細胞通過EMT過程獲得單個細胞的遷移和侵襲能力，進而脫離原發(fā)灶進入循環(huán)系統(tǒng)。腫瘤細胞從原發(fā)灶轉移到其他組織器官后，進行MET轉換，從間質細胞轉化為具有上皮表型的細胞，真正形成轉移灶[16]。研究發(fā)現，在EMT激活的腫瘤細胞過程中往往伴隨著N-鈣粘蛋白、波形蛋白等蛋白的表達升高，E-鈣粘蛋白和密封蛋白等蛋白的表達降低[17]?；|金屬蛋白酶 (MMP) 是蛋白酶家族成員之一，主要由蛋白酶、生長因子、細胞表面受體以及黏附分子等構成。研究證實，大多數癌癥的進展與MMP活性相關[18]。其中，作為MMP家族一類可以降解細胞外基質的鋅依賴性蛋白水解酶，MMP-2和MMP-9被認為與癌癥侵襲、血管生成等密切相關[19]。N-鈣黏著蛋白能與FGF受體發(fā)生作用，促進MMP-9 的表達，進而通過增強EMT進程促進癌細胞的侵襲和轉移[20]。在本實驗中，EPZ-6438能明顯抑制胃癌細胞的侵襲和轉移，且呈濃度依賴性。進一步研究發(fā)現，EPZ-6438能明顯降低HGC-27細胞中N-cadherin和Vimentin的表達，并促進E-cadherin的表達。為了證實N-cadherin和Vimentin減少是否會影響基質金屬蛋白酶的表達，對EPZ-6438處理的胃癌細胞進行檢測，發(fā)現MMP-2和MMP-9表達減少，這與前面侵襲和轉移的實驗結果一致，該結果表明EPZ-6438能明顯抑制胃癌細胞HGC-27的侵襲和轉移，其機制可能與EPZ-6438抑制胃癌細胞發(fā)生上皮間質轉化密切相關。

綜上所述，EPZ-6438能明顯抑制胃癌細胞的侵襲和轉移，其機制可能與抑制胃癌細胞發(fā)生上皮間質轉化有關。EPZ-6438調控胃癌細胞上皮間質轉化來抑制其侵襲和轉移的具體分子信號機制有待進一步研究。