hucMSC-exo介導的mir-124對大鼠肝再生的影響及機制

劉旺，陳梅，肖經華，許芝彬

(1.廣州市番禺區(qū)第五人民醫(yī)院內科；2.廣州市番禺區(qū)第五人民醫(yī)院超聲科，廣東 廣州 510000；3.馬來西亞拉曼大學理學院，馬來西亞 坎帕爾50744)

肝臟涉及能量代謝及膽汁的生成，且具有組織損傷后重建的能力。小鼠模型的研究表明，將70%肝臟切除后，在第7～10天其重量和體積完全恢復。組織學層面的肝再生涉及多種因素[1]。例如：細胞因子、信號通路、生長因子等。microRNAs(miRNAs)是一種小的非編碼RNA，通過轉錄后調控靶基因的表達參與許多生物學過程[2]。越來越多的證據(jù)表明miRNAs在肝臟再生中起著關鍵作用[3-6]。

有報道稱mir-21促進細胞周期蛋白D1的翻譯，促進細胞周期的進展；還發(fā)現(xiàn)mir-21/PTEN軸可通過調節(jié)PI3K/Akt信號促進肝細胞增殖[7-8]。與此相反，在大鼠肝組織中mir-127在部分肝切除術后出現(xiàn)下調，mir-127的過度表達抑制了大鼠肝brl-3a細胞的增殖，阻滯了G2/M期細胞周期[9]。然而，miRNA在肝再生中的作用是什么？尚待進一步研究證實。

細胞外轉運蛋白和脂肪的mRNA的循環(huán)。外泌體或胞外囊泡由多種細胞分泌，廣泛存在于體液中，可在細胞間轉運miRNAs、蛋白質和mRNAs[11]。此前研究結果表明，外源性mir-10可以通過調節(jié)肝切除大鼠肝細胞增殖，抑制EphA4的出現(xiàn)，促進肝再生[12]。外源性miRNAs也被證明可以作為良惡性肝病的診斷生物標志[13]。本研究的目的是探討促進肝移植術后肝再生的可能機制，探討肝切除術后介入治療的新靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

清潔飼養(yǎng)成年雄性SPF級SD大鼠，10～12 周齡，總共126只，體重約250～300 g。室溫應控制在20～25 ℃，常規(guī)清潔飼養(yǎng)，清潔飼料應定期更換；將大鼠的飼養(yǎng)室溫保持在20～25 ℃，并創(chuàng)造一個有規(guī)律的晝夜交替周期。本實驗需嚴格遵守實驗基本原則，對實驗動物進行合理合法的處理。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立70%大鼠肝臟動物模型：制備的hucMSCs懸浮液用PBS洗滌2次，并在無血清和低葡萄糖的LG-DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。在1000 g下離心20 min，然后繼續(xù)分別2000 g下離心20 min、10 000 g下離心20 min。將濃縮的上清液裝載在5 mL 30%蔗糖/D2O緩沖液，然后在100 000g下超速離心60 min。收集微泡的濃縮部分，并用PBS稀釋，純化的胞外體漂浮在無核酸酶的水中，-80 °C下儲存以備將來分析。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：大鼠肝細胞BRL-3A細胞在37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 表達載體構建及轉染：mir-124模擬物、mir-124激動劑、mir-124抑制劑和相對陰性對照(基因藥物)。將Foxg1的開放閱讀框插入pcDNA3 Foxg1過表達載體，該載體由1個載體(USA，invitrogen)的多個克隆位點構建。使用異丁烯6轉染試劑(USA,Promega)進行轉染。轉染效率通過隨后的qPCR或Western Blot印跡分析進行驗證。

1.2.4 CCK-8測定：使用細胞計數(shù)對細胞生長的估計將不同處理的細胞培養(yǎng)特定時間，然后將10%的細胞添加到培養(yǎng)基，2 h后，使用微孔板讀取器(USA,bio-TEK)測量450 nm的吸光度。

1.2.5 BrdU檢測：混合法檢測細胞增殖將經不同處理的大鼠肝臟中的Brl-3a細胞與BrdU溶液(10 μM)混合，在37 °C下培養(yǎng)30 min。BrdU標記和檢測試劑盒(USA,sigma-Aldrich)用于分析BrdU的摻入。

1.2.6 實時定量PCR(qPCR):從大鼠肝組織或培養(yǎng)細胞中提取總RNA，并使用Trizol和super transcriptase III將其反轉錄為DNA。使用2-ΔCT法分析相對表達，并使用U6表達作為標準化的內部對照。

1.2.7 免疫印跡：使用Ripa緩沖液和蛋白抑制劑雞尾酒從培養(yǎng)細胞或大鼠肝組織中分離總蛋白。通過SDS-PAGE分離相同量的蛋白質，膜用5%脫脂乳密封，與一級抗體孵育，然后與相應的二級抗體孵育。用于研究的主要抗體如下。Chtf8(1∶500、PA5-109543、透明質原、USA)、Foxg1(1∶1000、PA5-26794、透明質原、USA)和β-肌動蛋白(1∶5000，PA1-16889，透明質原，USA)。

1.2.8 熒光素酶報告分析：克隆Foxg1野生型(WT)或突變型(MUT)3'-UTR，構建在pGL3-LUC熒光素酶載體(USA，Promega)上。作為可顯色的特殊蛋白質載體，將實驗對象的肝細胞和mir-124模擬物(可以選擇其他參照組)一起轉染。在記錄蛋白質的相對活性48 h后，等待進一步記錄酶的相應測試結果。

1.2.9 納米顆粒追蹤分析和掃描電子顯微鏡：樣品在半瓦燈下干燥，然后在掃描電子顯微鏡下立即拍攝外泌體。

1.2.10 RNA提取：microRNA微陣列從pH或pH+exo組大鼠肝組織中分離總RNA，并用PURELINK miRNA分離試劑盒純化。上海漢工貿有限公司生產的AFM芯片和基因芯片構建列陣差異表達的miRNA由sangerbox(http://www.sangerbox.com)分析。

1.3 質粒構建

質粒構建是分子生物學研究中最常用的實驗技術。原理依賴于限制性核酸內切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基因和載體DNA進行適當切割和修飾后，將二者連接在一起，再導入宿主細胞，實現(xiàn)目的基因在宿主細胞內的正確表達。

(1)質粒構建方式：質粒構建方式多樣，常規(guī)的T4連接酶，T4連接酶可用于平末端也可用于粘性末端連接；(2)質粒載體的制備：質粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切，使載體的末端具有特異性，防止自連。

2 結 果

2.1 從參與肝再生的hucMSCs外顯體中鑒定miRNA

為了確認參與肝臟再生的hucMSCs來源的外泌體miRNA，實驗采用了miRNA微陣列芯片來識別不同表達的miRNA。在實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在外泌體治療后，肝組織中的mir-193a、mir-124和mir-93顯著上調，而mir-204和mir-10a-5p則呈下降趨勢，見圖1。

*表示P<0.05的顯著性差異；**表示P<0.01的顯著性差異

mir-124和mir-93是促進brl-3a細胞生長的有效模擬載體。通過qPCR分析各組前體miRNA的相對表達，并檢測各實驗組大鼠肝組織中前體miRNA的表達水平，以調查和解釋miRNA表達變化的來源。實驗結果顯示，70%肝切除術后，外泌體注射組和70%肝切除術后非外泌體注射組的pre-93和mir-193a顯著增加，外泌體注射組的pre-mir-204和pre-mir-10a-5p降低，在外體注射組和非注射組之間，前mir-124沒有顯著差異，見圖2右圖。

左圖：將miRNA模擬物或陰性對照(NC)轉染brl-3a大鼠肝細胞，檢測細胞增殖；右圖：各組前miRNA相對表達的qPCR分析圖-3 mir-193a的qPCR分析mir-204、mir-124、mir-93和mir-10a-5p在hucMSCs衍生的外泌體中的相對表達

通過qPCR分析mir-193a、mir-204、mir-124、mir-93和mir-10a-5p在hucMSCs衍生的外泌體中的相對表達。進一步推測miRNA表達的變化可能來自來源于hucMSCs的外泌體。進一步證實，hucMSCs分泌的mir-124的表達顯著高于對照組，見圖3，這也表明hucMSCs衍生的分泌的mir-124有可能促進SD大鼠肝切除后的肝再生過程。

**表示P<0.01的顯著性差異

2.2 mir-124促進大鼠肝臟再生，改善大鼠70%肝切除術后肝損傷

用agomir-124對各實驗組大鼠進行干預。干預因素為：治療過程是否使用agomir-124。對肝組織中的mir-124做qPCR分析。結果顯示，各組中mir-124差異具有統(tǒng)計學差異。表明agomir-124治療的介入效果確切。部分肝切除術增加了mir-124在循環(huán)和結締組織中的表達，進一步提高了mir-124的表達，見圖4。在肝臟和血液循環(huán)，對不同時間節(jié)點肝臟/體重比記錄，mir-124的過度表達顯著增加了部分肝切除術后的肝臟/體重比，見圖5。對第3天肝組織切片進行HE染色和PCNA染色檢測，見圖6、圖7。進一步發(fā)現(xiàn)，agomir-124還能改善肝壞死，促進肝細胞增殖，降低血清ALT/AST水平，見圖8。由此可見mir-124對肝再生有正向調節(jié)作用。

*表示P<0.05的顯著性差異；**表示P<0.01的顯著性差異

**表示P<0.01的顯著性差異

**表示P<0.01的顯著性差異

**表示P<0.01的顯著性差異

2.3 mir-124直接靶向Foxg1調節(jié)大鼠肝細胞增殖

為了進一步了解mir-124調節(jié)肝再生的機制，我們進行了生物信息學分析以預測mir-124的潛在靶點。利用miRDB、DIANA和TargetScan在線工具進行生物信息學分析，預測mir-124的潛在靶點，發(fā)現(xiàn)了6個常見的目標點(Chetf8、Pasp、CHSYS、Adam9、Strbp、Foxg1)，見圖9。

通過qPCR分析6個常見靶點(chtf8、PASP、chsy1、ADAM9、strbp和Foxg1)的相對表達水平。結果顯示，mir-124模擬物顯著抑制chtf8和Foxg1的表達，見圖10。此外，使用mir-124模擬物或NC轉染brl-3a細胞，并通過Western Blot分析chtf8和Foxg1蛋白的表達。研究發(fā)現(xiàn)，mir-124的過度表達顯著降低了Foxg1蛋白的水平，但沒有改變chtf8蛋白的表達，見圖11。

*表示P<0.05的顯著性差異；**表示P<0.01的顯著性差異

2.4 外源性mir-124 Foxg1下調，肝部分切除后促進大鼠肝再生

為了進一步驗證mir-124和Foxg1在肝部分切除術后肝再生中的作用，進一步比較了假手術組和肝部分切除組大鼠肝臟中Foxg1的蛋白表達水平。

Western Blot分析假手術組、pH組、假手術+exo組和pH+exo組大鼠肝臟中Foxg1蛋白的表達。結果發(fā)現(xiàn)，pH組Foxg1的表達低于假手術組，外源性干預進一步促進了Foxg1的表達，見圖12。

**表示P<0.01的顯著性差異

Western Blot分析假手術組Foxg1蛋白的表達sham+agomir-124和pH+agomir-124大鼠肝臟的表達也發(fā)現(xiàn)了類似的結果，見圖13。

3 討 論

人骨髓間充質干細胞(hucMSC)特別是人臍帶骨髓間充質干細胞是一種新型的再生細胞資源再生療法。然而，MSCs生物學基礎需要深入了解。外泌體是一種重要的生物因子，其內含物種類繁多，具有多種生物學功能。在當前研究中，我們從臍帶間充質干細胞中收集外泌體，并檢測其細胞保護作用，對組織修復的影響。蛋白質組學分析表明，顯著富集的蛋白質組分在代謝中發(fā)揮監(jiān)管作用。生理層面，MSC-Exo使脂聯(lián)素水平升高。此外，MSC-Ex顯著加速了干細胞的分化，huc-MSCs衍生外泌體可發(fā)揮與其代謝調節(jié)能力相關的組織再生作用。

在部分肝切除術后，殘肝組織在收到反饋信號的刺激后啟動增殖，從而恢復肝臟的生理功能，不同細胞因子的參與使這個過程復雜多樣[14]。間充質干細胞(MSCs)及其衍生的外體已被證明是治療肝纖維化、急性肝損傷和肝癌等肝臟疾病的新策略[15]。由大多數(shù)類型細胞分泌，被包裹在脂質囊泡中直徑為40～100 nm的生物分子稱為外泌體[16]。據(jù)考證，mir-124作為一種基因調控分子，能有效改變Wnt/β-連環(huán)蛋白通路，獲得信息反饋，改善缺血、營養(yǎng)不良等因素引起的肝細胞壞死或暫時性功能障礙[17]。另外來自于hucMSCs衍生的外泌體則能利用抗氧化電位減少因CCl4引起的肝硬化和糖尿病等疾病的發(fā)生[18]。最近的研究集中在MSC來源的外泌體在肝再生中的治療作用[19]。

本研究表明，hucMSCs衍生的外體可以保護大鼠肝部分切除后的肝損傷并促進肝再生。使用大鼠肝組織進行miRNA微陣列分析，無論是否進行外體處理。多個失調的mirna已被發(fā)現(xiàn)，mir-124已顯示出促進大鼠肝細胞增殖的能力。

microRNAs (miRNAs)是重要的富集分子，在組織中可以調節(jié)基因轉錄和連接小膠質細胞極化相關通路的表達。在已知的miRNA中，mir-124是一個在小膠質細胞中高表達的特異性miRNA。在生理條件下，mir-124調控細胞在其休眠中起關鍵作用。在病理條件下，mir-124下調通過極化細胞進入增加神經炎癥M1表型，而mir-124上調通過將細胞極化成M2來減少炎癥表型。這些研究表明mir-124是否有潛力成為一種有效的微極化劑，細胞轉化為M2表型，從而促進創(chuàng)傷性膿液神經發(fā)生。這是一種很有前途的方向。將mir-124傳遞到組織并發(fā)揮其作用的是外泌體，在內膜小體囊泡(30～100 nm)含有蛋白質、脂質、mRNA和小分子核糖核酸。外泌體的優(yōu)點包括它通過血腦屏障(血腦屏障)的能力，mir-124修復損傷的可能性很大它的雙脂膜使其嵌入mir-124穩(wěn)定并在交付后發(fā)揮作用。值得注意的是，最新的研究表明，外泌體減少了損傷炎癥，促進損傷后功能恢復和mir-124富集的外泌體(Exo-mir-124)促進N9小膠質細胞的M2極化，體內細胞發(fā)生增強。然而,是否Exo-mir-124可以調節(jié)小膠質細胞的極化及其基礎機制仍然未知。

為了排除大鼠肝細胞內源性來源mir-124的可能性，檢測了mir-124整體的表達，未能找出mir-124的差異，但觀察結果顯示mir-124具有外泌體，有望成為臨床肝再生治療的新標志物。mir-124普遍存在于頭頸部鱗狀細胞癌、前列腺癌、膠質母細胞瘤和非小細胞肺癌等癌癥中，其本身具有抑癌作用。mir-124的特異性表現(xiàn)導致HCC中的表觀遺傳沉默。當細胞周期素依賴的蛋白酶發(fā)育受到阻礙時，肝細胞組織萎縮甚至死亡的現(xiàn)象稱為mir-124的過度表達。

當mir-124的肝臟環(huán)境發(fā)生變化時，其功能是不同的。肝臟疾病中mir-124過度表達的治療需要進一步研究。FoxG1在卵巢癌細胞中有很高的表達。Foxg1還通過啟用Wnt信號啟用HCC-EMT。研究結論Foxg1是直接靶點，在下調作用下，F(xiàn)oxg1可以促進pH后的肝再生。然而，外源性mir-124/Foxg1如何改善pH后大鼠的肝損傷尚不清楚。參與肝臟再生調節(jié)的信號通路及其與mir-124/Foxg1的關系有待進一步研究。

綜上所述，該研究結果表明，由hucMSCs衍生的外泌體mir-124通過負性調節(jié)大鼠部分肝切除模型中的Foxg1，促進肝再生，抑制肝損傷。這些發(fā)現(xiàn)可用于開發(fā)肝再生的新療法。