基于CK抑制劑虛擬篩選的補骨脂鹽炙工藝研究

范冰冰，韓宇，仲人中，郭晏華，馬壯

(1.錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121000；2.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽110847)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是多因素所致的以骨含量降低、骨組織的微細構型被破壞為特質(zhì)，引發(fā)骨折、呼吸困難等病癥的一種慢性骨質(zhì)病癥[1-7]。補骨脂為豆科植物Psoralea corilyfolia L.的干燥成熟果實，以補腎助陽、固精縮尿為主要功效[8]。傳統(tǒng)醫(yī)學普遍認為腎藏于精，精足生髓，髓隱于骨中，充溢骨骼。因此，補骨脂通過補腎助陽發(fā)揮補腎壯骨的作用，在預防和治療骨質(zhì)疏松方面具有一定的優(yōu)勢。補骨脂作為抗骨質(zhì)疏松癥(OP)的慣用中藥材，需炮制入藥，其鹽炙法始于宋·《局方》，現(xiàn)代鹽炙法為《中國藥典》所收錄。鹽炙走腎，經(jīng)鹽炮制過的補骨脂可增強補腎納氣作用[9-11]，在抗OP方面有獨特的優(yōu)勢和開發(fā)的潛能。

研究表明，長期性服用借助于促進新生骨質(zhì)恢復骨量的中藥有增加骨吸收的風險，而CK是最早被發(fā)現(xiàn)位于破骨細胞中涉及骨質(zhì)再吸收的主要酶，被很多學者作為抗OP研究的熱門靶向蛋白酶。CK[12]存在誘發(fā)OP的潛在可能性，其蛋白及mRNA的表達水平抑制被證實能夠治療骨質(zhì)疏松癥[13-14]。補骨脂化學成分復雜，藥理作用廣泛，因而本研究借助蛋白質(zhì)結構虛擬篩選技術[15-16]，將CK作為預防和治療OP的關鍵靶點，得到補骨脂中抑制破骨細胞活性的成分。以篩選出的成分含量為評分指標，選用星點設計-效應面法甄選補骨脂鹽炙工藝技術，實現(xiàn)補骨脂鹽炙后有效抑制CK而發(fā)揮抗OP目的，為補骨脂鹽炙生產(chǎn)工藝的下一階段研究提供理論支撐。

1 材 料

1.1 儀器與軟件

操作軟件UCSF Chimera(http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)；對接軟件UCSF DOCK6.0(http://dock.compbio.ucsf.edu/DOCK_6/index.htm)；戴爾4核計算機(美國戴爾科技有限公司)；ISIS-Draw軟件Open Bable(http://openbabel.sourceforge.net)。

高效液相色譜儀(日本島津LC-10AT)；紫外檢測器(SPD-10AVP)；紫外-可見分光光度計(UVmini-1240)；電子分析天平(Sartorius CP225D)；超聲清洗器(KQ2200型)。

1.2 試藥

補骨脂素(四川維克奇生物制劑有限公司，批號：wkq14022602)；補骨脂甲素(四川維克奇生物制劑有限公司，批號：wkq14080805)；補骨脂生用品，購于安徽省亳州中藥材市場(遼寧中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研組翟延君教授鑒別為正品藥材)；食用鹽(遼寧鹽局總廠)；黃酒(紹興水鄉(xiāng)黃酒釀制有限責任公司)；娃哈哈純凈水；乙腈、甲醇(色譜純，科密歐有限公司)，其它化學試劑(分析純)。

2 方 法

2.1 虛擬篩選

本研究采用實驗室自建補骨脂化學成分庫，該數(shù)據(jù)庫包含補骨脂酚、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮等29種化學成分。以mol格式采用ISIS-Draw軟件建構基于補骨脂化學組分的結構信息，充分運用Open Bable應用軟件將分子的2D結構轉(zhuǎn)變?yōu)?D結構，附加氫及Gasteiger電荷于結構，以mol2的格式保存文件。系統(tǒng)分析受體的構型，進而辨認受體的活性分布區(qū)域，在活性區(qū)域追蹤可能的聯(lián)結位點。探求與受體聯(lián)結位點相適應的配體分子，獲致備選化合物，對備選化合物展開評估和能量評級，并選取其作為下一階段實驗指標性成分。

2.2 對照品溶液制取

精密稱取適量補骨脂甲素、補骨脂素對照品，依序置10 mL棕色容量瓶中，添至甲醇溶解，制得濃度為113 μg/mL、212 μg/mL的對照品儲備液，稀釋制得每1 mL溶補骨脂甲素21.2 μg、補骨脂素11.3 μg混合對照品溶液，供備用。

2.3 供試品溶液制取

精密稱取補骨脂鹽炙品粉末，過篩(60目)0.2 g，置25 mL容量瓶中，添至20 mL甲醇，超聲波提取30 min，放冷，添入甲醇至刻度，搖勻，靜置，微孔濾膜(0.45 μm)濾過即得。

2.4 色譜條件

色譜柱：Kromasil-C18(4.6 mm×250 mm，5 um)；流動相：乙腈(A)-0.3%冰乙酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，63%～55% B；10～20 min，55%～50% B；20～30 min，50%～45% B；30～50 min,45%～35% B)；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：245 nm；進樣量：10 μL。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察

精密汲取4、8、10、12、16、20 μL混合對照品液注入HPLC，精確測量。以混合對照品溶液進樣量(μg)為橫軸(X)，色譜峰面積為縱軸(Y)，繪出標準曲線，得補骨脂素回歸方程Y=7 917 889.8729x + 16 451.5714，相關系數(shù)r=0.9992，線性范圍0.0848～0.4240 μg；補骨脂甲素回歸方程Y=2 372 623.9892x+4 983.0000，相關系數(shù)r=0.9997，線性范圍0.0848～0.4240 μg。

2.5.2 精密度試驗

精密汲取混合對照品溶液，一日內(nèi)連續(xù)5次進樣，記錄補骨脂素、補骨脂甲素色譜峰面積，計算得RSD分別為0.54%、1.26%，表明儀器精密度良好，見表1。

表1 精密度結果

2.5.3 穩(wěn)定性實驗

配制供試品溶液，依序置放0、4、8、12、16 h進樣分析，記述補骨脂甲素、補骨脂素的色譜峰面積，計算得RSD分別為2.55%、2.31%，表明供試品溶液在該條件下穩(wěn)定性良好，見表2。

表2 穩(wěn)定性結果

2.5.4 重復性實驗

精密稱取同一批次5份鹽炙補骨脂，按照“2.2”項下方法平行配制供試品溶液，進樣分析，記述補骨脂甲素、補骨脂素色譜峰面積，計算得RSD分別為1.98%、0.62%，闡明該方法重復性良好，見表3。

表3 重復性結果

2.5.5 回收率實驗

精密稱取可知含量的6份鹽炙補骨脂，每份依其1:1比例添補骨脂甲素、補骨脂素對照品，按照“2.2”項下方法配制，平均回收率分別為101.2%、98.5%，RSD分別為2.20%、1.90%，闡明此方式回收率較高，見表4。

表4 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.6 星點設計與效應面分析

2.6.1 實驗設計

基于Design-Expert 8.0.7.1軟件的Central Composite 實驗參數(shù)設計方案，擷取悶潤時間(A)、炒炙時間(B)、炒炙溫度(C)為實驗研究三因素，以補骨脂素、補骨脂甲素兩種成分總含量(mg/g)為響應值(Y)。參照星點設計分析方法，每一因素依次設立5水平，分別以±1.73、±1、0表示其自變量水平。代碼見表5。采行上述軟件展開多元回歸擬合，制取二次多項回歸模型。

表5 星點設計-效應面法實驗設計表

3 結 果

3.1 分子對接

從蛋白質(zhì)晶體結構數(shù)庫PDB(http://www.rcsb.org/pdb)中獲得CK，見圖1，及其配體復合物的晶體結構(PDB code:3KWZ )視作分子對接的受體模型。補骨脂分子庫存在8個分子可與CK順利進行對接，并依循能量由低至高的次序排列，見表6。

圖1 CathepsinK 的晶體結構

表6 分子對接打分表(kcal/mol)

3.2 星點設計及計算結果

見圖7。

表7 星點設計與結果

3.3 模型擬合

Y=2.20+0.27A+0.12B-0.19C-0.0057AB+0.012AC-0.13BC-0.0065A2-0.25B2-0.23C2，其相關系數(shù)R2=0.9193，標示Y(兩種成分的總含量)真實值與預估值之間有較優(yōu)的擬合度，故該模型可用于預判補骨脂鹽炙生產(chǎn)工藝。繪制各因變量曲面圖，見圖2。

圖2 A、B、C三因素對兩種成分總含量影響的效應面3D圖

3.4 方差分析

表8可推斷，在實驗預設的區(qū)域范圍內(nèi)，A、B、C這3個因素對Y皆有顯著影響。回歸方程失擬檢測并不顯著，闡明實驗結果受未知因素干涉極小。經(jīng)F值驗證標示總模型方程顯著，此方程與實際情況有較佳擬合度。

表8 回歸分析結果

系統(tǒng)分析，悶潤補骨脂10.22 h，171 ℃炒炙12 min為其理想的鹽炙工藝參數(shù)

4 討 論

計算機輔助藥物設計(computer aided drug design，CADD)[17-23]是一種設計和優(yōu)化先導化合物的方法，以計算機化學為基礎，采取計算機的模擬、計算和預算藥物與受體生物大分子之間的關系。中藥現(xiàn)代化的已然進展，CADD被譽為連接傳統(tǒng)中醫(yī)藥和現(xiàn)代科學的重要紐帶，也為中藥的藥效物質(zhì)基礎研究提供了新方法。本研究將CK三維結構的活性位點和補骨脂中的化學分子進行對接，旨在利用分子虛擬篩選高通量、高速率、高準確性的優(yōu)勢，尋找中藥補骨脂中CK的抑制劑。傳統(tǒng)藥理實驗證明補骨脂素、補骨脂甲素具有較好的抑制破骨細胞活性作用，其在補骨脂中的含量也較高，分別屬于香豆素類及黃酮類化合物，而豆科植物的黃酮類化合物具有植物雌激素樣作用，可適度調(diào)節(jié)絕經(jīng)后婦女的骨含量，是潛在的抗OP有效物質(zhì)。根據(jù)補骨脂虛擬篩選結果和相關文獻報道，進而選取CK抑制劑中的補骨脂素及補骨脂甲素作為后續(xù)實驗的目標性成分。與傳統(tǒng)篩選方法相比，省去了繁瑣的實驗步驟、節(jié)約實驗成本、減少實驗時間，為目標成分的快速篩選提供有力支撐。

星點設計-效應面法[24-30]是綜合數(shù)學分析、統(tǒng)計分析方法復合于一體的援用于線性及非線性數(shù)據(jù)模型的實驗設計方法，能夠深入研究多因素的交互作用，甄選出相對較優(yōu)條件，具有實驗次數(shù)少、實驗精度及預測性高等優(yōu)點，彌補了正交設計和均勻設計的不足，使結果更加可靠。本研究采行星點設計-效應面法，采用Design-Expert 8.0.7.1軟件分析，以抑制CK的補骨脂甲素、補骨脂素共含量為評價指標甄選理想鹽炙補骨脂工藝，增強其抗OP作用。悶潤補骨脂10.22 h，171 ℃炒炙12 min為其理想的鹽炙工藝參數(shù)，具有科學性和實用性，為補骨脂鹽炙品的擴大生產(chǎn)給予技術參考。