甲磺酸阿帕替尼對人乳腺癌紫杉醇耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

曾會會，余小婷，胡婷，王娟，汪婷婷，鄭榮生

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004)

乳腺癌是威脅女性生命健康最常見的惡性腫瘤，成為2020年全球癌癥發(fā)病率的主要原因，也是全球第五大癌癥死亡原因[1]。化療在乳腺癌綜合治療中占有極其重要的地位，紫杉醇作為乳腺癌化學(xué)治療中的一線藥物廣泛應(yīng)用臨床，但紫杉醇耐藥問題已經(jīng)成為乳腺癌患者治療的主要挑戰(zhàn)。因此，深入探究乳腺癌紫杉醇耐藥的機(jī)制，尋找低毒有效的逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥的藥物，提高轉(zhuǎn)移性乳腺癌生存期具有重要意義。

紫杉醇來源于紅豆杉科植物中獲取的天然物質(zhì)，通過阻止微管蛋白重聚合而起到抗腫瘤作用的。然而，紫杉醇在乳腺癌治療過程中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生突變、旁路信號通路的激活等多途徑共同作用產(chǎn)生耐藥性[2]。根據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP binding cassette transporter，ABC )的過度表達(dá)、β-微管蛋白結(jié)合區(qū)和微管蛋白突變的改變、凋亡蛋白(如Bcl2和P53)的功能降低、以及細(xì)胞因子表達(dá)的改變與紫杉醇耐藥性有關(guān)[3]。最新研究表明酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥(multi drug resistant，MDR)表型相互作用，顯著抑制P-gp活性，增加多藥耐藥腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性[4]。甲磺酸阿帕替尼是我國自主研制的一種小分子TKI，高度選擇性競爭血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-2)的ATP結(jié)合位點，阻斷下游信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤血管的生成。阿帕替尼目前批準(zhǔn)用于晚期胃腺癌患者，但在肝癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]、食管癌[7]、乳腺癌[8]等臨床研究中也獲得一定的療效。阿帕替尼在逆轉(zhuǎn)多藥耐藥、抑制腫瘤血管、增強(qiáng)化療和放射治療療效等方面具有顯著的優(yōu)勢[9]。本研究探索阿帕替尼逆轉(zhuǎn)乳腺癌紫杉醇的耐藥性及可能機(jī)制，從而為解決臨床乳腺癌紫杉醇耐藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑及儀器

MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株由蚌埠醫(yī)學(xué)院中心實驗室保存，MCF-7/Taxol細(xì)胞株由本實驗室構(gòu)建。紫杉醇注射液及阿帕替尼購自北京索萊寶科技有限公司，CKK-8試劑盒購自翌圣生物科技股份有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測試劑盒購自蘭杰柯科技有限公司；山羊抗兔IgG-HRP購自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；E-Cadherin、N-Cadherin抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；P-gp、BCRP抗體購自美國Abcam公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；酶標(biāo)儀購自上海閃譜公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)條件

MCF-7細(xì)胞使用RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。細(xì)胞傳代用含0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化。

1.3 構(gòu)建人乳腺癌MCF-7/Taxol細(xì)胞株

采用低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞[10]。復(fù)蘇MCF-7細(xì)胞，常規(guī)條件下培養(yǎng)2～3代。紫杉醇對親本細(xì)胞MCF-7的半數(shù)抑制濃度(half-inhibitory concentration IC50)的0.1作為起始濃度，待每個紫杉醇濃度處理細(xì)胞穩(wěn)定生長后再逐步提高藥物濃度，CCK-8法檢測紫杉醇對耐藥株細(xì)胞的IC50，計算耐藥指數(shù)(resistance factor RF)，RF=IC50(MCF-7/Taxol)/IC50(MCF-7)。成功構(gòu)建耐藥細(xì)胞，停藥2個月，細(xì)胞穩(wěn)定成長，委托上海軒瑋生物科技服務(wù)中心給予MCF-7/Taxol細(xì)胞進(jìn)行STR鑒定。

1.4 CCK-8法檢測紫杉醇對MCF-7及MCF-7/Taxol細(xì)胞的毒性

收集對數(shù)生長期的親本MCF-7及MCF-7/Taxol細(xì)胞接種于96孔板，稀釋細(xì)胞至數(shù)量為1×104～1×105個/毫升左右，每孔加入100 μL細(xì)胞混懸液，待細(xì)胞貼壁24 h后吸去上清液，分為3組，實驗組在每孔中加入含有不同濃度的紫杉醇培養(yǎng)液，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)液；空白組是不含細(xì)胞和藥物的培養(yǎng)液。每組設(shè)3個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑溶液，37 ℃孵育2 h。在多功能酶標(biāo)儀450 nm波長處測量各個孔吸光值(OD值)。計算各組細(xì)胞抑制率(inhibitory concentration IR)，IR=1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。實驗重復(fù)3次，Graphpad prism 9軟件計算各組細(xì)胞IC50。

1.5 CCK-8法檢測阿帕替尼對MCF-7/Taxol細(xì)胞的毒性及耐藥逆轉(zhuǎn)作用

分別加入2.5、5、10、20、40、80 μmol/L阿帕替尼加入親本MCF-7細(xì)胞；2.5、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L加入MCF-7/Taxol耐藥細(xì)胞株。計算各組細(xì)胞IR，選取阿帕替尼一高一低2個逆轉(zhuǎn)濃度聯(lián)合紫杉醇，計算聯(lián)合阿帕替尼前后紫杉醇對MCF-7/Taxol細(xì)胞IC50的變化。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

利用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測MCF-7/Taxol各組細(xì)胞凋亡率的變化。實驗分4組，空白對照組(A組)，紫杉醇無毒劑量組(B組)，阿帕替尼低毒濃度劑量組(C組)，紫杉醇無毒劑量聯(lián)合阿帕替尼低毒濃度劑量組(D組)處理MCF-7/Taxol細(xì)胞48 h后，分別收集各組細(xì)胞，加入適量不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞3次后收集細(xì)胞，按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，取100 μL的重懸細(xì)胞中加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混均，室溫避光孵育10 min，上機(jī)前5 min加入10 μL碘化丙啶混勻，再加入400 μL PBS重懸細(xì)胞上機(jī)。導(dǎo)出實驗數(shù)據(jù)后用FlowJo軟件分析各組細(xì)胞的凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布

實驗分組同細(xì)胞凋亡檢測分組一致，收集各組的細(xì)胞沉淀，棄上清液，按照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書，用預(yù)冷PBS洗滌2次，加入25 μL碘化丙啶染色液和10 μL RNaseA，混合均勻。再加入0.5 mL碘化丙啶染色液，輕輕混合重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光孵育30 min上機(jī)，應(yīng)用Modfit軟件分析各組細(xì)胞周期分布變化情況。

1.8 Western Blot檢測MCF-7/Taxol細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的變化

實驗分組同細(xì)胞凋亡檢測分組一致，處理MCF-7/Taxol細(xì)胞48 h后，用預(yù)冷的PBS洗3次，盡量吸干殘液后加入含有PMSF的細(xì)胞裂解液150 μL，低溫裂解10 min后，將液體轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，加入5×Loading buffer(按4∶1的比例)，100 ℃煮沸10 min。上樣進(jìn)行SDS-PAGE膠制作，通過電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，將膜浸在封閉液中37 ℃封閉；將膜取出直接放入一抗E-Cadherin(1∶1000稀釋)、N-Cadherin(1∶1000稀釋)、P-gp(1∶2000稀釋)、BCRP(1∶1000稀釋)、β-actin(1∶1000稀釋)，4 ℃過夜；PBST洗膜，每次5 min，洗4次；將膜轉(zhuǎn)入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶20 000稀釋)中，37 ℃孵育40 min；PBST洗膜，每次5 min，洗5次；用化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPASS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用ANOVA方法單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建MCF-7/Taxol細(xì)胞株及耐藥指數(shù)的測定

通過不斷增加紫杉醇濃度，成功構(gòu)建MCF-7/Taxol細(xì)胞株，該細(xì)胞株可以在600 nmol/L紫杉醇濃度中穩(wěn)定生長，其RF=88。撤藥2個月后，MCF-7/Taxol細(xì)胞進(jìn)行STR分型結(jié)果顯示來源于MCF-7細(xì)胞系，不存在交叉污染現(xiàn)象。紫杉醇作用于MCF-7/Taxol的IC50=(659.9±22.27)nmol/L，見圖1A；對同步傳代的MCF-7細(xì)胞的IC50=(17.81±2.27)nmol/L，見圖1B。RF=37，表明MCF-7/Taxol細(xì)胞株具有耐藥性。根據(jù)實驗結(jié)果選取100 nmol/L作為紫杉醇無毒劑量濃度。

圖1 不同濃度紫杉醇作用于MCF-7/Taxol及MCF-7的細(xì)胞增殖抑制率

2.2 阿帕替尼對MCF-7及MCF-7/Taxol細(xì)胞毒性的影響

將不同濃度的阿帕替尼作用于MCF-7和MCF-7/Taxol細(xì)胞株，CCK-8實驗結(jié)果分析阿帕替尼對MCF-7細(xì)胞的IC50=(20.83±0.41)μmol/L，見圖2A，MCF-7/Taxol細(xì)胞的IC50=(35.06±0.94)μmol/L，見圖2B；根據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)顯示阿帕替尼對MCF-7/Taxol不具有耐藥性。

圖2 不同濃度阿帕替尼作用于MCF-7及MCF-7/Taxol的細(xì)胞增殖抑制率

2.3 阿帕替尼對MCF/Taxol細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的影響

選取對耐藥株細(xì)胞抑制小于10%的濃度作為逆轉(zhuǎn)劑在體外實驗中的聯(lián)用濃度。選取阿帕替尼2.5 μmol/L和5 μmol/L作為逆轉(zhuǎn)劑量，與不同濃度的紫杉醇聯(lián)用，其MCF-7/Taxol分別為IC50=(344.7±9.32)nmol/L見圖3A、IC50=(174.1±6.11)nmol/L見圖3B，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別是1.9倍和3.7倍。實驗結(jié)果表明阿帕替尼作用于MCF-7/Taxol細(xì)胞株具有逆轉(zhuǎn)耐藥作用，并且5 μmol/L比2.5 μmol/L逆轉(zhuǎn)作用明顯增加，后續(xù)實驗選取5 μmol/L的阿帕替尼作為低濃度逆轉(zhuǎn)劑量。

圖3 不同濃度阿帕替尼作用于MCF-7/Taxol細(xì)胞增殖抑制率

2.4 阿帕替尼對MCF-7/Taxol細(xì)胞凋亡的影響

本實驗分為4組，A組未加任何藥物的空白對照組；B組加入100 nmol/L紫杉醇；C組加入5 μmol/L阿帕替尼；D組加入100 nmol/L紫杉醇聯(lián)合5 μmol/L阿帕替尼。各組藥物作用于MCF-7/Taxol細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)分析其結(jié)果，見圖4。阿帕替尼聯(lián)合紫杉醇組細(xì)胞總凋亡率為(20.42±1.17)%，與空白對照組(10.17±0.05)%、紫杉醇組(12.4±0.07)%、阿帕替尼組的細(xì)胞凋亡率(13.98±0.25)%比較，細(xì)胞凋亡率升高；紫杉醇組，阿帕替尼組及聯(lián)合組進(jìn)行兩兩比較，細(xì)胞凋亡率均有升高(P<0.05)，見圖5。

A：空白對照組；B：紫杉醇組；C：阿帕替尼組；D：紫杉醇聯(lián)合阿帕替尼組

對比空白對照組aP<0.05；對比紫杉醇組bP<0.05；對比阿帕替尼組cP<0.05

2.5 阿帕替尼對MCF-7/Taxol細(xì)胞周期的影響

各組細(xì)胞周期分布的變化見圖6。與空白對照組比較，紫杉醇組、阿帕替尼組、阿帕替尼聯(lián)合紫杉醇組G0/G1期分布減少，其差異具有統(tǒng)計學(xué)有差異(P<0.05)；與空白對照組比較，紫杉醇組、阿帕替尼聯(lián)合紫杉醇組G2/M期分布增加(P<0.05)，阿帕替尼組G2/M期差異不明顯(P>0.05)；與紫杉醇組、阿帕替尼組G2/M期比較，阿帕替尼聯(lián)合紫杉醇組G2/M期增加(P<0.05)，見圖7。

A：空白對照組；B：紫杉醇組；C：阿帕替尼組；D：紫杉醇聯(lián)合阿帕替尼組

對比空白對照組aP<0.05；對比紫杉醇組bP<0.05；對比阿帕替尼組cP<0.05

2.6 阿帕替尼對MCF-7/Taxol細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的影響

Western Blot實驗結(jié)果顯示，阿帕替尼聯(lián)合紫杉醇組作用MCF-7/Taxol細(xì)胞48 h后，與空白對照組、紫杉醇組、阿帕替尼組比較，P-gp蛋白和BCRP蛋白表達(dá)變化不明顯(P>0.05)。進(jìn)一步探究阿帕替尼逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥是否與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。阿帕替尼聯(lián)合紫杉醇處理MCF-7/Taxol細(xì)胞48 h后，與空白對照組、紫杉醇組、阿帕替尼組比較，MCF-7/Taxol細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白變化不明顯(P>0.05)，見圖8。

3 討 論

紫杉醇是乳腺癌治療最常見的化療藥物，但紫杉醇耐藥是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療的主要障礙。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的過度表達(dá)是導(dǎo)致紫杉醇耐藥最常見機(jī)制之一，其中P-gp、BCRP蛋白是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中常見的耐藥蛋白，通過將多種化療藥物直接排出腫瘤細(xì)胞體外產(chǎn)生耐藥性[11]。因此，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白小分子抑制劑是克服傳統(tǒng)抗腫瘤藥物耐藥的一種新的策略。國外學(xué)者研究表明TKI藥物(如波齊替尼、拉帕替尼)具有抑制P-gp外排功能，逆轉(zhuǎn)卵巢癌多藥耐藥[12]。阿帕替尼與其他小分子TKI相比具有更高的抑制血管生成活性，通過抑制膜結(jié)合的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排功能來逆轉(zhuǎn)多藥耐藥[13]。但阿帕替尼是否逆轉(zhuǎn)乳腺癌紫杉醇耐藥及機(jī)制研究報道少見。

阿帕替尼是一種小分子TKI，臨床研究數(shù)據(jù)[14]顯示晚期乳腺癌患者可從小劑量阿帕替尼治療中獲益?；A(chǔ)實驗[15]證明阿帕替尼具有抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的能力。最近研究[16]表明阿帕替尼聯(lián)合白蛋白紫杉醇協(xié)同誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果顯示低毒濃度的阿帕替尼聯(lián)合紫杉醇藥物處理MCF-7/Taxol細(xì)胞株后，紫杉醇的IC50值下降，表明阿帕替尼具有逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥的作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示阿帕替尼促進(jìn)MCF-7/Taxol耐藥株的凋亡，聯(lián)合紫杉醇增加耐藥株細(xì)胞的凋亡率。阿帕替尼不影響MCF-7/Taxol細(xì)胞周期變化，但聯(lián)合紫杉醇藥物增加MCF-7/Taxol細(xì)胞G2/M期分布。本實驗結(jié)果表明阿帕替尼和紫杉醇的聯(lián)合治療具有協(xié)同作用，通過調(diào)節(jié)MCF-7/Taxol耐藥株細(xì)胞凋亡和周期變化，一定程度上增加了紫杉醇對耐藥株細(xì)胞抗腫瘤作用的敏感性。

逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的方式[17]不僅通過抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的外排功能，也通過下調(diào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)來完成。本實驗通過Western Blot實驗驗證低毒濃度的阿帕替尼對MCF-7/Taxol細(xì)胞外排性轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp和BCRP蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果提示阿帕替尼不是通過下調(diào)紫杉醇耐藥株細(xì)胞中 P-gp和BCRP蛋白的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)耐藥。張圣村等學(xué)者表明[18]阿帕替尼可能是一種P-gp底物競爭性抑制劑，可能通過與紫杉醇競爭性結(jié)合ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的ATP催化位點，抑制紫杉醇藥物外流，誘導(dǎo)多藥耐藥逆轉(zhuǎn)，從而增加化療敏感性。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)是腫瘤細(xì)胞從上皮樣轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)樣表型或部分間充質(zhì)表型，對腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和化療的耐藥性方面具有潛在的作用[19]。國內(nèi)學(xué)者研究表明EMT在乳腺癌紫杉醇耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用，MCF-7/Taxol細(xì)胞發(fā)生EMT且具有較強(qiáng)的耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移能力[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿帕替尼作用于MCF-7/Taxol細(xì)胞，EMT相關(guān)蛋白E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白變化不明顯，顯示阿帕替尼逆轉(zhuǎn)紫杉醇乳腺癌耐藥的發(fā)生與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程可能不相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果證明阿帕替尼具有逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥的作用，通過聯(lián)合紫杉醇藥物促進(jìn) MCF-7/Taxol耐藥株的凋亡和細(xì)胞周期分布于G2/M期，增強(qiáng)紫杉醇藥物敏感性，是一種有潛力的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥藥物。但是阿帕替尼逆轉(zhuǎn)乳腺癌紫杉醇耐藥的機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究驗證，為今后臨床應(yīng)用提供更充分的實驗依據(jù)。