己糖激酶Ⅱ在乳腺癌中的表達(dá)及對細(xì)胞增殖能力的影響

王翠瑤，單良，岳金金，龐一心，張秀梅

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 錦州 121000)

葡萄糖是正常組織細(xì)胞的最重要能源，在細(xì)胞內(nèi)有兩條主要的產(chǎn)能途徑：無氧氧化和有氧氧化。正常細(xì)胞在有氧環(huán)境中通常依靠有氧氧化來供能，只有在缺氧條件下以無氧氧化來供能，糖的無氧氧化又稱糖酵解，是一條低效的產(chǎn)能途徑，因此正常細(xì)胞有氧氧化通常抑制無氧氧化，被稱為巴斯德效應(yīng)。但已有研究證實(shí)：腫瘤細(xì)胞為滿足其快速增殖的需要，需要消耗大量的葡萄糖，即使在氧氣充足的條件下，也主要依靠無氧氧化供能，這種代謝特征被稱為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解[1]。有氧糖酵解為腫瘤細(xì)胞的生長提供以下優(yōu)勢：一是迅速產(chǎn)生能量；二是為腫瘤細(xì)胞生物大分子的合成提供原料。有氧糖酵解作為腫瘤標(biāo)志性特征被廣泛接受，目前靶向糖酵解的抗腫瘤藥物正在研制中[2]。糖無氧氧化的代謝過程是將葡萄糖經(jīng)6-磷酸葡萄糖等一系列代謝轉(zhuǎn)變最后生成乳酸。己糖激酶(hexokinase,HK)是糖無氧氧化的第一個(gè)關(guān)鍵酶，催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖的反應(yīng)。HK 催化的反應(yīng)中間產(chǎn)物也是調(diào)節(jié)糖代謝和其他生物合成途徑的一個(gè)焦點(diǎn)。因此HK成為調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)己糖激酶存在4種同工酶(HKⅠ、HKⅡ、HKⅢ和HKⅣ)，在這些同工酶中，HKⅡ在多種腫瘤中過量表達(dá)，并與不良預(yù)后密切相關(guān)[3-6]。本研究旨在探討HKⅡ調(diào)控乳腺癌細(xì)胞葡萄糖消耗、生長增殖及其在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織樣本中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性，從而為揭示乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制并為乳腺癌的臨床診療提供詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞是本實(shí)驗(yàn)室自有細(xì)胞，浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織芯片(包括138例浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織芯片和69例相應(yīng)的癌旁組織芯片)購自上海芯超公司，并委托上海芯超公司完成免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)及后期統(tǒng)計(jì)工作。HKⅡ干擾RNA購自上海吉瑪公司，葡萄糖檢測試劑盒購自南京建成公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染

MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞在RPMI-1640完全培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)接種于6孔板或12孔板中，待細(xì)胞密度至60%～70%開始轉(zhuǎn)染HKⅡ-shRNA和shRNA-control，其序列分別為shRNA-HKⅡ#1：5'-CTGGCTAACTTCATGGATA-3'，shRNA-HKⅡ#2：5'-TGAGTTTGACCAGGAGATT-3'，shRNA-HKⅡ#3：5'-CTGTGAAGTTGGCCTCATT-3'，shRNA-control：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清和雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)液。

1.2.2 采用Western Blot法檢測HKⅡ蛋白的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染過程同上，于換液后36 h時(shí)棄去培養(yǎng)液收集細(xì)胞。采用IP裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白樣品加入相應(yīng)比例的SDS凝膠上樣緩沖液 (5×Loading Buffer)，煮沸變性5 min，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后75 V轉(zhuǎn)膜2.5 h。TBST稍加漂洗PVDF膜后放在封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)中室溫封閉1 h，用HKⅡ和Actin抗體4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后用二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌后ECL發(fā)光，Western Blot成像系統(tǒng)采集圖象。

1.2.3 檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度

轉(zhuǎn)染過程同上，MCF7和MDA-MB-231轉(zhuǎn)染30 h后收集并更換1次完全培養(yǎng)液，換液6 h后再分別收集培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔板中，分組情況同前。待細(xì)胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)染shRNA-HKⅡ。轉(zhuǎn)染72 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，37 ℃避光孵育4 h后，棄去液體，每孔再加入150 μL DMSO，震蕩2 min使結(jié)晶完全溶解后檢測490 nm波長處的吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=實(shí)驗(yàn)組A490/對照組A490×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 HKⅡ在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平

A：HKⅡ在癌旁組織的表達(dá)情況；B：HKⅡ在乳腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)情況

表1 HKⅡ在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌及癌旁組織中的差異表達(dá)(%)

2.2 浸潤性乳腺導(dǎo)管癌中HKⅡ的表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系

采用Spearman檢驗(yàn)分析138例浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者中HKⅡ的表達(dá)與浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的年齡、性別、TNM分期、病理分期等臨床特征的關(guān)系。結(jié)果顯示HKⅡ的表達(dá)與浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的年齡、性別、TNM分期和病理分期均無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

表2 HKⅡ的表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性

2.3 HKⅡ表達(dá)水平與乳腺癌患者生存的關(guān)系

我們首先在138例浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者中進(jìn)一步分析HKⅡ的表達(dá)水平與乳腺癌患者生存的相關(guān)性。通過繪制Kaplan-Meier生存曲線和采用Log-rank進(jìn)行檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，HKⅡ的表達(dá)水平與浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的總生存期(P<0.001)顯著相關(guān)，Kaplan-Meier生存曲線趨勢提示HKⅡ高表達(dá)的乳腺癌患者生存期低于HKⅡ低表達(dá)患者，見圖2A。這些結(jié)果提示：HKⅡ的表達(dá)水平與浸潤性乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)，HKⅡ高表達(dá)不利于浸潤性乳腺導(dǎo)管癌的預(yù)后。接下來我們又進(jìn)一步對選自KMPLOT 數(shù)據(jù)庫的3951位乳腺癌患者HKⅡ的表達(dá)水平與其生存期的相關(guān)性進(jìn)行分析，Kaplan-Meier生存曲線趨勢也提示HKⅡ高表達(dá)的乳腺癌患者生存期也明顯低于HKⅡ低表達(dá)患者，見圖2B。

A:138例浸潤性乳腺癌患者的Kaplan-Meier分析；B：KMPLOT 數(shù)據(jù)庫的3951位乳腺癌患者的Kaplan-Meier分析

2.4 乳腺癌患者生存影響因素

采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素分析后的結(jié)果表明：HKⅡ的表達(dá)情況影響乳腺癌患者的總生存期，HKⅡ高表達(dá)是影響乳腺癌患者總生存期的危險(xiǎn)因素。多因素分析顯示，HKⅡ的表達(dá)水平是影響乳腺癌患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，HKⅡ高表達(dá)的乳腺癌患者的總生存期(P=0.001；HR=3.333，95%CI：1.630～6.816)較低表達(dá)患者更短，見表3。綜上所述，HKⅡ高表達(dá)提示浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的預(yù)后不良。

表3 乳腺癌患者總生存期影響因素的比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

2.5 HKⅡ促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞葡萄糖消耗和生長增殖

HKⅡ是糖酵解途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，催化糖酵解途徑的第一步不可逆反應(yīng)，即將葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，故推測沉默HKⅡ可能影響乳腺癌細(xì)胞對葡萄糖的攝取。首先我們采用shRNA-HKⅡ和shRNA-control轉(zhuǎn)染MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞，并通過Western Blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，見圖3A。接下來采用葡萄糖檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，結(jié)果顯示：沉默HKⅡ后細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度明顯增加，見圖3B，這表明HKⅡ促進(jìn)葡萄糖的攝取。那么HKⅡ是否通過葡萄糖代謝進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的生長增殖？我們接下來采用MTT法檢測干擾HKⅡ后乳腺癌細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示：沉默HKⅡ后，乳腺癌細(xì)胞的增殖明顯減慢，結(jié)果提示：HKⅡ通過促進(jìn)糖代謝進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，見圖3C。

A:HKⅡ干擾效率；B:HKⅡ干擾后培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度；C:HKⅡ干擾后細(xì)胞增殖情況；*P<0.05，#P>0.05

3 討 論

目前乳腺癌的診斷、治療和預(yù)后雖然已經(jīng)取得了比較明顯的進(jìn)展，但長期生存率仍不令人滿意。因此，發(fā)現(xiàn)并深入研究更有效的乳腺癌早期診斷的分子靶標(biāo)是改善乳腺癌患者生存質(zhì)量及提高其生存率的關(guān)鍵[7-11]。HKⅡ作為HK組織特異性同工酶亞型之一，是催化糖無氧氧化的第一個(gè)關(guān)鍵酶，該酶催化的葡萄糖分解代謝途徑中最上游的反應(yīng)，其活性的增加對于將葡萄糖轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞的磷酸戊糖途徑等分支途徑中至關(guān)重要。已有研究證實(shí)HKⅡ在多種腫瘤中表達(dá)異常升高，葡萄糖無氧氧化的流量亦顯著增加[12-13]。腫瘤細(xì)胞中過度的無氧氧化產(chǎn)生大量乳酸造成腫瘤微環(huán)境的酸化，也是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵誘因，HKⅡ過表達(dá)可促進(jìn)糖酵解及腫瘤細(xì)胞的生長增殖或侵襲轉(zhuǎn)移過程。本研究發(fā)現(xiàn)，在69對乳腺癌病理樣本中，浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者癌組織中HKⅡ的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。HKⅡ在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌中可能是扮演癌基因的角色。同時(shí)提示其可能與臨床病理特征和預(yù)后相關(guān)。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HKⅡ的表達(dá)水平與浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的生存期存在相關(guān)性。單因素生存分析提示，相較于HKⅡ低表達(dá)患者，高表達(dá)患者總體生存期更短。多因素生存分析提示，HKⅡ高表達(dá)是浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上結(jié)果為探索浸潤性乳腺導(dǎo)管癌的病理機(jī)制提供一定參考，也可能為乳腺癌的臨床診斷和治療提供靶點(diǎn)。已有研究證實(shí)HKⅡ是喉鱗狀細(xì)胞癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和胃腺癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物,與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

已有研究證實(shí)HKⅡ高表達(dá)與膽囊腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后顯著相關(guān)，抑制HKⅡ的表達(dá)可顯著抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)大大降低了細(xì)胞對葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)量[14]。在肝細(xì)胞癌中的研究也發(fā)現(xiàn)：敲除HKⅡ可以抑制肝癌細(xì)胞的糖酵解水平而促進(jìn)氧化磷酸化并增加腫瘤細(xì)胞對二甲雙胍的敏感性[15]。因此本研究在細(xì)胞水平探討HKⅡ?qū)θ橄侔┘?xì)胞葡萄糖消耗和細(xì)胞增殖的影響。我們在MCF7和MDA-MB-231中沉默HKⅡ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消耗的葡萄糖明顯減少，這說明抑制HKⅡ的表達(dá)可以抑制糖酵解的流量，減少細(xì)胞對葡萄糖的攝取。有研究表明腫瘤細(xì)胞通過增加糖酵解的流量為其快速增殖所需的生物大分子的合成提供原料[16-19]。那么在乳腺癌細(xì)胞中干擾HKⅡ的表達(dá)是否能夠抑制細(xì)胞增殖？本研究結(jié)果顯示，在MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞中干擾HKⅡ的表達(dá)顯著抑制細(xì)胞增殖。因此我們的研究證實(shí)在乳腺癌細(xì)胞中通過抑制HKⅡ的基因表達(dá)抑制了細(xì)胞對葡萄糖的攝取，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，HKⅡ促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞糖酵解及生長增殖，參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，而且是乳腺癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究?？傊?，通過抑制HKⅡ表達(dá)來降低糖酵解水平可為靶向HKⅡ進(jìn)行乳腺癌治療提供理論指導(dǎo)。