超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助提取桑葉蛋白質(zhì)工藝研究

傅海慶，張 瀅

（1.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院飲食文化傳承研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

桑葉作為“藥食兩用”的桑樹（Morus alba L.）的葉片，因含有豐富的生物活性物質(zhì)，如黃酮類、生物堿、多糖類、氨基酸和1-脫氧野尻霉素等[1-4]，在治療肺氣失和、清肝瀉火氣、解毒明雙目、降“三高”、抗癌等方面具有很好的功效[4-10]。除此之外，桑葉在蛋白質(zhì)方面的含量也十分豐富，引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。而植物葉蛋白質(zhì)是世界上最大的可再生蛋白質(zhì)資源之一，是植物組織內(nèi)天然蛋白質(zhì)的濃縮物，不含膽固醇，是潛在價(jià)值高的新型蛋白質(zhì)資源[11-14]。植物葉蛋白質(zhì)的提取不僅提高了作物的附加值，還可將農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物變廢為寶，最大程度地合理利用資源[15]。植物葉蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值高、來源廣，安全性和適用性高，是一類具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能的蛋白質(zhì)[15-16]。隨著植物葉蛋白質(zhì)資源的研究開發(fā)，其提取物或加工產(chǎn)品將廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、農(nóng)藥、化妝品等領(lǐng)域[12]，其最為重要的意義是能有效緩解糧食危機(jī)[11，16]。目前，國內(nèi)外對于植物葉蛋白質(zhì)的開發(fā)研究利用較多的主要是苜蓿葉、黑麥草、煙葉、葉類蔬菜、子粒莧葉、刺槐葉及牧草葉、水生植物等，對桑葉蛋白提取利用較少[17]。桑樹作為一種高蛋白植物[18]，不同桑樹品種其葉片蛋白質(zhì)含量為13.4~32.8g/100g，平均蛋白質(zhì)含量為21.5±0.4g/100g[19]；有些桑葉品種甚至比畜禽肉所含的蛋白質(zhì)量還要高，而大多數(shù)植物葉片蛋白質(zhì)含量只有10%左右[17]；桑葉蛋白中的氨基酸種類較豐富而齊全，必需氨基酸含量較高，特別是其中的降壓物質(zhì)γ-氨基丁酸含量達(dá)到了226 mg/100 g干桑葉，且不含動(dòng)物性膽固醇，是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，符合消費(fèi)者對蛋白食品的要求[17，20-21]。目前，市面上與桑葉相關(guān)的產(chǎn)品主要有桑葉粉、桑葉茶、脫水桑葉菜、桑葉面條、桑葉豆腐、桑葉調(diào)味醬等一些初加工產(chǎn)品，而以蛋白質(zhì)為主要成分的深加工產(chǎn)品應(yīng)用較為少見[22-24]，這可能與桑葉蛋白質(zhì)的提取工藝技術(shù)尚未滿足工業(yè)應(yīng)用需要有關(guān)。桑葉蛋白質(zhì)的主要提取方法有水浸出法[25]、酸堿沉淀法[17]、鹽析法[11，26]、超聲波輔助提取法[17，27-30]、微波輔助提取法[20]、纖維素酶輔助提取法[30-31]、乳酸發(fā)酵法[11，26，32]、反膠束法[26]、納米器件輔助法[33]等，其粗蛋白提取得率多為5.0%~10.5%。不同提取方法所依據(jù)的原理不同，故各種提取方法具有不同的提取率和優(yōu)缺點(diǎn)[12]，但現(xiàn)有報(bào)道的提取率總體偏低。目前，我國桑葉的原料資源十分充足，不僅桑葉種植粗放、生產(chǎn)成本低廉，而且產(chǎn)量極高[34]，如能提高桑葉蛋白質(zhì)的提取率，開發(fā)成天然保健產(chǎn)品或作為其他食品的原輔料成分，則其應(yīng)用潛力巨大。綜合應(yīng)用多種提取原理，在超聲波輔助提取的基礎(chǔ)上，結(jié)合纖維素酶法進(jìn)行提取，以探索桑葉蛋白質(zhì)的提取方法，形成更好的提取工藝技術(shù)，為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

桑葉粉（經(jīng)超微粉碎工藝而得，含蛋白質(zhì)20.6%），安徽奧祥堂健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供；纖維素酶（10 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司提供；氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；JY92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；PB-10型pH測定儀，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；XMTE-205型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司產(chǎn)品；DHG-9030型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲波輔助提取桑葉蛋白質(zhì)的工藝流程

主要工藝流程：桑葉粉→添加NaCl溶液→超聲波處理→水浴浸提→離心得上清液→調(diào)節(jié)pH值使蛋白質(zhì)沉淀→離心得沉淀物→干燥→粗蛋白樣品。

在前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，擬定主要操作要點(diǎn)為：稱取5 g的桑葉粉，按料液比1∶20（g∶mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的NaCl溶液，經(jīng)功率為100 W的超聲處理20 min后，于50℃水浴浸提40 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min得上清液，調(diào)節(jié)上清液pH值3.0以沉淀蛋白質(zhì)，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min得到沉淀物，于60℃下熱風(fēng)干燥沉淀物至恒質(zhì)量即可得到桑葉粗蛋白[17，27-30]。在研究上述不同工藝因素對蛋白質(zhì)提取率的影響時(shí)，只改變該因素的水平，其他因素水平基本保持不變。

1.3.2 超聲波輔助提取桑葉蛋白質(zhì)單因素試驗(yàn)

分別從超聲功率、超聲處理時(shí)間、浸提溫度、浸提時(shí)間、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、沉淀時(shí)的pH值等方面進(jìn)行研究，以超聲波輔助法提取桑葉蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，研究不同因素水平對蛋白質(zhì)提取率的影響，每個(gè)因素水平至少進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取其平均值進(jìn)行分析。

（1）超聲功率對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。在提取桑葉葉蛋白的工藝流程中，分別設(shè)置超聲功率為0，100，200，300，400，500 W，其他工藝參數(shù)基本不變（其中料液比為1∶25），研究超聲功率對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。

（2）超聲時(shí)間對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。在提取桑葉葉蛋白的工藝流程中，分別設(shè)置超聲處理時(shí)間為0，10，20，30，40 min，其他工藝參數(shù)基本不變（其中料液比為1∶25，超聲功率為400 W），研究超聲處理時(shí)間對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。

（3）NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。在提取桑葉蛋白質(zhì)的工藝流程中，分別設(shè)置NaCl溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%作為浸出溶劑，其他工藝參數(shù)基本不變（其中水浴浸提時(shí)間為50 min），研究NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。

（4）料液比對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。在提取桑葉蛋白質(zhì)的工藝流程中，分別設(shè)置料液比為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35進(jìn)行提取，其他工藝參數(shù)基本不變（其中水浴浸提時(shí)間為30 min），研究料液比對提取桑葉蛋白質(zhì)得率的影響。

（5）水浴浸提溫度對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。在提取桑葉蛋白質(zhì)的工藝流程中，分別設(shè)置水浴浸提溫度為30，40，50，60，70℃進(jìn)行試驗(yàn)，其他工藝參數(shù)基本不變（其中水浴浸提時(shí)間為60 min），研究水浴浸提溫度對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。

（6）水浴浸提時(shí)間對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。在提取桑葉蛋白質(zhì)的工藝流程中，分別設(shè)置水浴浸提時(shí)間為10，20，30，40，50，60 min，其他工藝參數(shù)基本不變，研究水浴浸提時(shí)間對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。

（7）酸沉淀pH值對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。在提取桑葉蛋白質(zhì)的工藝流程中，分別設(shè)置酸沉淀pH值為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0進(jìn)行試驗(yàn)，其他工藝參數(shù)基本不變（其中水浴浸提時(shí)間為60 min），研究酸沉淀pH值對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.3 超聲波輔助提取桑葉蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選出對提取提取率影響較大、最佳水平不確切的水浴浸提溫度、超聲功率、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比等4個(gè)重要因素作為變量，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)L9（34），進(jìn)一步優(yōu)化主要因素水平對桑葉蛋白質(zhì)提取提取率的影響。

超聲波輔助提取桑葉蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 超聲波輔助提取桑葉蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.4 超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助提取桑葉蛋白質(zhì)的工藝流程

桑葉粉→添加NaCl溶液→超聲處理→水浴浸提→離心得上清液→調(diào)節(jié)沉淀物的pH值→添加纖維素酶分解→離心得上清液→合并2次上清液→調(diào)節(jié)pH值使蛋白質(zhì)沉淀→離心得沉淀物→干燥→粗蛋白樣品。

在前述及前人的研究基礎(chǔ)上，擬定主要操作要點(diǎn)為：稱取5 g的桑葉粉，按料液比1∶28（g∶mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液，經(jīng)功率為150 W的超聲處理30 min后，于50℃水浴中浸提50 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min得上清液；調(diào)節(jié)沉淀物的pH值到5.0，按4%添加纖維素酶，于50℃下酶解40 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min得上清液；合并2次所得上清液，調(diào)節(jié)上清液pH值到3.0以沉淀蛋白質(zhì)，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min得到沉淀物，于60℃下熱風(fēng)干燥沉淀物至恒質(zhì)量即可得到桑葉粗蛋白[31，35]。在研究上述不同工藝因素對蛋白質(zhì)提取率的影響時(shí)，只改變該因素的水平，其他因素水平基本保持不變。

1.3.5 超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助提取桑葉蛋白質(zhì)的單因素試驗(yàn)

根據(jù)纖維素酶的產(chǎn)品使用說明、酶解特性及其前人的研究基礎(chǔ)，只選擇纖維素酶添加量和纖維素酶酶解時(shí)間2個(gè)方面作為重要單因素進(jìn)行研究，各因素水平至少進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取其平均值進(jìn)行分析。

（1）酶添加量對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。在上述提取桑葉蛋白質(zhì)的工藝流程中，分別設(shè)置纖維素酶的添加量為0，1%，2%，3%，4%，5%進(jìn)行研究，其他因素水平基本保持不變，以研究酶添加量對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。

（2）酶分解時(shí)間對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。在上述提取桑葉蛋白質(zhì)的工藝流程中，分別設(shè)置酶解時(shí)間為30，40，50，60，70，80 min進(jìn)行研究，其他因素水平基本保持不變，以研究酶解時(shí)間對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.6 超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助提取桑葉蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)

結(jié)合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)兩因素三水平的正交試驗(yàn)L9（32），以進(jìn)一步優(yōu)化各因素水平。

超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助提取桑葉蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助提取桑葉葉蛋白的正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.7 桑葉蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算

式中：m1——所用桑葉粉質(zhì)量，g；

m2——桑葉粗蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)的分析及圖表的繪制使用Microsoft Excel 2016、SPSS 17.0等軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助法單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同超聲功率處理對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

不同超聲功率對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖1。

超聲波輔助處理可以粉碎桑葉細(xì)胞的細(xì)胞壁，有效增加桑葉蛋白質(zhì)的溶出。但使用不同的超聲功率處理，其效果不同。從圖1可以看出，隨著超聲波功率的增加，桑葉蛋白質(zhì)提取率總體顯著增加（p＜0.05）；但是當(dāng)超聲功率超過200 W時(shí)，曲線的上升趨于平緩；超聲功率為200~500 W時(shí)，得率差異不顯著，這可能是超聲波的空化作用達(dá)到一定功率時(shí)就足以破壞桑葉的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，讓蛋白質(zhì)溶出了，結(jié)合考慮節(jié)能，故選擇以200 W進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 不同超聲功率對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.2 不同超聲處理時(shí)間對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

不同超聲時(shí)間對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖2。

圖2 不同超聲時(shí)間對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

除了超聲功率之外，超聲處理時(shí)間也影響了提取桑葉蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。從圖2可以看出，在超聲功率相同的情況下，桑葉蛋白質(zhì)的得率隨著超聲處理時(shí)間的延長而顯著增加（p＜0.05），使用超聲處理的前30 min曲線的斜率較大，其后趨于平緩，其中20~40 min的提取率差異不顯著，結(jié)合大多數(shù)同行研究結(jié)果考慮，以選擇30 min作為處理時(shí)間為宜。

2.1.3 不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖3。

圖3 不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

蛋白質(zhì)在一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍的鹽溶液中會呈現(xiàn)“鹽溶”現(xiàn)象，這種現(xiàn)象增加了蛋白質(zhì)的溶解性[36]。氯化鈉溶液中的氯離子與帶正電荷的蛋白質(zhì)基團(tuán)結(jié)合，增加了蛋白質(zhì)分子之間的靜電排斥力，從而提高了蛋白質(zhì)的溶解性[32]。以不同的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行提取試驗(yàn)。

從圖3可以看出，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，提取得率顯著增加（p＜0.05），并在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí)達(dá)到最大值。這與幾位學(xué)者的研究結(jié)果有較大出入，多數(shù)選擇0.3%~0.4% NaCl溶液進(jìn)行提取[17，27-28]，其中原因是否與NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高還會導(dǎo)致核酸提取量的增加有關(guān)而選擇低質(zhì)量分?jǐn)?shù)有待進(jìn)一步研究[28]。將0.8%的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為進(jìn)一步優(yōu)化研究的因素和水平。

2.1.4 不同料液比對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

不同料液比對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖4。

圖4 不同料液比對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

綜合前人研究結(jié)果，選擇料液比為1∶15~1∶35時(shí)進(jìn)行提取研究。經(jīng)方差分析，總體提取率具有顯著性差異（p＜0.05），以料液比1∶20，1∶25為相對的高點(diǎn)，結(jié)合大多數(shù)同行研究結(jié)果考慮，選擇料液比1∶25作為進(jìn)一步研究的水平。

2.1.5 不同浸提溫度對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

不同浸提溫度對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖5。

圖5 不同浸提溫度對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

試驗(yàn)了不同水浴浸提溫度對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。隨著浸提溫度的升高，桑葉蛋白質(zhì)的得率也顯著升高（p＜0.05），當(dāng)浸提溫度為50℃時(shí)，桑葉蛋白質(zhì)提取率最高；浸提溫度進(jìn)一步升高，桑葉蛋白質(zhì)提取率沒有顯著差異，甚至有些下降趨勢，這可能是蛋白質(zhì)在高溫下會發(fā)生變性溶解等不良變化所致[32]。故選擇50℃作為浸提溫度為宜。但有學(xué)者認(rèn)為在30，40℃時(shí)的提取率更高[17，30]；這有待進(jìn)一步優(yōu)化研究。

2.1.6 不同浸提時(shí)間對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

不同浸提時(shí)間對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖6。

圖6 不同浸提時(shí)間對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

試驗(yàn)了不同浸提時(shí)間對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。桑葉蛋白質(zhì)提取率隨著浸出時(shí)間的延長而呈顯著增加趨勢（p＜0.05），但超過50 min后提取率顯著下降，這可能是由于加熱時(shí)間過長而發(fā)生桑葉蛋白質(zhì)的凝集現(xiàn)象，提取時(shí)與殘?jiān)黄鸱蛛x造成損失所致。該浸提時(shí)間比不少學(xué)者研究的要節(jié)約不少時(shí)間，甚至可節(jié)約30 min，故以浸提時(shí)間50 min為宜。

2.1.7 不同酸沉淀pH值對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

不同酸沉淀pH值對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖7。

圖7 不同酸沉淀pH值對提取桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

不同蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，需要調(diào)節(jié)不同的pH值得以沉淀。從圖7可以看出，桑葉蛋白質(zhì)的沉淀在pH值為2.0~4.0時(shí)，能有較高的提取率；經(jīng)方差分析，總體提取率具有顯著性差異（p＜0.05），而以pH值為2.0時(shí)最高，這與部分學(xué)者的研究結(jié)果一致[17，29]，故以pH值2.0為最適沉淀桑葉蛋白質(zhì)的酸度。

2.2 超聲波輔助法正交試驗(yàn)結(jié)果

在分析上述單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，優(yōu)先篩選出NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、水浴浸提溫度等4個(gè)重要因素或與同行結(jié)果出入較大的因素作進(jìn)一步的正交試驗(yàn)L9（34），以獲得更優(yōu)的參數(shù)。

超聲波輔助法正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 超聲波輔助法正交試驗(yàn)結(jié)果

從極差法分析來看，各因素影響的大小為A＞C＞B＞D，即NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對桑葉蛋白質(zhì)的提取率影響最大，其后依次是浸提溫度、料液比和超聲波功率；最佳因素水平應(yīng)為A3B3C2D1，即以0.9%的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為浸提溶劑、料液比1∶28，超聲功率150 W，浸提溫度50℃為最佳參數(shù)水平，此時(shí)桑葉蛋白質(zhì)提取率為9.43%。

2.3 超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助法單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 纖維素酶添加量對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

纖維素酶添加量對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖8。

圖8 纖維素酶添加量對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

纖維素酶能分解植物細(xì)胞壁的纖維素而破壞植物細(xì)胞壁，可增加植物蛋白質(zhì)的溶出。試驗(yàn)了纖維素酶添加量對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。從圖8可以看出，隨著酶添加量的增加，桑葉蛋白質(zhì)的產(chǎn)量逐漸上升，總體提取率具有顯著性差異（p＜0.05）；當(dāng)酶添加量超過4%時(shí)，曲線的上升趨于平緩，從降低成本考慮，以4%的酶添加量為宜。

2.3.2 纖維素酶酶解時(shí)間對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

酶解時(shí)間對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響見圖9。

圖9 酶解時(shí)間對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響

試驗(yàn)了纖維素酶酶解時(shí)間對桑葉蛋白質(zhì)提取率的影響。桑葉蛋白質(zhì)提取率隨著酶解時(shí)間的增加，呈先上升后下降的曲線，這可能是由于酶解時(shí)間太長、超過50 min時(shí)，桑葉蛋白質(zhì)會發(fā)生凝集，在過濾時(shí)與殘?jiān)黄鸨粊G棄而造成損失；總體提取得率具有顯著性差異（p＜0.05）。因此，選擇50 min的酶解時(shí)間是較合適的。

2.4 超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助法的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化。從極差法分析可知，兩因素影響的大小是E＞F，即纖維素酶添加量對桑葉蛋白質(zhì)的提取率影響更大；當(dāng)酶添加量為4.5%時(shí)，桑葉蛋白質(zhì)提取率最高，可得最佳因素水平是E3F3，即纖維素酶添加量為4.5%，酶解時(shí)間為55 min時(shí)最佳，其蛋白質(zhì)提取率可達(dá)16.06%，比前述只用超聲波輔助提取法的得率（9.43%）提高了70.31%。

超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助法正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助法正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

以桑葉粉為原料，分別研究了超聲波輔助提取法和超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助提取法提取桑葉蛋白質(zhì)的工藝，獲得最佳的提取工藝為：稱取5 g的桑葉粉，按料液比1∶28加入質(zhì)量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液，經(jīng)功率為150 W的超聲波處理30 min后，于50℃水浴浸提50 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心得上清液；調(diào)節(jié)沉淀物的pH值到5.0，按4.5%添加纖維素酶，在50℃下酶解55 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心得上清液；合并2次所得上清液，調(diào)節(jié)上清液pH值到2.0以沉淀蛋白質(zhì)，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心得到沉淀物，干燥沉淀物后即可得到桑葉粗蛋白。按此工藝進(jìn)行桑葉蛋白質(zhì)的提取，其提取率可達(dá)16.06%。

對比同行報(bào)道，王桃云等人[25]采用水浸出法，在室溫下，以水為浸提劑，打漿時(shí)間3 min，浸提時(shí)間4 min，料液比1∶5（g∶mL），浸提劑pH值8.0，絮凝溫度75℃，調(diào)節(jié)提取液pH值為5.0，8.0，13.0得到沉淀物，在60℃干燥后即得桑葉蛋白質(zhì)，其提取率為5.17%；喬璐采用0.4%的NaCl水溶液為提取溶劑，料液比為1∶30（g∶mL），400 W超聲處理20 min，在40℃下浸提80 min，于pH值2~3酸沉絮凝，沉淀干燥即得桑葉蛋白，其蛋白質(zhì)提取率為10.23%[17]；劉苗苗等人[27]研究了在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的NaCl，料液比為1∶35（g∶mL），超聲功率為100 W，超聲時(shí)間為25 min，浸提時(shí)間為55 min時(shí)的桑葉蛋白質(zhì)提取率為6.01%；王芳等人[28]以0.4%的NaCl溶液為提取溶劑，料液比為1∶30，超聲波400 W處理20 min，40℃水浴浸提60 min，其桑葉蛋白質(zhì)得率為9.93%；殷培峰等人[29]采用料液比1∶20，超聲波400 W處理20 min，50℃水浴提取70 min，pH值2沉淀，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，其桑葉蛋白質(zhì)提取率為9.52%；朱天明[30]采用經(jīng)過超微粉碎的桑葉粉為原料（100目），pH值為8.0的磷酸緩沖液為浸提劑，以超聲溫度30℃，超聲功率100 W，料液比為1∶40條件下提取60 min，離心分離得上清液，調(diào)節(jié)上清液的pH值為4.5，沉淀100 min，離心分離得到沉淀，冷凍干燥沉淀得到桑葉葉蛋白粗提取物，其蛋白質(zhì)得率為5.7%；朱天明等人[31]還研究了以桑葉粉（未超微粉碎）為原料，pH值為5.0的緩沖液為浸提劑，在最適溫度50℃，料液比1∶38，加纖維素酶（10 000 U/g）量為4%條件下酶解2 h，然后將酶解液調(diào)pH值為8，放置60 min過濾，濾液調(diào)節(jié)pH值為4.5，沉淀100 min后離心得到沉淀，冷凍干燥沉淀得到桑葉葉蛋白粗提取物，其蛋白質(zhì)提取率為6.5%。而試驗(yàn)采用超聲波-纖維素酶聯(lián)合輔助的浸提方法，其桑葉蛋白質(zhì)提取率比單獨(dú)一種輔助方法或其他方法的要高得多，至少高出56.99%，大大提高了提取得率。這可為同行及本工藝的進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化研究提供參考。