基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究益腎達(dá)絡(luò)飲治療多發(fā)性硬化的作用機(jī)制?

任嘉彥， 丁文婧， 王忠敏， 何靜文， 尚曉玲

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)， 長(zhǎng)春 130117)

多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種炎性脫髓鞘疾病[1，2]，以神經(jīng)功能的缺損進(jìn)而導(dǎo)致殘疾為特征[3]。目前認(rèn)為，該病的發(fā)病機(jī)制與星形膠質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)等關(guān)系密切[4，5]。急性期多采用短療程大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊療法，如甲基強(qiáng)的松龍沖擊治療、潑尼松口服等，減輕急性發(fā)作癥狀。緩解期以疾病修正治療藥物如特立氟胺、重組人干擾素β-1b控制疾病進(jìn)展，預(yù)防復(fù)發(fā)。

益腎達(dá)絡(luò)飲由古方地黃飲子化裁而來(lái)，由熟地黃、當(dāng)歸、梔子、豨薟草、石菖蒲、粉萆薢、甘草、鹿角膠7味中藥構(gòu)成。前期實(shí)驗(yàn)證明，益腎達(dá)絡(luò)飲可通過(guò)多條信號(hào)通路改善多發(fā)性硬化的癥狀，如抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular-regulated kinase 1/2, ERK1/2)通路[6]的激活，抑制酪氨酸激酶(janus kinase, JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription, STAT)信號(hào)傳導(dǎo)通路[6]，調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞1/2(T helper cell 1/T helper cell 1, Th1/Th2)平衡[7]，降低炎癥因子白細(xì)胞介素(interleukin, IL)2、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)α、趨化因子-12(CXC chem okine ligand-12, CXCL12)[8]、趨化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1, MCP-1)[9]的釋放等。還通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育、再生及突觸形成發(fā)揮治療作用，如升高環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)的磷酸化水平[10]等。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)益腎達(dá)絡(luò)飲的主要活性成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路進(jìn)行分析，并經(jīng)初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示了本復(fù)方治療多發(fā)性硬化的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料庫(kù)

表1示，本文所涉及的資料庫(kù)。

1.2 益腎達(dá)絡(luò)飲活性成分和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)篩選

活性成分查于TCMSP[11]，設(shè)置Oralbiovavail-ability(OB)≥0.3，drug-likeness(DL)≥0.18，再用Uniport庫(kù)[12]檢索靶點(diǎn)的基因名。

1.3 多發(fā)性硬化疾病靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)GeneCards[13]、OMIM[14]、PharmGkb[15]、TTD[16]、Drugbank[17]數(shù)據(jù)庫(kù)，“Mutiple Sclerosis”為關(guān)鍵詞，獲得疾病靶點(diǎn)合并去重。

1.4 益腎達(dá)絡(luò)飲和多發(fā)性硬化的共同靶點(diǎn)篩選

采用Cytoscape 3.8.0軟件，將1.2取交集，“VennDiagram”制作韋恩圖，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)(潛在靶點(diǎn))。

1.5 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)1.4得到的交集靶點(diǎn)，使用cytoscape3.8.0軟件中的Network功能進(jìn)行可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，度值(Degree)與節(jié)點(diǎn)呈正比，得到調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選出該網(wǎng)絡(luò)中重要的活性成分。

1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.4的交集靶點(diǎn)輸STRING庫(kù)[18](minimum required interaction score>0.9)，構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)[19]，再導(dǎo)入Cytoscape3.8.0，CytoNCA對(duì)節(jié)點(diǎn)分析，連接靶點(diǎn)多的節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，介度(Betweeness)、緊密度(Closeness)、節(jié)點(diǎn)連接度(Degree)、特征向量(Eigenvector)、局部平均連通度(LAC)、網(wǎng)絡(luò)(Network)均大于中位值過(guò)濾。

1.7 GO、KEGG分析

通過(guò)R(4.0.4版本)軟件GO分析[20]，將藥物-疾病交集基因以P<0.5、Benjamini<0.5為參數(shù)進(jìn)行富集顯示。KEGG[21]通路富集以交集基因P<0.5、FDR<0.05為參數(shù)。

1.8 分子對(duì)接驗(yàn)證

PubChem[22]下載小分子配體2 D結(jié)構(gòu)，通過(guò)ChemBio3D Ultra(14.0.0.117)將2 D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D并進(jìn)行優(yōu)化；PDB庫(kù)[23]下載3 D受體，PyMOL刪除水和小分子配體；借助Auto Dock Tools將配體加氫，確定活性口袋。Vina軟件完成結(jié)合位置確定，并計(jì)算自由能，再利用PyMol軟件繪制最優(yōu)對(duì)接結(jié)果圖。

1.9 動(dòng)物及主要試劑

1.9.1 動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6雌雄鼠，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(吉)2020-0001。飼養(yǎng)、繁殖于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，用以繁殖乳鼠。

1.9.2 含藥血清 將C57BL/6雌鼠隨機(jī)分5組，空白組20只，中藥高中低劑量、激素組各10只。高、中、低3組小鼠分別以4 g/(kg·d)、2 g/(kg·d)、1 g/(kg·d)劑量的益腎達(dá)絡(luò)飲藥液進(jìn)行灌胃，激素組用醋酸潑尼松龍片懸濁液0.2 mL/次[0.078 mg/(kg·d)，空白組等量0.9%氯化鈉溶液]，灌胃7 d眼球取血，3900 r/min離心10 min取血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾膜除菌，-20 ℃保存。

1.9.3 主要試劑 0.25%胰酶(Gibico公司，25200072)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司，SH30023.01B)；4%多聚甲醛(上海源葉公司，R20497)；細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒CCK-8(bioss公司，BA00208)；DAPI染色液(C02-04002)、曲拉通X-100(C03-03002)、抗熒光淬滅封片液/抗熒光衰減封片劑(C02-04003)、FITC抗體標(biāo)記試劑盒(bioss公司，bs-0295G)；脂多糖(L2880-10 mg，Sigma公司)；TNF-α、IL-1βELISA盒(睿信生物CK202112M,CK203063M)；中藥飲片益腎達(dá)絡(luò)飲購(gòu)自吉林同仁大藥房(長(zhǎng)春迅馳廣場(chǎng)店)。

1.10 星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離、原代培養(yǎng)及鑒定

原代提取星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes, AST)是參照參考文獻(xiàn)[14]中使用的方案，經(jīng)純化、傳代后，采用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)免疫熒光鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞純度。

1.11 益腎達(dá)絡(luò)飲含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

96孔板中，細(xì)胞以9×103個(gè)/孔接種，5組3復(fù)孔分別加入的試劑為空白組10%空白血清，模型組10%空白血清，益腎達(dá)絡(luò)飲高劑量組、益腎達(dá)絡(luò)飲中劑量組、益腎達(dá)絡(luò)飲低劑量組和醋酸潑尼松龍對(duì)照組分別加入對(duì)應(yīng)10%含藥血清，作用12 h后，除空白組其他各組再加入1 μg/mL LPS作用24 h，加CCK-8液10 μL/孔2 h，450 nm檢測(cè)吸光度(OD)值。細(xì)胞活性=(OD對(duì)照組 -OD對(duì)照空白孔)/(OD空白組 -OD空白孔)×100%。

1.12 對(duì)炎癥因子TNF-α、IL-1β水平的影響

按照1.11分組和處理收集上清，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)TNF-α和IL-1β水平。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 益腎達(dá)絡(luò)飲活性成分和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)篩選

經(jīng)TCMSP庫(kù)篩選得到方劑中7味中藥的活性成分，分別為熟地黃2個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，粉萆薢2個(gè)，石菖蒲4個(gè)，豨薟草7個(gè)，梔子15個(gè)，甘草92個(gè)，其中鹿角膠因無(wú)有效預(yù)測(cè)靶點(diǎn)被剔除，篩選出益腎達(dá)絡(luò)飲的124個(gè)活性成分，重合活性成分5個(gè)，分別為當(dāng)歸、豨薟草、梔子共有的β-谷甾醇(beta-sitosterol)，當(dāng)歸、熟地黃、豨薟草、梔子重合活性成分為豆甾醇(stigmasterol)，石菖蒲、梔子、甘草重合活性成分為山柰酚(kaempferol)，熟地黃、甘草重合活性成分為谷甾醇(sitosterol)，梔子、甘草重合活性成分為槲皮素(quercetin)，合并去重最終篩選出益腎達(dá)絡(luò)飲的115個(gè)活性成分，其主要活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)225個(gè)(見表2)。

表2 益腎達(dá)絡(luò)飲主要活性成分基本信息比較

2.2 多發(fā)性硬化癥的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖1示，經(jīng)檢索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)合并得到關(guān)于多發(fā)性硬化的8098個(gè)疾病靶點(diǎn)。

圖1 多發(fā)性硬化疾病靶點(diǎn)圖

2.3 共同靶點(diǎn)篩選

圖2示，益腎達(dá)絡(luò)飲中的225個(gè)靶點(diǎn)與多發(fā)性硬化8098個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩圖繪制，得到199個(gè)交集靶點(diǎn)，即為益腎達(dá)絡(luò)飲活性成分治療多發(fā)性硬化的潛在靶點(diǎn)。

注：Disease表示多發(fā)性硬化疾病，Drug表示益腎達(dá)絡(luò)飲方劑，兩圓共同部分顯示199個(gè)共同靶點(diǎn)圖2 益腎達(dá)絡(luò)飲和多發(fā)性硬化的共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖3示，益腎達(dá)絡(luò)飲活性成分-多發(fā)性硬化疾病靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，分析得到309個(gè)節(jié)點(diǎn)1589個(gè)關(guān)系，中間部分黃色長(zhǎng)方形代表199個(gè)靶點(diǎn)基因，外周圓圈表示活性成分，綠色表示甘草，藍(lán)色表示粉萆薢，橙色代表豨薟草，粉色代表石菖蒲，紫色圓圈代表?xiàng)d子，靛青色代表熟地黃，紅色代表當(dāng)歸，共有成分用多色表示，根據(jù)degree值大小排序，篩選出該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)最多的活性成分前10位。

圖3 益腎達(dá)絡(luò)飲活性成分治療多發(fā)性硬化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

表3 益腎達(dá)絡(luò)飲重要活性成分的基本信息

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖4示，益腎達(dá)絡(luò)飲治療多發(fā)性硬化的PPI網(wǎng)絡(luò)，得到作用靶點(diǎn)198個(gè)，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系達(dá)779條。圖5示，經(jīng)CytoNCA插件進(jìn)一步查找網(wǎng)絡(luò)核心，該網(wǎng)絡(luò)的Betweenness中位值為62.4，Closeness的中位值為0.1，Degree的中位值為7，Eigenvector的中位值為 0.03，LAC的中位值為2.8，Network的中位值為3.7，篩選6個(gè)過(guò)濾條件均大于中位數(shù)的為關(guān)鍵靶點(diǎn)，用黃色方框表示，得到的基因共計(jì)51個(gè)，即51個(gè)節(jié)點(diǎn)338條邊。在此基礎(chǔ)上，再次按照6個(gè)過(guò)濾條件提取分析，得到各條件的中位值分別為Betweenness: 18.6，Closeness: 0.5，Degree: 11，Eigenvector: 0.1，LAC: 5.875，Network: 7.1，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)17個(gè)176條邊，如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、TNF、細(xì)胞腫瘤抗原p53(Tumor Protein P53, TP53)等。

圖4 益腎達(dá)絡(luò)飲-多發(fā)性硬化PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 益腎達(dá)絡(luò)飲-多發(fā)性硬化PPI核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO富集分析

圖6示，GO富集分析以P<0.05為條件，得到富集結(jié)果2574個(gè)，其中生物過(guò)程2254個(gè)，細(xì)胞組成98個(gè)，分子功能222個(gè)，選擇前10個(gè)繪制，表明益腎達(dá)絡(luò)飲治療多發(fā)性硬化的生物過(guò)程主要與炎癥、氧化應(yīng)激和化學(xué)激反應(yīng)相關(guān)；細(xì)胞組成富集顯示，與類固醇激素受體、磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等方面相關(guān)。

注：顏色P值紅→藍(lán)遞增，橫坐標(biāo)-數(shù)目，BP-生物過(guò)程、CC-細(xì)胞組成和MF-分子功能圖6 益腎達(dá)絡(luò)飲-多發(fā)性硬化GO富集分析圖

2.7 KEGG富集分析

圖7示，KEGG富集分析以P<0.5為條件，通路富集結(jié)果得到178條通路，主要與炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激與凋亡反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、免疫反應(yīng)有關(guān)，涉及磷酸肌醇3激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B signaling pathway, PI3K/AKT)、MAPK、IL-17、TNF、腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system, Ras)、環(huán)化腺核苷一磷酸(cyclized adenosine monophosphate, cAMP)等信號(hào)通路。在TNF信號(hào)通路中，有26個(gè)靶點(diǎn)參與，關(guān)鍵靶點(diǎn)為JUN、AKT、TNF。益腎達(dá)絡(luò)飲重要靶點(diǎn)TNF參與了包括MAPK、IL-17等60條通路，參與調(diào)節(jié)多發(fā)性硬化免疫細(xì)胞及炎癥反應(yīng)及中樞神經(jīng)髓鞘損傷等。圖8示，選擇其中重要的TNF通路繪制通路圖。

注：顏色P值紅→藍(lán)遞增，橫坐標(biāo)-基因比例，圓圈大小-基因的數(shù)目圖7 益腎達(dá)絡(luò)飲-多發(fā)性硬化KEGG通路分析(排名前30)

2.8 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

將2.4得出益腎達(dá)絡(luò)飲重要活性成分，考慮中藥本身及復(fù)方治療多發(fā)性硬化作用，選取甘草、梔子的共有成分槲皮素(quercetin)，甘草、石菖蒲、梔子共有成分山柰酚(kaempferol)作為核心成分，即小分子配體。綜合2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)以及GO和KEGG得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)，根據(jù)多發(fā)性硬化疾病特點(diǎn)選取TNF-α作為核心靶點(diǎn)即受體，再通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)行初步驗(yàn)證。通過(guò)結(jié)合能(affinity)評(píng)估對(duì)接結(jié)果，affinity越小表示分子對(duì)接結(jié)合效果越好。

注：圖中的矩形框?yàn)橐环N基因/蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，紅色為益腎達(dá)絡(luò)飲關(guān)鍵作用靶蛋白圖8 KEGG通路TNF信號(hào)通路模式圖

2個(gè)小分子配體(MOL000098、MOL000422)與受體TNF進(jìn)行模擬對(duì)接結(jié)果顯示，quercetin-TNF結(jié)合能為-4.8(kcal/mol)，kaempferol-TNF結(jié)合能為-4.1(kcal/mol)，表明quercetin、kaempferol與TNF均有較強(qiáng)的結(jié)合活性，初步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的挖掘結(jié)果。圖9、10示，借助PyMol軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

圖9 槲皮素(quercetin)與TNF對(duì)接

圖10 山柰酚(kaempferol)與TNF對(duì)接

2.9 星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h后大多數(shù)星形膠質(zhì)、神經(jīng)元開始貼壁，約7 d后形態(tài)上星形膠質(zhì)細(xì)胞呈聚集性生長(zhǎng)，邊緣不易辦認(rèn)，為多角形后逐漸開始鋪展，細(xì)胞體增大，部分細(xì)胞突起伸長(zhǎng)呈梭形，偽足增多，細(xì)胞更加透明，膠質(zhì)細(xì)胞基本滿瓶底，約10 d時(shí)細(xì)胞開始分層。圖11示，經(jīng)純化和GFAP免疫熒光鑒定后，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)明顯，多呈梭形，GFAP表達(dá)主要位于胞漿和突起內(nèi)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為95%以上，可以用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。

注：綠色-GFAP陽(yáng)性；藍(lán)色-DAPI細(xì)胞核，星形膠質(zhì)細(xì)胞純度=星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。N=3；Scale bar=100 μm圖11 星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定

2.10 益腎達(dá)絡(luò)飲含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)活性能力的影響

表4示，采用1 μg/mL LPS造成炎癥環(huán)境模型，測(cè)定細(xì)胞的活性能力。與空白組比較，模型組活性顯著升高；與模型組比較，益腎達(dá)絡(luò)飲高劑量組和醋酸潑尼松對(duì)照組增殖活性均顯著升高(P<0.01)，益腎達(dá)絡(luò)飲中、低劑量組細(xì)胞活性升高(P<0.05)。

表4 星形膠質(zhì)細(xì)胞活性

2.11 益腎達(dá)絡(luò)飲對(duì)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-1β水平的影響

圖12、13示，模型組與空白組比較(P<0.01)，TNF-α、IL-1β水平明顯升高；益腎達(dá)絡(luò)飲低、中、高劑量組與模型組比較(P<0.01)，均能顯著降低TNF-α、IL-1β水平，且益腎達(dá)絡(luò)飲高劑量組效果更為明顯，表明益腎達(dá)絡(luò)飲能夠降低LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖12 益腎達(dá)絡(luò)飲對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α表達(dá)影響

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖13 益腎達(dá)絡(luò)飲對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β表達(dá)影響

3 討論

MS好發(fā)于中青年，以女性較為多見，主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白質(zhì)，具有病變部位廣泛、癥狀復(fù)雜多變的特點(diǎn)。目前急性期治療以沖擊糖皮質(zhì)激素為主，控制緩解期復(fù)發(fā)是重點(diǎn)，不僅費(fèi)用高且療效差。中醫(yī)認(rèn)為多發(fā)性硬化與督脈和腦關(guān)系密切。本團(tuán)隊(duì)在多年臨床經(jīng)驗(yàn)積累中，認(rèn)為多發(fā)性硬化的病機(jī)為腎陽(yáng)虛、虛生毒、毒入絡(luò)、絡(luò)病生?；诖?，創(chuàng)立了中藥復(fù)方益腎達(dá)絡(luò)飲，方中熟地黃、鹿角膠、杜仲可益腎填精，梔子、石菖蒲解毒化濁，郁金、粉萆薢解郁通絡(luò)，充分體現(xiàn)中醫(yī)“補(bǔ)瀉兼施，調(diào)和陰陽(yáng)”的思想[24]。

本研究篩選出益腎達(dá)絡(luò)飲中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等重要活性成分。已有研究表明，槲皮素有促進(jìn)髓鞘再生、保護(hù)小鼠神經(jīng)髓鞘損傷的作用[25]，通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞衍生的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，有效減輕小鼠的認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)功能缺陷，提示其對(duì)神經(jīng)損傷有治療作用[26]。山柰酚是一種黃酮類化合物[27]，主要來(lái)源于蔬菜及水果[28]。山柰酚及其苷類可能對(duì)神經(jīng)退行性疾病的治療有益[29]，其能抑制核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)和STAT3活化，從而減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥[30]，β-谷甾醇可有效調(diào)節(jié)促/抗炎細(xì)胞因子[31]。益腎達(dá)絡(luò)飲治療多發(fā)性硬化的關(guān)鍵靶點(diǎn)MAPK、AKT、TNF、STAT3等17個(gè)。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族成員中的ERK1/2、P38、SAPK/JNK等[32-34]，在多發(fā)性硬化中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，過(guò)度激活的MAPK可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙，從而導(dǎo)致神經(jīng)脫髓鞘[35]。原發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中Src/MAPK/PI3K/NF-κB通路與多發(fā)性硬化的關(guān)系密切[36]；在復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化癥患者的CD4+T和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells, Tregs)中，AKT表達(dá)水平被抑制[37]，STAT3基因表達(dá)增加[38]；TNF基因位點(diǎn)的變異引起多發(fā)性硬化患病率增高[39]，TNF-α、IL-17等炎癥因子可以啟動(dòng)腦內(nèi)免疫應(yīng)答，直接或間接損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘，介導(dǎo)多發(fā)性硬化的發(fā)病。團(tuán)隊(duì)前期工作也證明，本復(fù)方具有降低TNF-α[40]表達(dá)的作用。

GO、KEGG通路分析結(jié)果顯示，益腎達(dá)絡(luò)飲治療多發(fā)性硬化的生物學(xué)進(jìn)程主要集中在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激關(guān)系緊密，兩者在惡性循環(huán)中相互關(guān)聯(lián)，氧化應(yīng)激和抗氧化能力的生物標(biāo)志物可以作為評(píng)估多發(fā)性硬化患者炎癥狀態(tài)的潛在工具。PI3K/AKT信號(hào)通路可促進(jìn)軸突再生[41]和軸突髓鞘形成[42]，PI3K/AKT/Fox01通路可抑制IL-17和轉(zhuǎn)錄因子孤核受體(orphan nuclear receptor, RORγt)的表達(dá)，達(dá)到治療多發(fā)性硬化的目的。

分子對(duì)接結(jié)果可知，益腎達(dá)絡(luò)飲進(jìn)入機(jī)體后能與相關(guān)受體有較好的親和力，同時(shí)也進(jìn)一步證明本文中預(yù)測(cè)益腎達(dá)絡(luò)飲成分與多發(fā)性硬化靶點(diǎn)的可靠性。

星形膠質(zhì)細(xì)胞在多發(fā)性硬化變化發(fā)展中有著雙向作用，既有積極性作用，分泌有利于中樞神經(jīng)恢復(fù)的因子促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)和修復(fù)等，又有抑制性作用，增加分泌IL-1β、IL-6，TNF等致炎因子和趨化因子，這些物質(zhì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有毒性作用[43，44]。在致炎因素作用下，星形膠質(zhì)被活化成反應(yīng)性星形膠質(zhì)，細(xì)胞肥大、增殖異常等[45，46]，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞可誘導(dǎo)Th0向Th1或Th17轉(zhuǎn)化，而Th1或Th17又可分泌一系列炎癥因子，引發(fā)正反饋式的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[47]，啟動(dòng)腦內(nèi)免疫應(yīng)答。已有研究表明，LPS可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[48]，模擬中樞炎癥反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)中，益腎達(dá)絡(luò)飲的高、中、低劑量組均對(duì)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性損傷起到一定的保護(hù)作用，可降低TNF-α、IL-1β的分泌(P<0.01)，說(shuō)明益腎達(dá)絡(luò)飲可能通過(guò)發(fā)揮抗炎作用而達(dá)到治療多發(fā)性硬化的目的，且在分子對(duì)接中TNF-α與益腎達(dá)絡(luò)飲重要活性成分(MOL000098槲皮素，MOL000422山柰酚)有較好的親和力。

綜上所述，本研究篩選出益腎達(dá)絡(luò)飲通過(guò)MAPK、AKT、TNF等關(guān)鍵靶點(diǎn)參與PI3K-AKT、MAPK、IL-17、TNF-α等多條通路發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和促進(jìn)軸突再生和髓鞘形成作用。進(jìn)一步證明，益腎達(dá)絡(luò)飲的活性成分可通過(guò)多種生物學(xué)變化影響多發(fā)性硬化的發(fā)生發(fā)展。并從體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該方劑對(duì)多發(fā)性硬化潛在靶點(diǎn)的影響，為該方劑治療本病提供了機(jī)制研究思路。