Telocytes作為抗胃癌中藥潛在作用靶點的探究?

黃慶寶， 劉 霞， 周紅祖， 王 雯， 楊卓凡， 鄭智彬， 宣攢威， 羅浩鑫， 余惠旻△

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院深圳市中醫(yī)院， 深圳 518033；2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部， 深圳 518060；3.深圳市第二人民醫(yī)院， 深圳 518025)

中國胃癌呈現(xiàn)高發(fā)病率、高死亡率的態(tài)勢[1]，手術(shù)、化療及靶向治療的預(yù)后很差[2]。大部分單靶點抗腫瘤藥物的應(yīng)用都受限于藥物的毒副作用和耐藥性，這為多靶點作用優(yōu)勢的中藥及其復(fù)方的研究提供了不可多得的機會。胃癌發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的分子機制尚不明晰，因此尋找更多具有治療潛力的新靶點成為胃癌機制研究及治療藥物開發(fā)的熱點和難點。

Telocytes(TCs)中文名譯為特洛細胞、終隔細胞、遠細胞等，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種廣泛分布在人體各種組織、器官的新型間充質(zhì)細胞，TCs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管生成及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，有望成為腫瘤治療的潛在靶點，但研究尚處于起步階段。2013年Vannucchi MG等第一次提出人胃黏膜、黏膜下層和肌層中都存在數(shù)量不等的TCs[3]，但其提供實驗圖片的正確性有待進一步驗證。2018年Riccardo Ricci提示，TCs與血小板源性生長因子受體α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)變異有關(guān)的胃間質(zhì)瘤的發(fā)生存在一定聯(lián)系[4]，但其具體關(guān)系不明晰。TCs與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系未明，從TCs的角度闡明胃癌的發(fā)病機制具有很大的創(chuàng)新性和可行性。Padhi S等[5]關(guān)于“甲磺酸伊馬替丁、TCs與胰腺相關(guān)疾病”的研究，提示從已有的中藥及其復(fù)方制劑中發(fā)現(xiàn)并找到廉價有效的調(diào)控TCs的藥物成為可能。

本研究選取人胃的正常及癌變標(biāo)本，選用CD34、PDGFR-α、c-kit和CD31標(biāo)記物，采用多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)，結(jié)合HE染色、透射電子顯微鏡、免疫組化等，確定TCs在人胃中的免疫表型、分布及其變化特點，從TCs的角度闡明胃癌的發(fā)病機制，將為臨床胃癌治療提供新的靶點，也將進一步豐富和深化對TCs的認知，并有可能在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)以TCs為作用靶點的抗腫瘤中藥復(fù)方或化合物。本研究通過深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會批準(批號PN-202200055)。

1 材料

1.1 組織來源與分組

標(biāo)本組織來源于2020至2022年深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科分正常組和胃癌組。正常組包括代謝綜合征患者胃部切除的組織標(biāo)本6例(男2例，女4例，年齡23-40歲，平均28歲)與癌旁組織(距腫瘤邊緣大于5 cm)標(biāo)本19例(男12例，女7例，胃癌病人的年齡36-80歲，平均59歲)，胃癌組組織標(biāo)本19例(信息同癌旁組織標(biāo)本)，所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色鑒定。

1.2 主要試劑及儀器

4%的多聚甲醛(貨號P0099-500 mL，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；牛血清蛋白(貨號FD0030，杭州弗德生物科技有限公司)；DAB試劑盒(貨號SW1040-1kit，深圳瑞景生物科技有限公司)；CD34 (ICO115) 抗體(貨號MA137329，深圳開克立科技有限公司)；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、四色多重?zé)晒饷庖呓M化試劑盒、PDGFR-α、CD31、c-Kit抗體(貨號分別為abs9248-100 mL、abs50012-20 T、3174 S、3528 S、37805 S，上海優(yōu)寧維生物科技有限公司)。

APS300 S組織脫水機、EG1150C石蠟包埋機，RM2235、RM2016石蠟切片機、HI1210攤烤烘片機、EM UC7超薄切片機，德國Leica公司；BX51正置熒光顯微鏡、BX61研究級正置自動熒光顯微鏡，日本OLYMPUS公司；HT7700鎢燈絲透射電鏡，日本HITACH公司。

2 方法

2.1 標(biāo)本處理

2.1.1 組織石蠟標(biāo)本制作 選取組織標(biāo)本，取材面積約為15 mm×15 mm，厚度約為10 mm，常規(guī)處理，4%多聚甲醛中固定24 h，修整、梯度脫水、包埋、修蠟。

2.1.2 電鏡組織標(biāo)本制作 將胃部新鮮組織標(biāo)本(術(shù)后)分割成1 mm×1 mm×1 mm大小，常規(guī)處理、固定、脫水、包埋，后于45 ℃烘箱內(nèi)12 h 60 ℃烘箱內(nèi)48 h固化。

2.2 透射電子顯微鏡

超薄切片機切片70 mm、3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色、觀察、拍片(電壓80 kV)。

2.3 HE染色

石蠟切片脫蠟至水，常規(guī)方法處理，Harris蘇木素染色、分化、返藍、伊紅染色、脫水、封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2.4 免疫組化

石蠟標(biāo)本連續(xù)切片常規(guī)處理，依次脫蠟、修復(fù)、封閉，分別加入一抗CD34(1∶200)、PDGFR-α(1∶500)、CD31(1∶100)和c-kit(1∶100)4 ℃過夜、復(fù)溫，加一抗放大劑、HRP生物素標(biāo)記的二抗，DAB避光顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸酒精分化、返藍、梯度脫水、透明、封片及鏡檢，其中空白對照組用PBS代替一抗，其余步驟同上。

2.5 多重?zé)晒饷庖呓M化

按試劑盒說明進行操作，標(biāo)本經(jīng)脫蠟分別加一抗CD34、PDGFR-α、CD31和c-kit(濃度同上)，HRP標(biāo)記的二抗，熒光染料(TSA520或TSA570)等步驟處理后，再次進行抗原修復(fù)，加第2種一抗、HRP二抗及另外一種熒光染料 (TSA520或TSA570)后加DAPI工作液，室溫孵育、水洗，再加抗熒光淬滅封片劑封片，以相同參數(shù)(包括目鏡、曝光時間、熒光強度和物鏡等)進行免疫熒光圖片采集，將CD34/PDGFR-α雙陽性表達且有細胞核視為TCs。

2.6 半定量分析

每組隨機選取6個相對應(yīng)的視野部位進行計數(shù)。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 HE染色觀察組織病理學(xué)

對6例代謝綜合征病人正常胃組織標(biāo)本，19例胃癌病人的正常胃組織及胃癌組織標(biāo)本進行HE染色，確定組織結(jié)構(gòu)的完整性，鑒定為正常組織及胃癌組織。結(jié)果顯示，正常胃組織標(biāo)本中固有層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層以及漿膜層結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細胞浸潤(圖1A)；胃癌組織中病理改變不同，有浸潤深度限于黏膜及黏膜下層(圖1B)、腫瘤組織浸潤至淺肌層(圖1C)及腫瘤組織浸潤至漿膜層(圖1D)。

注：A為正常組織，B、C、D為胃癌組織圖1 人胃正常組織與癌組織HE染色比較(40×)

3.2 透射電子顯微鏡觀察人胃組織中TCs

選取25例正常組組織標(biāo)本，使用透射電子顯微鏡技術(shù)確定人胃中TCs的存在。對人胃正常組織中固有層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層及漿膜層代表性橫斷面的區(qū)域進行觀察，發(fā)現(xiàn)均有TCs存在，其胞體呈梭形或紡錘形，胞核和胞質(zhì)比近1∶1，有極細而長且伴有節(jié)狀膨大的突起(telopodes，Tps)(圖2F)。TCs通過Tps緊貼著胃腺，包繞主細胞(圖2A)；TCs胞體呈梭形，與平滑肌細胞伴行(圖2B)；在黏膜下層中存在同型交聯(lián)，構(gòu)成3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖2C)；TCs存在于肌層的間質(zhì)中，Tps短而粗(圖2 D)；在漿膜層中可看到帶有一條Tps的TCs，Tps在細長部和膨大部相間呈念珠狀(圖2E)。

注：A.固有層；B.黏膜肌層；C.黏膜下層；D.肌層；E.漿膜層；F.黏膜肌層圖2 人胃正常組織透射電子顯微鏡比較(1000×)

3.3 免疫組化檢測人胃組織中TCs的免疫表型

選取25例正常組組織標(biāo)本，以CD34、PDGFR-α、c-kit和CD31為免疫標(biāo)記物，采用免疫組化技術(shù)確定人胃組織中TCs的免疫表型。結(jié)果顯示，在胃各層中均有TCs存在，CD34與PDGFR-α標(biāo)記呈陽性(圖3A、B、E、F、I、J、M、N、Q、R)，c-kit和CD31標(biāo)記呈陰性(圖3C、D、G、H、K、L、O、P、S、T)，各層中的免疫表達各具特點，細胞胞體為梭形、扁平狀或橢圓形，含有數(shù)量不等、形狀略有差異的Tps，與TCs、腺體及血管發(fā)生同型或異型交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以固有層為例，不同部位中CD34和PDGFR-α的表達強度各不相同，CD34+細胞在胃小凹和上皮組織中豐度較低，在固有層底部靠近黏膜肌層的內(nèi)環(huán)肌附近豐度最高，PDGFR-α+細胞在胃小凹處豐度較高，呈多點彌散狀分布。

注：A～ D.固有層；E～ H.黏膜肌層；I～L.黏膜下層；M～ P.肌層；Q～ T.漿膜層；血小板源性生長因子受體α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)圖3 人胃正常組織各層免疫組化染色比較(400×)

3.4 多重?zé)晒饷庖呓M化檢測人胃組織中TCs的免疫表型

選取25例正常組組織標(biāo)本，多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)進一步明確CD34和PDGFR-α表達雙陽性的TCs。結(jié)果顯示，正常胃組織各層中均有CD34與PDGFR-α雙陽性的TCs存在(圖4)。固有層TCs胞體多為梭形，Tps細長彎曲，環(huán)繞著胃腺，與胃腺形成異型連接(圖4D)；黏膜肌層TCs胞體多呈橢圓形或梭形，有較多短而粗的Tps(圖4H)，在2層平滑肌上的TCs通過Tps包繞著肥大細胞，與血管內(nèi)皮細胞存在交聯(lián)(圖4F)；黏膜下層TCs與血管細胞發(fā)生異型交聯(lián)，包繞在血管周圍，在疏松結(jié)締組織中TCs形成復(fù)雜的同型和異型細胞連接的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖4L)；肌層TCs伴行于肌束周邊、肌層間質(zhì)及肌間神經(jīng)叢中，胞體形狀為梭形，Tps的輪廓清晰且沿著平滑肌纖維向各個方向延伸，存在相互交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖4P)；漿膜層TCs間相互交聯(lián)，分布在結(jié)締組織中，圍繞在神經(jīng)及血管周圍(圖4I)。

注：A、E、I、M、Q為CD34(紅色)；B、F、J、N、R為PDGFR-α(綠色)；C、G、K、O、S為細胞核(藍色)；D、H、L、P、T為Merge；血小板源性生長因子受體α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)圖4 人胃正常組織多重?zé)晒饷庖呓M化比較(1000×)

3.5 多重?zé)晒饷庖呓M化檢測人胃癌組織中TCs的免疫表型

選取正常組組織標(biāo)本及胃癌組組織標(biāo)本各19例，采用多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)探討TCs的差異表達。結(jié)果顯示，與正常人胃組織中TCs比較，人胃癌組織中，固有層TCs胞體形狀多為球狀或者橢圓形，Tps短于正常組織(圖5A、F)；黏膜肌層TCs胞體多為梭形或扁平狀，Tps細長，Tps上的節(jié)點較少(圖5B、G)；黏膜下層，靠近血管附近可以觀察到TCs，貼合在血管周邊的TCs的數(shù)量明顯少于正常組織，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)缺失(圖5C、H)；肌層TCs均勻分布于肌肉束周邊，數(shù)量低于正常胃組織(圖5D、I)；漿膜層TCs分布較為松散。人胃癌組織中TCs在數(shù)量上呈現(xiàn)減少和缺失趨勢(見表1)，正常組織中黏膜下層和肌層TCs的數(shù)量明顯高于癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 人胃正常組織與胃癌組織中胃黏膜下層和肌層中Telocytes(TCs)數(shù)量比較

注：Control為人胃正常組織；Cancer為癌組織；A～E為人正常胃組織各層中CD34 (紅色)/ PDGFR-α(綠色)雙染；F～J為人胃癌各層中CD34 (紅色)/ PDGFR-α(綠色)雙染；血小板源性生長因子受體α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)圖5 人胃正常組織和胃癌組織各層中CD34/PDGFR-α多重?zé)晒饷庖呓M化比較(400×)

4 討論

近年來，胃癌的治療手段如手術(shù)、化療、放療等均有了很大的發(fā)展，但療效并不令人滿意，國內(nèi)外的臨床與科研人員一直在探尋胃癌治療的新方法。靶向治療聯(lián)合化療雖然可以改善包括胃癌在內(nèi)的實體瘤患者的預(yù)后，但靶點陽性患者比例低，不能明確特定靶點人群的特征，無法做到精準治療，如原癌基因人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)是目前胃癌中明確的治療靶點，但在晚期胃癌患者中其陽性率僅為12.1%[6]，在我國患者中這一比例可能更低。因此，從腫瘤生物學(xué)、細胞和分子機制的角度探索胃癌治療的新靶點顯得尤其重要。

TCs是近年來發(fā)現(xiàn)的一種廣泛分布在人體各種器官的新型間充質(zhì)細胞。研究發(fā)現(xiàn)，TCs與子宮肌瘤[7]、乳腺癌[8]、皮膚腫瘤[9]、顆粒細胞瘤[10]、黑素細胞痣[11]等腫瘤的發(fā)生有著重要聯(lián)系，有望成為腫瘤治療的潛在靶點，但研究仍處于起步階段。對PubMed中的文獻(2010年至2021年)進行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，TCs相關(guān)的論文有489篇，明確表明癌癥與TCs有關(guān)聯(lián)的只有子宮肌癌[7]和乳腺癌[8]，涉及人胃的研究論文僅有2篇。2013年Vannucchi MG等雖然第一次提出人類胃黏膜、黏膜下層和肌層中都存在數(shù)量不等的TCs[3]，但其提供胃黏膜層的實驗圖片中，CD34與PDGFR-α陽性表達細胞幾乎相同，完全違背了胃部組織細胞學(xué)的免疫表型特征，本實驗結(jié)果(圖3)是對該項研究有力的反駁和補充。2018年Riccardo Ricci提出TCs與PDGFR-α變異有關(guān)的胃間質(zhì)瘤的發(fā)生存在一定聯(lián)系[4]，但具體關(guān)系不明晰。胃癌中有95%是胃腺癌，4%-5%是胃間質(zhì)瘤，而PDGFR-α變異有關(guān)的胃間質(zhì)瘤發(fā)病率極低，僅占胃間質(zhì)瘤的6%-7%。因此，TCs與胃生理及病理(胃癌等)的關(guān)系研究在全球內(nèi)仍處于空白階段。

本研究結(jié)果表明，TCs在人胃固有層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層及漿膜層中均有分布，胃各層組織中CD34、PDGFR-α陽性表達的細胞隨位置不同而異(圖2、3、4)。與正常人胃組織中TCs比較，固有層癌組織中(圖5F)、黏膜下層血管附近(圖5H)、肌層癌組織中(圖5I)的TCs，其Tps或短于正常組織，或具有較少的節(jié)點或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。腫瘤組織中CD34+/PDGFR-α+TCs的缺失可能是胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制之一(圖5L)，這一結(jié)果與肝癌[12]、侵入性乳腺癌[8]等研究結(jié)果相吻合。

由于胃部微環(huán)境的復(fù)雜性以及TCs缺乏特異性的免疫標(biāo)記，不同組織中免疫表型呈現(xiàn)不一致的狀態(tài)，給TCs與胃部疾病的研究帶來了巨大的障礙。本研究直接選用人胃部正常組織和腫瘤組織，突破了TCs與胃癌研究的瓶頸。本研究首次證實了TCs在胃各層組織(固有層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層和漿膜層)中有明確的定位、分布與免疫表型。TCs在胃癌發(fā)病機理中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，具有成為胃腺癌預(yù)防和治療新靶點的潛力，并且可能成為藥物抗胃癌作用的潛在靶點。