針刺療法對(duì)衰老大鼠腰肌組織形態(tài)學(xué)及細(xì)胞凋亡的影響?

林建平， 郭明玲， 金 京， 王 浩， 王詩(shī)忠， 陳少清△

(1.福建醫(yī)科大學(xué)健康學(xué)院， 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福州 350122)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，80%的成年人在一生中會(huì)發(fā)生腰背疼痛，多與腰部退行性病變相關(guān)[1]。其中腰部骨骼肌衰老(lumbar muscle aging,LMA)已成為腰痛發(fā)生的第一因素，常見(jiàn)于運(yùn)動(dòng)員、體力勞動(dòng)、長(zhǎng)期不良姿勢(shì)、用力不當(dāng)者[2]。骨骼肌衰老表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量和力量的進(jìn)行性和全面性喪失，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是激素和細(xì)胞因子失衡、肌細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)合成與再生功能障礙等多因素綜合作用的結(jié)果，其中肌細(xì)胞凋亡是其重要機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控失調(diào)出現(xiàn)過(guò)度或不充分的凋亡時(shí)，就可能誘發(fā)許多衰老相關(guān)疾病[3，4]。臨床治療骨骼肌衰老多采用營(yíng)養(yǎng)支持療法，而研究證實(shí)針灸治療也對(duì)骨骼肌衰老有良好的療效[5，6]。但目前關(guān)于針刺治療骨骼肌衰老作用機(jī)制方面的研究仍較少，因此本研究采用D-半乳糖(D-Galactose，D-gal)建立LMA模型大鼠，觀察針刺“委中”“腎俞”對(duì)衰老大鼠腰肌質(zhì)量、形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、肌細(xì)胞凋亡率等影響，進(jìn)一步探討針刺療法延緩腰肌衰老的可能機(jī)制。本研究通過(guò)福建醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)FJMU IACUC 2020-0038)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

SPF級(jí)3月齡健康雄性sprague-dawley(SD)大鼠50 只，體質(zhì)量(371±30)g，由福建醫(yī)科大學(xué)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(閩)2016-0002。大鼠在溫度(25±2)℃、濕度(55±5)%、明暗周期12 h∶12 h的條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、針刺穴位組、 針刺非穴組、陽(yáng)性藥物組5組各10 只。

1.2 主要試劑及儀器

Tunel試劑盒(貨號(hào)11684817910，瑞士Roche公司)；HE染色套裝(貨號(hào)G1003，武漢Servicebio公司)；D-gal、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸(貨號(hào)分別為S11050g、S20044-25g、S20049-25g、S20042-25g、S20093-25g、S20077-100g、S20027-100g、S200123-25g、S20063-25g、S20060-25g、S20087-25g、S20082-25g，沃森生物有限公司)；一次性無(wú)菌針灸針(型號(hào)0.25 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；正置光學(xué)顯微鏡(型號(hào)Nikon Eclipse E100)日本Nikon公司；透射電鏡(型號(hào)EM208)飛利浦公司。

1.3 造模方法及評(píng)定

用0.9%氯化鈉溶液配置成12.5%D-gal溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆颥F(xiàn)配現(xiàn)用。除空白組外，其余4 組每日上午9 點(diǎn)頸背部皮下注射 12.5%D-gal (1 000 mg·kg-1·d-1)，空白組頸背部皮下注射等量0.9%氯化鈉溶液作為對(duì)照，注射按無(wú)菌操作要求進(jìn)行，5組均常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)，每日1次，連續(xù)8周。LMA模型成功標(biāo)準(zhǔn)[7]：肌肉衰減征指數(shù)(sarcopenia index，SI)值下降，HE染色肌細(xì)胞明顯萎縮，肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增高。

1.4 干預(yù)方法

針刺穴位組自造模第29天起，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]，選取雙側(cè)“委中”和“腎俞”，以 0.25 mm×25 mm 毫針直刺，針刺深度均取6～8 mm，下午16∶00治療，每次留針20 min，每日1次，6 d為1個(gè)療程，間歇1 d，連續(xù)4個(gè)療程。

針刺非穴組選取雙側(cè)“非經(jīng)非穴位”(非經(jīng)非穴位1：“委中”內(nèi)側(cè)旁開(kāi)0.5 cm；非經(jīng)非穴位2：“腎俞”與“志室”中點(diǎn))，余同針刺穴位組。

陽(yáng)性藥物組參照Sebastiano B[9]研究，采用混合氨基酸進(jìn)行灌胃干預(yù)，成年人每天8 g混合氨基酸。氨基酸組成：L-亮氨酸2.5 g、L-賴氨酸1.3 g、L-異亮氨酸1.25 g、L-纈氨酸1.25 g、L-蘇氨酸0.7 g、L-半胱氨酸0.3 g、L-組氨酸0.3 g、L-苯丙氨酸0.2 g、L-甲硫氨酸0.1 g、L-酪氨酸0.06 g和L-色氨酸 0.04 g。大鼠使用量按人與動(dòng)物體表面積換算的等效劑量比率(0.018)：大鼠劑量=人 g/kg×70 kg×0.018/0.2 kg=6.3×人 g/ kg 計(jì)算，每日1次，6 d為1個(gè)療程，間歇1 d，連續(xù)4個(gè)療程。

1.5 標(biāo)本采集及處理

末次干預(yù)結(jié)束后對(duì)所有大鼠稱重記錄，大鼠禁食不禁水24 h后，用4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取俯臥位固定，于大鼠背部后正中線切開(kāi)皮膚，剔除皮毛、筋膜剝離雙側(cè)豎脊肌，稱重并記錄肌肉濕重。選取豎脊肌腰段組織，一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定，一部分放入電鏡液，另一部分標(biāo)本經(jīng)過(guò)液氮速凍后迅速轉(zhuǎn)移，放入超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率 大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率=[第n周大鼠體質(zhì)量(g)-第n-1周大鼠體質(zhì)量(g)]/第n周大鼠體質(zhì)量(g)×100%。

1.6.2 大鼠SI值 大鼠SI值為靶骨骼肌濕重與大鼠處死時(shí)最終體質(zhì)量比值，現(xiàn)研究多采用SI值來(lái)間接評(píng)估骨骼肌萎縮程度。本研究取大鼠雙側(cè)豎脊肌作為靶骨骼肌，SI值(g/g)=[(脊旁雙側(cè)豎脊肌濕重(g)/最終體質(zhì)量(g)]×100%。

1.6.3 HE染色觀察大鼠豎脊肌組織形態(tài) 大鼠麻醉后固定取材，取大鼠脊旁腰段豎脊肌組織，放入 4%多聚甲醛中室溫固定48 h，石蠟固定包埋，制作成4 μm厚切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，HE 染色，中性樹(shù)膠封片，觀察大鼠豎脊肌組織形態(tài)變化。

1.6.4 透射電鏡觀察大鼠豎脊肌組織超微結(jié)構(gòu) 取材3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定，酒精-丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂618包埋劑包埋；超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察、攝影。

1.6.5 TUNEL法觀察肌細(xì)胞凋亡 肌肉組織進(jìn)行石蠟包埋、切片后進(jìn)行脫蠟，通過(guò)滴加蛋白酶K工作液進(jìn)行修復(fù)，滴加破膜工作液進(jìn)行破膜。根據(jù)片子數(shù)量和組織大小，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。每張TUNEL陽(yáng)性切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野(×400)，凋亡細(xì)胞核為綠色，正常細(xì)胞核為藍(lán)色，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)使用加權(quán)法計(jì)算肌肉細(xì)胞凋亡指數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=(凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù))×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率比較

表1示，針刺干預(yù)前與空白組比較，其余4組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率均降低(P<0.05)，干預(yù)后1周至4周與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率均降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，針刺穴位組、陽(yáng)性藥物組體質(zhì)量增長(zhǎng)率均升高(P<0.05，P<0.01)，而針刺非穴組體質(zhì)量增長(zhǎng)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陽(yáng)性藥物組比較，針刺穴位組體質(zhì)量增長(zhǎng)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率比較

2.2 各組SI值比較

圖1示，與空白組比較，模型組大鼠SI值下降(P<0.01)；與模型組比較，針刺穴位組、陽(yáng)性藥物組SI值升高 (P<0.05，P<0.01)，針刺非穴位組SI值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陽(yáng)性藥物組比較，針刺穴位組SI值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注: 與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01圖1 各組大鼠脊旁雙側(cè)豎脊肌濕質(zhì)量比(SI值)

2.3 各組HE染色比較

圖2示，空白組大鼠符合正常骨骼肌組織的形態(tài)學(xué)特征，肌纖維細(xì)胞集合而成肌束，肌細(xì)胞排列整齊緊密呈多邊形，大小基本一致，細(xì)胞核大部分分布在肌細(xì)胞邊緣，極少位于細(xì)胞的中心部位；與空白組比較，模型組大鼠骨骼肌細(xì)胞呈現(xiàn)圓形化，大小不等，排列較松散，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞直徑的差別增大，出現(xiàn)不同程度的萎縮；與模型組比較，針刺穴位組、陽(yáng)性藥物組大鼠骨骼肌纖維組織更加緊密，圓形化程度減少，肌細(xì)胞排列較為整齊，萎縮程度減少，細(xì)胞間隙減少。

圖2 各組大鼠豎脊肌組織形態(tài)表現(xiàn)比較(HE，×200)

2.4 各組透射電鏡比較

圖3示，空白組符合正常骨骼肌肌節(jié)結(jié)構(gòu)正常，肌漿網(wǎng)形態(tài)正常且無(wú)腫脹；與空白組比較，模型組雖然肌節(jié)結(jié)構(gòu)較為正常，肌絲排列整齊，但肌漿網(wǎng)呈現(xiàn)明顯腫脹特征且數(shù)量減少，肌漿網(wǎng)管出現(xiàn)不同程度的擴(kuò)張；與模型組比較，針刺穴位組、陽(yáng)性藥物組肌節(jié)結(jié)構(gòu)正常，肌絲排列整齊，肌漿網(wǎng)形態(tài)較為正常，偶見(jiàn)局部輕度腫脹、擴(kuò)張。

圖3 各組大鼠豎脊肌組織超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)比較(透射電鏡)

2.5 各組肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

圖4、5示，與空白組比較，模型組大鼠豎脊肌AI值升高(P<0.01) ; 與模型組比較，針刺穴位組、陽(yáng)性藥物組豎脊肌AI值降低 (P<0.01)，針刺非穴位組AI值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陽(yáng)性藥物組比較，針刺穴位組AI值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，藍(lán)色熒光為DAPI核染，綠色熒光為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞圖4 各組大鼠骨骼肌肌細(xì)胞TUNEL熒光結(jié)果比較(TUNEL×400)

注: 與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01圖5 各組大鼠骨骼肌肌細(xì)胞凋亡指數(shù)變化比較

3 討論

腰骨骼肌衰老、退變是造成腰椎失穩(wěn)的核心因素，引起腰痛的發(fā)生與反復(fù)發(fā)作?！把澄星蟆笔悄壳芭R床治療腰背部疾病的重要經(jīng)驗(yàn)指南。委中為背腰兩支膀胱經(jīng)脈在腘窩的會(huì)合處，起疏調(diào)腰背之氣的作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，委中的神經(jīng)投射到脊髓節(jié)段分布和腰背部肌肉的神經(jīng)節(jié)段分布，在脊髓和后根神經(jīng)節(jié)有相互重疊的部位，說(shuō)明刺激委中與治療腰背肌肉疾病有著密切關(guān)系[10]。腎俞為腎的背俞穴，是腎中精氣輸注的部位。腎為“先天之本”，主生長(zhǎng)發(fā)育與生殖，腎虛而致衰。中醫(yī)認(rèn)為選取腎俞可疏導(dǎo)腰部經(jīng)氣，調(diào)和局部氣血[11]?，F(xiàn)代研究也證實(shí)，腎俞能改善免疫功能，調(diào)節(jié)激素水平，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，是延緩衰老的重要穴位[12，13]。本實(shí)驗(yàn)采用D-gal建立LMA模型大鼠，觀察針刺“委中”“腎俞”兩穴對(duì)衰老大鼠腰肌質(zhì)量、組織形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞凋亡的影響，初步探討針刺療法延緩腰肌衰老的可能機(jī)制。

研究顯示，D-gal致衰老模型大鼠會(huì)出現(xiàn)肌肉減少，導(dǎo)致體質(zhì)量減小[14]。SI值是判定肌肉衰減的重要指標(biāo)[15]。溫佩彤等[16]發(fā)現(xiàn)，電針“腎俞”“足三里”能提高骨骼肌濕質(zhì)量比。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用針刺、陽(yáng)性藥物干預(yù)后，大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率、SI值均明顯提高，表明針刺“委中”“腎俞”能提高骨骼肌質(zhì)量，延緩肌肉衰減。

隨著機(jī)體年齡的增長(zhǎng)，且長(zhǎng)期慢性炎癥、線粒體功能障礙以及活性氧累積造成的氧化應(yīng)激，會(huì)直接損害骨骼肌興奮-收縮耦聯(lián)系統(tǒng)，最終導(dǎo)致肌肉無(wú)力和骨骼肌衰減[17，18]。而肌肉的正常收縮功能依賴于肌漿網(wǎng)上Ca2+的攝取與釋放平衡[19]?？梢?jiàn)，肌漿網(wǎng)對(duì)于保證骨骼肌正常功能至關(guān)重要。本研究HE結(jié)果顯示，針刺使骨骼肌纖維組織更加緊密，圓形化程度減少，萎縮程度減少，細(xì)胞間隙減少。進(jìn)一步進(jìn)行電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，針刺可增加肌漿網(wǎng)數(shù)量，改善肌漿網(wǎng)水腫和擴(kuò)張，說(shuō)明針刺“委中”“腎俞”能一定程度上糾正肌漿網(wǎng)的異常改變，修復(fù)肌漿網(wǎng)的功能，延緩肌肉衰老。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體生命活動(dòng)中的重要組成部分，通過(guò)誘導(dǎo)衰老、有害或受感染的細(xì)胞降解，維持細(xì)胞的更新，保證正常的生理生化和免疫功能。當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控失調(diào)出現(xiàn)過(guò)度或不充分的凋亡時(shí)，就可能誘發(fā)許多衰老相關(guān)疾病，如肌肉衰老。Kujoth GC 等[20]證實(shí)，當(dāng)線粒體γ聚合酶(Polg)突變?cè)谛∈篌w內(nèi)積累時(shí)，會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)不同組織病理性的細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步加速小鼠的衰老。Zhang Y[21]等也對(duì)D-gal誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠的腦組織進(jìn)行了TUNEL法檢測(cè)，結(jié)果顯示與空白組比較，衰老組小鼠凋亡指數(shù)明顯升高。此外，楊艷[22]在骨骼肌和心肌組織實(shí)驗(yàn)中也得出衰老組大鼠凋亡指數(shù)較空白組升高的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，與上述研究結(jié)果一致。針刺干預(yù)后細(xì)胞凋亡率較模型組明顯下降，說(shuō)明其抗衰老機(jī)制可能與改善骨骼肌細(xì)胞凋亡情況有關(guān)，可作為后續(xù)的進(jìn)一步研究方向。

綜上，針刺“委中”“腎俞”可減少腰椎骨骼肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肌漿網(wǎng)功能修復(fù),改善大鼠腰骨骼肌衰老狀態(tài)。