電針對(duì)睡眠剝奪模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和Beclin1、LC3B、PI3K及Akt的影響?

游明燦， 陳新旺， 游言文， 郝 莉

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 鄭州 450052；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院， 鄭州 450003；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 鄭州 450046)

睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)是指由多種原因引起的個(gè)體睡眠時(shí)間減少。SD是現(xiàn)代社會(huì)普遍存在的問題，影響著全世界數(shù)百萬(wàn)人的生活[1]。研究表明，SD可引起人的學(xué)習(xí)記憶能力下降[2-5]。海馬是與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要腦區(qū)[6]。SD可通過神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和自噬等病理機(jī)制引起海馬神經(jīng)元的損傷[7]，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶。目前，尚未有改善SD的有效藥物。因此，尋找安全、有效治療SD的方法成為當(dāng)務(wù)之急。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)降解并回收利用的過程，它有助于維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和生理功能[8]，但過度自噬又可導(dǎo)致細(xì)胞損傷。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SD能使神經(jīng)元發(fā)生過度自噬，繼而引起細(xì)胞凋亡和死亡。抑制神經(jīng)元過度自噬和凋亡，可改善SD小鼠的認(rèn)知障礙[9]。有學(xué)者提出，調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號(hào)通路，可減少海馬神經(jīng)元過度自噬和凋亡，減輕神經(jīng)損傷，從而改善SD相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶障礙[10，11]。另外，抑制小鼠海馬神經(jīng)元過度自噬，同時(shí)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，可改善SD小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙[12]。

針灸作為一種傳統(tǒng)的中醫(yī)療法，已成為世界上應(yīng)用較廣泛的替代醫(yī)學(xué)療法之一，而且具有并發(fā)癥少、安全性高和費(fèi)用較低等優(yōu)勢(shì)。近年來，針灸已用于SD的臨床治療，可改善患者的認(rèn)知功能，減輕臨床癥狀[13]。但是其中具體的分子作用機(jī)制尚未闡明。因此，本研究擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察電針百會(huì)和大椎穴對(duì)改良多平臺(tái)水環(huán)境法，誘導(dǎo)建立SD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用和對(duì)肌球蛋白樣BCL2結(jié)合蛋白(myosin-like BCL2 interacting protein，Beclin 1)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 B(microtubule-associated protein 1 light chain 3 Beta，LC3B)、PI3K和Akt的影響，以期為電針臨床應(yīng)用于治療SD奠定相應(yīng)的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究通過河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)LLBH-20210309)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Sprague Dawley大鼠27只2月齡，體質(zhì)量(260±20)g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK豫2017-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)東明路校區(qū)動(dòng)物房中，環(huán)境溫度為(22±2)℃，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜12 h光照/12 h黑暗，動(dòng)物可自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1.2 主要試劑及儀器

一抗Beclin 1(貨號(hào)ab207612)、LC3B(貨號(hào)ab48394)、PI3K(貨號(hào)ab139307)、Akt(ab179463)、磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-Akt)(貨號(hào)ab81283)、二抗(貨號(hào)ab6721)，英國(guó)Abcam公司；內(nèi)參(貨號(hào)BA0056)，武漢博士德生物工程公司；TRIzol試劑(貨號(hào)15596026)，美國(guó)Thermo公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)RR037)、RNA擴(kuò)增試劑盒(貨號(hào)RR420)，大連Takara公司；蛋白定量試劑盒(貨號(hào)PC0020、凝膠試劑盒(貨號(hào)P1200)，北京索萊寶科技有限公司；轉(zhuǎn)印膜(貨號(hào)IPVH00010)，美國(guó)Millipore公司；超敏化學(xué)發(fā)光液(貨號(hào)KE0101)，北京密碼子生物公司。

G6805型電針儀，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；0.30×25 mm型針灸針，蘇州醫(yī)衛(wèi)材料公司；63031型Morris水迷宮、F6774型Y迷宮，深圳瑞沃德生命科技有限公司；SMART3.0型行為學(xué)視頻追蹤軟件，美國(guó)Harvard Apparatus公司；Minilys型組織研磨儀，法國(guó)BT公司；1510型酶標(biāo)儀、ES-A01-NanoDrop 2000/2000c型紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司；GL-150型恒溫加熱儀，海門其林貝爾儀器制造有限公司；HM325型石蠟切片機(jī)，美國(guó)Thermo公司；BX53型顯微鏡，日本奧林巴斯公司；VE-180型垂直電泳槽、VE-186型轉(zhuǎn)移電泳槽，上海天能科技有限公司；Universal Hood Ⅲ型蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 分組與模型制備

將27只2月齡雄性Sprague Dawley大鼠按照隨機(jī)分配原則分為對(duì)照組、模型組和電針組每組各9只，采用改良多平臺(tái)水環(huán)境法誘導(dǎo)建立SD大鼠模型[14]。此方法是指大鼠進(jìn)入快速眼動(dòng)睡眠時(shí)肌張力下降，可落入水中。由于大鼠恐水，落水后會(huì)盡全力爬上平臺(tái)，所以可達(dá)到睡眠剝奪。設(shè)備包括一個(gè)110 cm × 60 cm ×40 cm鼠箱，內(nèi)置15個(gè)直徑6 cm、高8 cm的圓形平臺(tái)，平臺(tái)間隔15 cm。每天實(shí)驗(yàn)開始前，向箱內(nèi)注清水至平臺(tái)下約1 cm處，水溫(23±2)℃。實(shí)驗(yàn)開始前3 d，每天把大鼠放于平臺(tái)上適應(yīng)2 h。實(shí)驗(yàn)時(shí)讓大鼠每天在平臺(tái)上停留20 h(前一天下午2∶00—第二天上午10∶00)[15，16]持續(xù)7 d。大鼠可在平臺(tái)間穿梭和停留，并可自由攝食和飲水。對(duì)照組大鼠在直徑18 cm的大平臺(tái)水環(huán)境中飼養(yǎng)(由于平臺(tái)大，大鼠通常不會(huì)落入水中)，其余條件同改良多平臺(tái)水環(huán)境法。

1.4 干預(yù)方法

本研究中選穴定位依據(jù)中國(guó)中醫(yī)藥出版社出版、郭義主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》(新世紀(jì)第四版)。百會(huì)位于頂骨中點(diǎn)，大椎屬督脈，位于第七頸椎棘突與第一胸椎棘突之間。電針組治療于每天同一時(shí)間進(jìn)行，選用直徑0.30 mm、長(zhǎng)25 mm的毫針，直刺或斜刺進(jìn)針后針柄連接電針儀輸出端，刺激參數(shù)選用連續(xù)波、頻率2Hz、電流1 mA，刺激強(qiáng)度以大鼠四肢輕微抖動(dòng)為度，每次15 min，每日1次，連續(xù)7 d。對(duì)照組使用大平臺(tái)水環(huán)境，模型組使用改良多平臺(tái)水環(huán)境法造模，電針非穴位即在百會(huì)和大椎穴旁4 mm處，連接電針儀但不通電。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)和取材

1.5.1 Morris水迷宮測(cè)試 Morris水迷宮是通過強(qiáng)迫大鼠游泳，讓其學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中的平臺(tái)。本研究用于評(píng)價(jià)電針對(duì)大鼠海馬依賴性空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。該系統(tǒng)由圓形水池、自動(dòng)錄像記錄系統(tǒng)及分析軟件三部分組成。圓形水池的直徑和高分別為120 cm和50 cm，水池分4個(gè)象限，其中一象限中放置一直徑和高分別為12 cm和32 cm的平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)第2天開始水迷宮測(cè)試，每天在固定時(shí)間進(jìn)行。測(cè)試前向水池注入清水，水面高于平臺(tái)1 cm，溫度(23±2)℃，并加入奶粉攪拌至平臺(tái)不可見。采用SMART 3.0行為學(xué)視頻追蹤軟件記錄大鼠逃避潛伏期。

第1天到第5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，用于檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)能力。實(shí)驗(yàn)開始前把大鼠放入水中熟悉環(huán)境5 min，實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠分別從4個(gè)象限面向池壁放入水中，記錄其找到平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期。若能找到平臺(tái)，讓大鼠在平臺(tái)停留15 s。若未能在1 min內(nèi)找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)并停留15 s，逃避潛伏期記為60 s。平臺(tái)在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后移走。

第6天進(jìn)行的空間探索實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)大鼠空間記憶能力。將大鼠于原平臺(tái)所在象限的對(duì)面象限面向池壁放入水中，記錄分析大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比。

1.5.2 Y迷宮測(cè)試 Y迷宮用于評(píng)價(jià)每組大鼠工作記憶能力。Y迷宮由三個(gè)長(zhǎng)度相等的臂組成，相鄰臂之間的夾角為120°。將動(dòng)物放在Y迷宮中心，讓其在安靜環(huán)境下探索5 min。大鼠連續(xù)進(jìn)入3個(gè)不同的臂即為1次準(zhǔn)確交替，自發(fā)交替準(zhǔn)確率=[準(zhǔn)確交替次數(shù)/(進(jìn)臂總次數(shù)-2)]/100%，使用SMART 3.0軟件記錄和分析數(shù)據(jù)。

1.5.3 組織取材 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，分別用20%(質(zhì)量/體積)烏拉坦進(jìn)行腹腔注射麻醉，每組6只大鼠冰上快速取腦，用眼科鑷分離兩側(cè)海馬組織。分別置于離心管中凍存-80 ℃，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)。

另外每組剩余3只大鼠麻醉后打開胸腔，暴露心臟及右心耳。沿心尖注入預(yù)冷生理鹽水，并迅速剪開右心耳進(jìn)行灌注。肝臟顏色逐漸蒼白，更換預(yù)冷4%多聚甲醛，由快到慢直至大鼠四肢抖動(dòng)僵直、尾巴翹起即停止灌注。斷頭取全腦，將腦組織放入固定液中，常溫下4%多聚甲醛固定24 min，用于免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。

1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠海馬Beclin1、LC3B、PI3K和Akt 的mRNA表達(dá) 冰凍海馬組織加入1 mL總RNA抽提試劑TRIzol研磨，低溫離心取上清并提取RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量總RNA濃度，接著進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。表1示，引物設(shè)計(jì)均由上海生工合成。按照試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。每個(gè)樣品均做3個(gè)平行孔，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分別計(jì)算Beclin1、LC3B、PI3K和Akt的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.5.5 免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬Beclin1和LC3B的表達(dá) 將組織從固定液中取出，依次進(jìn)行梯度酒精脫水，將浸好蠟的組織進(jìn)行包埋，修整包埋后的蠟塊并切片厚度4 μm，切片放入二甲苯和酒精中脫蠟至水。用3%過氧化氫封閉以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。然后將組織切片置于修復(fù)盒中，微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)。切片上滴加配好的一抗Beclin 1(1∶200)和 LC3B (1∶200)，濕盒內(nèi)4℃過夜。清洗后加入二抗(1∶400)，室溫孵育1 h。顯微鏡下觀察并采集圖像，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均光密度。

1.5.6 免疫印跡法檢測(cè)大鼠海馬PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá) 取冰凍海馬組織加入裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑中，研磨至裂解液中無(wú)明顯塊狀組織。4℃離心10 min收集上清液檢測(cè)濃度，并將蛋白100℃電加熱5 min使其完全變性。每個(gè)泳道分別取20 μg蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。取出凝膠，與PVDF膜和濾紙進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

轉(zhuǎn)膜后使用脫脂奶粉封閉1 min，清洗后加入使用5%脫脂奶配制的一抗PI3K(1∶1000)、Akt(1∶1000)、p-Akt(1∶1000)和β-actin(1∶2000)，4℃下孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 min。加ECL超敏化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光成像，使用Image J軟件和β-actin作為內(nèi)參分析比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)SD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

在定位航行實(shí)驗(yàn)的第5天，與對(duì)照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)；電針治療可使SD模型大鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比下降(P<0.05)；電針治療可使SD模型大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比上升(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 電針對(duì)SD大鼠工作記憶能力的影響

各組大鼠總進(jìn)臂次數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較，模型組大鼠自發(fā)交替準(zhǔn)確率明顯降低(P<0.05)，電針治療可使SD大鼠自發(fā)交替準(zhǔn)確率增加(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.3 電針對(duì)各組大鼠海馬Beclin1、LC3B、PI3K和Akt mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織中Beclin1和LC3B的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，PI3K mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠海馬組織中Beclin1和PI3K的mRNA表達(dá)分別下降和增加(P<0.05)，而LC3B mRNA水平有下降趨勢(shì)(P>0.05)。另外，各組間Akt mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠海馬Beclin1、LC3B、PI3K和Akt mRNA表達(dá)比較

2.4 電針對(duì)各組大鼠海馬CA1區(qū)Beclin1和LC3B蛋白表達(dá)的影響

自噬主要相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3B主要位于海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)深黃色或褐色(圖中紅色箭頭所指)。免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)著色呈現(xiàn)深黃色或褐色，有大量陽(yáng)性細(xì)胞；電針治療可使SD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)中的Beclin-1平均光密度減少(P<0. 05)，而 LC3B平均光密度有減少的趨勢(shì)(P>0. 05)，這與Beclin1和LC3B的mRNA結(jié)果基本一致(見表5圖1)。

表5 各組大鼠海馬CA1區(qū)Beclin1、LC3B平均光密度比較

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Beclin1和LC3B蛋白表達(dá)比較(50 μm)

2.5 電針對(duì)大鼠海馬PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織內(nèi)PI3K和p-Akt /Akt表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠海馬組織PI3K和p-Akt /Akt水平增加(P<0.05)(見表6圖2)。

表6 各組大鼠海馬PI3K、p-Akt/Akt比較

圖2 各組大鼠海馬PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)

3 討論

SD屬于中醫(yī)學(xué)失眠和不寐等范疇[17]，其引起的學(xué)習(xí)記憶障礙屬于中醫(yī)學(xué)善忘和呆癥等范疇。百會(huì)屬督脈，督脈是諸陽(yáng)經(jīng)之匯，對(duì)整個(gè)經(jīng)脈系統(tǒng)有統(tǒng)帥作用。百會(huì)穴可振奮陽(yáng)氣、安神定志和醒腦開竅[18，19]。大椎穴又名百勞穴，匯聚手足三陽(yáng)的陽(yáng)熱之氣與督脈的陽(yáng)氣上行頭頸[20]。本研究選用電針百會(huì)和大椎穴干預(yù)SD模型大鼠，觀察到電針百會(huì)和大椎穴可增強(qiáng)改良多平臺(tái)水環(huán)境法誘導(dǎo)建立的SD大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力，而且這種改善作用可能與激活PI3K/Akt信號(hào)通路，降低自噬相關(guān)基因Beclin-1表達(dá)水平相關(guān)。

Morris水迷宮和Y迷宮是檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶的重要行為學(xué)方法[21，22]。結(jié)果顯示，電針治療可縮短SD模型大鼠在Morris水迷宮中的逃避潛伏期，增加穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比，提高Y迷宮中自發(fā)交替準(zhǔn)確率，這說明電針百會(huì)和大椎穴可改善改良多平臺(tái)水環(huán)境法誘導(dǎo)建立的SD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

Beclin-1和LC3是自噬的關(guān)鍵標(biāo)志物，常用于評(píng)價(jià)自噬水平，其中Beclin1主要募集蛋白質(zhì)與PI3K形成復(fù)合物，并引導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白定位于自噬體膜，促進(jìn)自噬體膜的形成[23]。而LC3位于自噬體表面，是自噬體的關(guān)鍵標(biāo)志物[24]。LC3包括A、B和C 3個(gè)亞基，常通過檢測(cè)LC3B來衡量LC3的表達(dá)。SD病理改變與細(xì)胞過度自噬密切相關(guān)。SD相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力被認(rèn)為是海馬依賴性的。因此，研究假設(shè)電針增強(qiáng)改良多平臺(tái)水環(huán)境法誘導(dǎo)建立的SD大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力與降低海馬神經(jīng)元自噬水平相關(guān)。為驗(yàn)證這一假設(shè)，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)海馬Beclin-1與LC3B的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，電針治療可降低海馬Beclin-1的mRNA和蛋白水平，同時(shí)有下調(diào)LC3B mRNA和蛋白表達(dá)的趨勢(shì)，提示電針改善SD大鼠學(xué)習(xí)記憶可能與降低海馬神經(jīng)元自噬水平相關(guān)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元自噬，其活性下降可導(dǎo)致SD細(xì)胞自噬過度和細(xì)胞凋亡[10，11]。激活PI3K/Akt信號(hào)通路能夠防止SD中神經(jīng)元凋亡和丟失，具有神經(jīng)保護(hù)作用[25，26]。為進(jìn)一步探討PI3K/Akt信號(hào)通路在電針改善SD模型大鼠認(rèn)知障礙，降低海馬神經(jīng)元自噬水平中的作用，本研究又通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法，分別檢測(cè)PI3K和Akt的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，改良多平臺(tái)水環(huán)境法誘導(dǎo)能夠降低SD大鼠海馬PI3K和Akt的mRNA與蛋白水平，說明SD中PI3K/Akt通路活性降低，這與文獻(xiàn)結(jié)果一致[27，28]。另外，Akt有2個(gè)主要的磷酸化位點(diǎn)Thr308和Ser473，激活A(yù)kt主要依賴于Ser473的磷酸化[29]。本研究中，磷酸化位點(diǎn)為Ser473的p-Akt在SD大鼠海馬表達(dá)降低，而電針逆轉(zhuǎn)了這種降低；然而，Akt的表達(dá)沒有明顯改變，表明Akt是通過磷酸化發(fā)揮作用的。本研究觀察到，電針可使SD大鼠模型海馬中的PI3K mRNA和蛋白表達(dá)以及p-Akt/Akt水平上升，這些提示電針可增加PI3K/Akt信號(hào)通路活性，降低神經(jīng)元自噬，進(jìn)而改善SD相關(guān)的認(rèn)知障礙。

睡眠是由2個(gè)交替出現(xiàn)的不同時(shí)相組成，即快速眼動(dòng)睡眠和非快速眼動(dòng)睡眠，這2種睡眠時(shí)相的數(shù)量決定了睡眠的質(zhì)量[30]。失眠模型大鼠的非快速眼動(dòng)睡眠和快速眼動(dòng)睡眠的數(shù)量均減少，覺醒時(shí)間延長(zhǎng)，而且非快速眼動(dòng)睡眠轉(zhuǎn)換為快速眼動(dòng)睡眠的次數(shù)減少[31]。電針治療對(duì)SD大鼠各睡眠時(shí)相的影響如何，電針治療在改善SD大鼠認(rèn)知障礙的同時(shí)是否能增加各睡眠時(shí)相的數(shù)量和轉(zhuǎn)換次數(shù)，這些內(nèi)容需在后續(xù)的研究中探討。

綜上所述，電針百會(huì)和大椎穴改善多平臺(tái)水環(huán)境誘導(dǎo)建立的SD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與電針通過增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)通路活性、減輕海馬神經(jīng)元自噬相關(guān)，這些結(jié)果為電針應(yīng)用于臨床治療睡眠剝奪奠定了理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。