辣椒抗PMMoV基因L4連鎖標(biāo)記的驗(yàn)證分析

朱雪梅, 郭廣君, 潘寶貴, 刁衛(wèi)平, 劉金兵, 高長洲, 王述彬

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京210014)

中國是世界上辣椒、甜椒(Capsicumspp.)種植面積最廣、消費(fèi)量最多的國家，常年播種面積在2.2×106hm2，約占世界辣椒播種面積的40%[1]。隨著中國辣椒種植面積的擴(kuò)大、種植模式多樣化及氣候影響，辣椒病害發(fā)生日益嚴(yán)重和多樣。病毒病是辣椒生產(chǎn)上的主要病害之一，部分病毒病會嚴(yán)重影響果實(shí)品質(zhì)，導(dǎo)致30%～70%的減產(chǎn)甚至絕收[2]。近年來煙草花葉病毒屬的辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)在國內(nèi)大部分辣椒主產(chǎn)區(qū)發(fā)生，逐步成為常發(fā)性病害，在江蘇地區(qū)，其檢出率高達(dá)62.28%[3]。

1964年P(guān)MMoV在美國被發(fā)現(xiàn)[4]，隨后擴(kuò)散至歐洲、澳洲及亞洲等地，成為一種世界性病害。1994年中國新疆石河子地區(qū)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)PMMoV[5]，目前全國多個地區(qū)均有該病毒的報(bào)道[6]。PMMoV侵染后，辣椒葉片癥狀不明顯，嚴(yán)重時出現(xiàn)褪綠斑駁和花葉癥狀，在果實(shí)上癥狀明顯，表現(xiàn)為果小、果面有褪綠斑駁、凹凸斑點(diǎn)，甚至出現(xiàn)畸形與壞死現(xiàn)象[7]。該病毒主要為種子傳毒、花粉帶毒和汁液摩擦傳毒，其中種子傳毒和花粉帶毒是遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑[8]。

L基因座位于辣椒11號染色體的端粒附近，目前發(fā)現(xiàn)5個等位基因(L0、L1、L2、L3和L4)，其中L1～L4是辣(甜)椒抗煙草花葉病毒屬病毒的主要抗性基因。根據(jù)煙草花葉病毒(TMV)在攜帶不同L等位基因的宿主上產(chǎn)生的不同癥狀，該病毒屬病毒可劃分成P0、P1、P1,2、P1,2,3、P1,2,3,45個致病基因型[9-11]。其中P1,2是目前辣椒大田和溫室生產(chǎn)中最為常見的致病基因型，L3基因?qū)ζ渚哂泻軓?qiáng)的抗性，通過雜交等方法將L3基因轉(zhuǎn)育至商業(yè)品種中可很好地控制該致病基因型[11]。而P1,2,3致病性強(qiáng)于P1,2，且可克服L3的抗性，目前在中國多個省份已有發(fā)現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，在枸杞辣椒(Capsicumchacoensecv.)PI260429中發(fā)現(xiàn)的L4等位基因?qū)1,2,3具有抗性[12]，并對其他致病基因型具有廣譜抗性[9]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所辣椒課題組通過回交結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇獲得了攜帶L4抗性基因、早熟、大果型甜椒自交系 PT83-163[13]。

目前針對L4基因定位的研究已有較多報(bào)道并開發(fā)出多個與L4抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。2003年Matsunaga等[14]利用抗病材料AP-PM04和感病材料Mie-midori構(gòu)建F2群體，鑒定出1個隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphism DNA, RAPD)標(biāo)記WA31-1500。根據(jù)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)標(biāo)記L4-c開發(fā)出的序列特異性擴(kuò)增區(qū)域(Sequence characterized amplified regions，SCAR)標(biāo)記L4SC340距離L4基因1.8 cM，該標(biāo)記為1個顯性標(biāo)記[15]。通過對細(xì)菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome，BAC)文庫082F03測序開發(fā)出的共顯性酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(Cleaved amplified polymorphism sequences，CAPS)標(biāo)記087H03T7距離L4基因1.5 cM[16]。Yang 等[17]在2012年鑒定出1個L4的候選基因，根據(jù)該候選基因的富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)區(qū)間開發(fā)出L4segF&R標(biāo)記，但是該標(biāo)記與L4基因無法實(shí)現(xiàn)完全的共分離，說明該候選基因并不是L4基因。Lee等[18]通過分析2個BAC克隆(GenBank登錄號：FJ597539、FJ597541)設(shè)計(jì)出8對引物。比較ECW(L0)、Tisana(L1)、CM334(L2)、PI159236(L3)和PI260429(L4)5個基因型用引物L(fēng)-V0-4擴(kuò)增出的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)L4基因型的擴(kuò)增序列中存在1個34 bp的序列缺失，據(jù)此開發(fā)出1個L4-SCAR標(biāo)記用于L4基因的篩選。

綜上所述，目前開發(fā)出的與L4連鎖的標(biāo)記中，L4SC340、087H03T7及L4-SCAR3個標(biāo)記具有操作方法簡單、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，適用于抗病材料大批量篩選。因此，本研究對上述3對標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證以期篩選出準(zhǔn)確性最高且可用于輔助篩選攜帶L4抗性基因種質(zhì)材料的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的辣椒種質(zhì)材料共103份，包括從國家蔬菜種質(zhì)資源庫引種的辣椒地方品種、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)高代育種材料和引種自美國農(nóng)業(yè)部(United States Department of Agriculture，USDA)的種質(zhì)資源。鑒于一年生辣椒中基本沒有攜帶L3和L42個抗性基因的種質(zhì)材料，因此選擇攜帶有L3基因的抗性材料C.chinensecv. PI159236和攜帶有L4基因的抗性材料C.chacoensecv. PI260429作為抗病對照，7份感病育種材料作為感病對照。

1.2 辣椒DNA的提取

采用簡化的十六烷基三甲基溴化銨法(Hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB)提取辣椒DNA，本研究參考Loraine等[19]的方法。用1%瓊脂糖凝膠和超微量分光光度計(jì)檢測DNA的質(zhì)量和濃度，統(tǒng)一調(diào)整DNA質(zhì)量濃度為 50 ng/μl，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物序列及反應(yīng)程序

PCR 擴(kuò)增體系總體積為 20.0 μl：DNA 模板 2.0 μl，2×TSINGKE? Master Mix 10.0 μl，上下游引物(表1)各 0.4 μl，用ddH2O 補(bǔ)充至 20.0 μl。

表1 3對與L4基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物序列

引物L(fēng)4SC340的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性 20 s，50～65 ℃ (選擇合適的退火溫度)退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min；4 ℃保存。鑒于該標(biāo)記為顯性標(biāo)記，為避免由于退火溫度導(dǎo)致的假陽性，對其最適退火溫度進(jìn)行篩選，分別設(shè)置50 ℃、53 ℃、56 ℃、59 ℃、62 ℃、65 ℃ 6個退火溫度。

引物087H3T7的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性20 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min；4 ℃保存。

引物087H3T7的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)反應(yīng)體系為 10.0 μl，包括 5.0 μl PCR 產(chǎn)物，0.2 μlSspⅠ內(nèi) 切 酶，1.0 μl Buffer，用ddH2O補(bǔ)足至 10.0 μl，37 ℃下孵化3 h。

用2%的瓊脂糖凝膠檢測L4SC340和087H3T7的PCR產(chǎn)物。

L4-SCAR的PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性 20 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物檢測：10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(180 V, 150 min)分離 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳結(jié)束后，銀染法染色，觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒育種材料田間PMMoV發(fā)病情況

2021年秋季，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動物科學(xué)基地的辣椒育種材料在自然條件下部分表現(xiàn)出被PMMoV侵染后的狀況。其中7份育種材料在轉(zhuǎn)色期果面表現(xiàn)出明顯的褪綠斑駁、凹凸斑點(diǎn)、畸形與壞死等癥狀，因此選擇上述7份材料作為PMMoV感病對照。

2.2 標(biāo)記L4SC340引物序列最佳退火溫度的確定

L4SC340為1個顯性標(biāo)記，為明確PCR過程中引物的最佳退火溫度，避免假陽性，以攜帶L4基因的抗性材料PI260429和7份種質(zhì)材料為試驗(yàn)材料，設(shè)置6個退火溫度。結(jié)果(圖1)顯示，在50 ℃、53 ℃和56 ℃的退火溫度下，8份材料全部能擴(kuò)增出目的條帶；在59 ℃退火溫度下，8份材料中有7份可擴(kuò)增出條帶；在65 ℃的退火溫度下，包括L4抗源PI260429在內(nèi)的8份材料全部無法擴(kuò)增出目的條帶；只有在62 ℃下，8份材料擴(kuò)增差異最為明顯。據(jù)此說明，62 ℃為L4SC340的最優(yōu)退火溫度。

2.3 L4SC340、087H3T7和L4-SCAR標(biāo)記的準(zhǔn)確性分析

以攜帶L3基因的PI159236和攜帶L4基因的PI260429 2份抗病材料和7份田間癥狀明顯的感病材料為試驗(yàn)材料，驗(yàn)證L4SC340、L4-SCAR和087H3T73個標(biāo)記的準(zhǔn)確性。結(jié)果(圖2)顯示，L4SC340在攜帶L3和L4基因的2份材料中均可擴(kuò)增出340 bp的條帶，在7份感病材料中的6份中同樣擴(kuò)增出340 bp的目的條帶(圖2A)。087H3T7在攜帶L3和L4的抗性材料中擴(kuò)增出440 bp的條帶且無法被SspⅠ內(nèi)切酶酶切。7份感病材料中，5份材料的PCR產(chǎn)物可被酶切為300 bp和140 bp，與L0基因型一致，2份材料的PCR產(chǎn)物則被酶切為440 bp、300 bp和140 bp(圖2B)，呈現(xiàn)雜合狀態(tài)。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測L4-SCAR標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，結(jié)果并不理想，無法清晰地分辨抗感材料間的差異(圖2C)。針對上述問題，我們采用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，L4-SCAR為一個顯性標(biāo)記，L3和L4抗性材料可擴(kuò)增出102 bp、136 bp和150 bp 3條目的條帶，而7份感病材料中只擴(kuò)增出136 bp和150 bp 2條目的條帶(圖2D)。

M：DL2000 marker；1～8：退火溫度為50 ℃，其中1為抗病材料PI260429，2～8分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；9～16：退火溫度為53 ℃，其中9為抗病材料PI260429，10～16分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；17～24：退火溫度為56 ℃，其中17為抗病材料 PI260429，18～24分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；25～32：退火溫度為59 ℃，其中25為抗病材料PI260429，26～32分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；33～40：退火溫度為62 ℃，其中33為抗病材料PI260429，34～40分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；41～48：退火溫度65 ℃，其中41為抗病材料PI260429，42～48分別為感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125。圖1 標(biāo)記L4SC340引物序列退火溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperature for primer sequence of L4SC340

M：DL2000 marker；1:PI 159236；2:PI 260429;3:CQ009；4：CQ011；5：PQ215；6：PQ224；7：PQ261；8：LB122；9：LB125。1、2對應(yīng)抗病材料，3～9對應(yīng)感病材料。圖2 標(biāo)記L4SC340(A)、087H3T7(B)和L4-SCAR(C和D)在9份抗感材料中的PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR products of markers L4SC340 (A), 087H3T7 (B) and L4-SCAR (C and D) in nine resistant materials

2.4 L4SC340、L4-SCAR和087H3T7標(biāo)記篩選抗PMMoV材料

利用L4SC340對93份辣椒種質(zhì)材料進(jìn)行篩選時發(fā)現(xiàn)，攜帶L3和L4基因的抗性材料可擴(kuò)增出清晰的目的條帶，但是2份感病材料同樣能擴(kuò)增出較為微弱的目的條帶。而93份種質(zhì)材料中只有7份材料未擴(kuò)增出目的條帶，其他材料均擴(kuò)增出了目的條帶(圖3、表2)。

087H3T7標(biāo)記在L3和L42份抗性材料中擴(kuò)增出的目的條帶為440 bp，在2份感病材料中擴(kuò)增出的條帶為440 bp、300 bp和140 bp，表現(xiàn)為雜合狀態(tài)。93份種質(zhì)材料中23份種質(zhì)材料擴(kuò)增后酶切條帶為440 bp，與抗性材料的擴(kuò)增條帶大小一致；58份種質(zhì)擴(kuò)增后酶切條帶為3條，表現(xiàn)為雜合基因型；10份種質(zhì)擴(kuò)增后酶切條帶為2條，表現(xiàn)為純合感病基因型；此外，還有6份種質(zhì)材料未擴(kuò)增出目的條帶，懷疑為操作誤差(圖4、表2)。

L4-SCAR標(biāo)記在攜帶L3和L4基因的抗性材料中可擴(kuò)增出102 bp、136 bp和150 bp的目的條帶，而從2份感病材料中不能擴(kuò)增出102 bp的目的條帶，說明利用該標(biāo)記可明顯區(qū)別抗病材料和感病材料，但無法區(qū)分?jǐn)y帶L3和L4抗性基因的種質(zhì)資源。93份種質(zhì)材料中14份可擴(kuò)增出102 bp的目的條帶，而79份材料中未擴(kuò)增出102 bp的目的條帶。14份抗性材料中1份為國內(nèi)地方品種關(guān)口田辣椒；其余13份則全部為從美國農(nóng)業(yè)部(USDA)引種的材料且均屬于C.baccatum種。攜帶L3抗性基因的PI159236屬于C.chinense種，但是93份種質(zhì)材料中的4份C.chinense種的材料中均未擴(kuò)增出102 bp的目的條帶(圖5、表2)。

M：DL2000 marker；1: PI 159236；2: PI 260429; 3: CQ009；4：CQ011；5～97：93份辣椒種質(zhì)材料。圖3 標(biāo)記L4SC340在97份辣椒種質(zhì)材料中的擴(kuò)增情況Fig.3 PCR results of marker L4SC340 in 97 pepper germplasm materials

M：DL2000 marker；1: PI 159236；2: PI 260429; 3: CQ009；4：CQ011；5～97：93份辣椒種質(zhì)材料。圖4 標(biāo)記087H3T7在97份辣椒種質(zhì)材料中的擴(kuò)增情況Fig.4 PCR results of marker 087H3T7 in 97 pepper germplasm materials

M：DL2000 marker；1: PI 159236；2: PI 260429; 3: CQ009；4：CQ011；5～97：93份辣椒種質(zhì)材料。圖5 標(biāo)記L4-SCAR在97份辣椒種質(zhì)材料中的擴(kuò)增情況Fig.5 PCR results of marker L4-SCAR in 97 pepper germplasm materials

表2 97份辣椒種質(zhì)材料信息及基因型

3 討論

L4SC340標(biāo)記開發(fā)人員給出的退火溫度為65 ℃[15]，但本研究中在65 ℃退火溫度下，包括攜帶L4基因的抗性材料PI260429的8份材料中均未擴(kuò)增出目的條帶。退火溫度設(shè)定為62 ℃時，PI260429可擴(kuò)增出340 bp的目的條帶，其他7份隨機(jī)材料中有1份材料可擴(kuò)增出目的條帶。據(jù)此，后續(xù)研究中以62 ℃作為最佳退火溫度。但是后續(xù)研究中，攜帶L3和L4基因的2份抗病材料和7份感病材料中僅有1份材料未擴(kuò)增出目的條帶，無法區(qū)分抗病材料和感病材料；而93份種質(zhì)材料中86份材料均能擴(kuò)增出目的條帶。以上結(jié)果說明標(biāo)記L4SC340退火溫度的穩(wěn)定性不足，很容易造成假陽性，無法用于篩選攜帶L4抗性基因的種質(zhì)材料。標(biāo)記開發(fā)人員也發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記除了不能在攜帶L1等位基因的材料中擴(kuò)增出目的條帶外，在攜帶其他L等位基因(L0、L2、L3和L4)的種質(zhì)材料中均可擴(kuò)增出目的條帶。此局限性導(dǎo)致該標(biāo)記無法用于篩選攜帶L4抗性基因的種質(zhì)資源，但是在L4抗性基因回交轉(zhuǎn)育過程中此標(biāo)記可用于抗性單株的篩選[15]。于海龍等[13]以引進(jìn)材料200375(抗PMMoV,含L4基因)為抗源，以甜椒自交系 83-163為回交親本，進(jìn)行多代回交并自交，利用L4SC340分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合苗期抗病性鑒定、形態(tài)選擇，選育了攜帶L4抗性基因、早熟、大果型甜椒自交系 PT83-163。在本研究中標(biāo)記L4SC340退火溫度的穩(wěn)定性不足，假陽性率很高。

據(jù)報(bào)道，087H3T7為共顯性標(biāo)記，在所有辣椒材料中均能夠擴(kuò)增出大小約 440 bp 的目的片段，L4L4基因型的材料不能被SspⅠ內(nèi)切酶切開，L0L0基因型的材料能夠被酶切為大小約300 bp和140 bp 的2個片段，L4L0基因型的材料酶切后有440 bp、300 bp和140 bp 3條目的條帶[16]。本研究中攜帶L3和L4基因的2份抗性材料酶切后目的片段大小均為440 bp，而7份感病材料中有5份材料的PCR產(chǎn)物酶切后大小為300 bp和140 bp，另外2份材料的PCR產(chǎn)物酶切后的大小則為440 bp、300 bp和140 bp。標(biāo)記開發(fā)人員認(rèn)為該標(biāo)記的一大優(yōu)勢是可以區(qū)分L3和L4基因型材料，但是本研究中攜帶L3基因的PI159236和攜帶L4基因的PI260429的目的條帶完全一致。李寧等[20]利用該標(biāo)記篩選攜帶有L4抗性基因的種質(zhì)材料時認(rèn)為L4L4基因型的純合抗病材料11 份，L4L0基因型的雜合抗病材料 1 份。但是該研究所用的抗性對照為攜帶L3抗性基因的PI 159236，這一結(jié)果同樣證明該標(biāo)記不能區(qū)分L3和L4基因型材料。本研究利用該標(biāo)記篩選出與L3和L4抗病材料條帶一致的種質(zhì)材料23份，雜合材料62份。以上結(jié)果說明，087H3T7標(biāo)記可以篩選出攜帶L3和L4抗性基因的種質(zhì)材料，但不能區(qū)分L3和L4基因型材料，同時篩選出的雜合基因型的種質(zhì)材料過多且不一定具有抗性。綜上分析，用標(biāo)記087H3T7篩選攜帶L4抗性基因的種質(zhì)材料，其準(zhǔn)確性存在很大的問題。

Kim 等[15]認(rèn)為鑒于L等位基因附近的基因序列是已知的，那么通過比較攜帶L4基因的種質(zhì)材料與攜帶L0基因的種質(zhì)材料間的序列差異即可開發(fā)出與L4抗性基因連鎖的分子標(biāo)記。Lee等[18]基于此種設(shè)想，開發(fā)出1個與L4基因連鎖的L4-SCAR標(biāo)記。該標(biāo)記為顯性標(biāo)記，攜帶L4抗性基因的材料可特異擴(kuò)增出102 bp的目的條帶，攜帶其他等位基因的種質(zhì)材料無法擴(kuò)增出此目的條帶。本研究根據(jù)Lee等[18]的研究結(jié)果，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測L4-SCAR標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，但無法清晰地分辨抗病材料和感病材料間的差異。改用10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示攜帶L4和L3基因的抗性材料均可擴(kuò)增出102 bp、136 bp和150 bp的目的條帶，而7份感病材料中只擴(kuò)增出136 bp和150 bp 2條目的條帶。利用該標(biāo)記篩選出與抗性材料具有相同目的條帶的種質(zhì)材料14份，且14材料均包含在087HT7標(biāo)記篩選出的23份抗性種質(zhì)材料中。這一結(jié)果說明該標(biāo)記可以篩選出攜帶L3和L4抗性基因的種質(zhì)材料，但是無法明確區(qū)分L3和L4基因型，同時該標(biāo)記為顯性標(biāo)記，無法區(qū)分雜合基因型。除標(biāo)記開發(fā)人員，該標(biāo)記還未被其他科研人員應(yīng)用及驗(yàn)證。本研究認(rèn)為，該標(biāo)記對L3和L4抗性基因篩選的準(zhǔn)確性要高于標(biāo)記L4SC340和087H3T7。

整體來說本研究檢測的3個與L4連鎖的分子標(biāo)記均不能準(zhǔn)確地用于篩選攜帶L4抗性基因的種質(zhì)材料。其中標(biāo)記L4SC340退火溫度不穩(wěn)定，很容易造成假陽性，所以其篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性無法保障。標(biāo)記087H3T7和L4-SCAR可以篩選出攜帶L3和L4抗性基因的辣椒種質(zhì)，但無法區(qū)分?jǐn)y帶L3和L4基因的抗性材料，同時087H3T7存在雜合基因型過高的問題。二者比較來說，L4-SCAR篩選的準(zhǔn)確度高于087H3T7，但是L4-SCAR為顯性標(biāo)記無法區(qū)分雜合基因型。因此在明確抗性材料基因型的情況下，L4-SCAR標(biāo)記結(jié)合087H3T7更有利于L3和L4抗性基因轉(zhuǎn)育后代抗性單株的輔助篩選。