2種鵝星狀病毒一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

楊 穎, 肖亦辰, 馬 平, 趙冬敏, 章麗嬌, 李 銀, 劉青濤, 楊 婧, 劉宇卓, 韓凱凱, 黃欣梅

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇南京210014；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014；3.國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014；4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095)

星狀病毒(Astrovirus)是一種無(wú)囊膜，單股正鏈的RNA病毒，其基因組全長(zhǎng)6.2～7.8 kb，包含ORF1a、ORF1b和ORF2 3個(gè)開放閱讀框以及5′UTR、3′UTR和PolyA尾[1]。星狀病毒科包括哺乳動(dòng)物星狀病毒屬和禽星狀病毒屬2個(gè)屬。哺乳動(dòng)物星狀病毒屬可導(dǎo)致人、豬、牛、羊、貓和犬等多種哺乳動(dòng)物患胃腸炎、腦膜炎和腹瀉疾病[2-4]。禽星狀病毒屬可引起鴨致死性肝炎[5]，雞的發(fā)育不良綜合征[6]、白雞綜合征[7]、火雞的家禽腸炎死亡綜合征[8]等。

Bidin等[9]從克羅地亞地區(qū)鵝群中分離到禽星狀病毒屬中的禽腎炎病毒(Avian nephritis virus, ANV)，并證實(shí)該星狀病毒在鵝場(chǎng)中普遍存在，可導(dǎo)致鵝胚胎發(fā)育障礙及孵化階段死亡。Zhang等[10]從湖南省具有腸炎癥狀的雛鵝體內(nèi)鑒定出1株鵝源星狀病毒(Goose astrovirus, GoAstV)FLX株?；蛐蛄蟹治鼋Y(jié)果表明，與禽星狀病毒屬其他成員相比，鵝星狀病毒FLX株的基因組核苷酸同源性為51%～59%，3個(gè)開放閱讀框的氨基酸同源性低于66%，是禽星狀病毒屬中新出現(xiàn)的一種鵝源星狀病毒。2017年至2019年，有研究者從國(guó)內(nèi)鵝群中分離到鵝源星狀病毒SCCD株和AHDY株，遺傳序列分析結(jié)果表明，SCCD株和AHDY株與FLX株編碼衣殼蛋白的ORF2基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸同源性為81%，遺傳距離為0.189。國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)星狀病毒研究小組規(guī)定，不同星狀病毒毒株的ORF2基因編碼氨基酸同源性若大于75%，可劃分為同一星狀病毒種，如果遺傳距離大于0.05，ORF2基因核苷酸同源性小于93%，可定義為變異株，因此有學(xué)者將SCCD株和AHDY株定義為鵝星狀病毒FLX株的變異株[11]。

2016年以來(lái)，中國(guó)主要養(yǎng)鵝地區(qū)陸續(xù)暴發(fā)一種以雛鵝腎炎和內(nèi)臟、關(guān)節(jié)痛風(fēng)為主要特征的急性傳染病，死亡率為20.0%～50.0%，給中國(guó)養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1.2×109～1.5×109元[12]。多位研究者從具有痛風(fēng)癥狀的雛鵝體內(nèi)分離到一種新的星狀病毒，包括GD、AHQJ18、SDPY、JSHA、CXZ18和SD01等毒株[13-18]?；蛐蛄蟹治鼋Y(jié)果表明，這些從具有痛風(fēng)癥狀的雛鵝體內(nèi)分離到的鵝星狀病毒與禽星狀病毒屬其他代表性毒株的基因組核苷酸同源性為46.5%～62.0%，與ORF2基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的同源性僅為27.3%～57.0%，遺傳距離較遠(yuǎn)。與引起腸炎的鵝星狀病毒FLX株相比，引起痛風(fēng)癥狀的鵝星狀病毒ORF2基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸相似性為40.4%～42.5%，低于同種星狀病毒的劃分標(biāo)準(zhǔn)(75.0%)，是一種新的鵝星狀病毒種，因此許多學(xué)者將引起雛鵝痛風(fēng)的鵝星狀病毒定義為新型鵝星狀病毒。也有學(xué)者將這2種鵝星狀病毒分別定義為鵝星狀病毒1(GoAstV1)和鵝星狀病毒2(GoAstV2)[19]，或者是鵝星狀病毒G-I群和鵝星狀病毒G-II群[20]。目前對(duì)這2種鵝星狀病毒還未有統(tǒng)一的命名方式，本文暫時(shí)將引起鵝腸炎的毒株稱為鵝星狀病毒變異株，將引起雛鵝痛風(fēng)的毒株稱為新型鵝星狀病毒。

張玉杰等[11]對(duì)臨床采集的典型雛鵝痛風(fēng)樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)約有94.03%的樣品為鵝星狀病毒變異株和新型鵝星狀病毒混合感染，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明2種鵝星狀病毒混合感染引起的痛風(fēng)癥狀及死亡率要高于單獨(dú)感染組。本實(shí)驗(yàn)室在前期流行病學(xué)調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)，發(fā)生雛鵝痛風(fēng)的鵝群中，可從部分泄殖腔拭子中同時(shí)檢測(cè)出2種鵝星狀病毒[21]。這些結(jié)果表明，臨床上存在鵝星狀病毒變異株和新型鵝星狀病毒混合感染的情況，這2種鵝星狀病毒在雛鵝痛風(fēng)中發(fā)揮的作用及致病機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。目前還未有同時(shí)鑒別區(qū)分2種鵝星狀病毒感染的診斷方法。傳統(tǒng)的病原分離鑒定存在耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)人員設(shè)備要求高等缺點(diǎn)。因此，建立一種可同時(shí)快速檢測(cè)2種鵝星狀病毒的方法具有重要的臨床意義。本研究擬根據(jù)新型鵝星狀病毒的ORF2基因和鵝星狀病毒變異株的ORF1a基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法，以期為2種鵝星狀病毒的臨床鑒別診斷，流行病學(xué)調(diào)查以及有效防控雛鵝痛風(fēng)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞

新型鵝星狀病毒(nGoAstV) AHQJ18株、鵝星狀病毒變異株(vGoAstV) 33-3株、坦布蘇病毒(TMUV)、鵝細(xì)小病毒(GPV)、鵝副黏病毒(GPMV)、H9N2亞型禽流感病毒(AIV)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門菌(Salmonella)和雞肝癌細(xì)胞系(LMH)等由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 試劑

pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ購(gòu)自寶生物工程(大連) 有限公司；DNA/RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、小量提取質(zhì)粒試劑盒等購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)( 杭州) 有限公司；一步法RT-PCR試劑盒、DNA Marker等購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank收錄的新型鵝星狀病毒ORF2基因和鵝星狀病毒變異株ORF1a基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，引物信息見(jiàn)表1。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4 新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株單一RT-PCR擴(kuò)增

分別取200 μl新型鵝星狀病毒陽(yáng)性LMH細(xì)胞培養(yǎng)物和鵝星狀病毒變異株陽(yáng)性鵝胚尿囊液，用RNA提取試劑盒提取病毒核酸，利用新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的特異性引物，分別進(jìn)行單一的一步法RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×一步法反應(yīng)緩沖液12.50 μl，酶混合物 1.25 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1.00 μl， RNA模板 2.00 μl，ddH2O補(bǔ)足至25.00 μl，混勻。新型鵝星狀病毒的反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 反轉(zhuǎn)錄 30 min；94 ℃ 預(yù)變性 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。鵝星狀病毒變異株的反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 反轉(zhuǎn)錄 30 min；94 ℃ 預(yù)變性 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用膠回收試劑盒分別回收上述RT-PCR擴(kuò)增條帶，克隆至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定。陽(yáng)性質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。提取序列正確的重組質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)量濃度并計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6 一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及反應(yīng)條件優(yōu)化

將新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株陽(yáng)性培養(yǎng)物等量混合后提取RNA作為模板，建立一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法。固定反應(yīng)體系中其他組分不變，單一改變引物用量來(lái)確定最適的引物濃度。引物nGoAstV-F、nGoAstV-R和vGoAstV-F、vGoAstV-R的濃度均為10 μmol/L，加入量設(shè)0.1 μl、0.3 μl、0.5 μl、0.7 μl、0.9 μl 5個(gè)梯度。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 反轉(zhuǎn)錄 30 min；94 ℃ 預(yù)變性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

選擇上述篩選的最佳引物用量，單一改變退火溫度，設(shè)置52.0 ℃、53.0 ℃、54.0 ℃、55.2 ℃、56.4 ℃、57.6℃、58.8 ℃和60.0 ℃ 8個(gè)梯度退火溫度，進(jìn)行一步法雙重RT-PCR擴(kuò)增，確定最佳退火溫度。

1.7 一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)

用上述優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件，分別檢測(cè)新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株單一和混合樣品，以及坦布蘇病毒、鵝細(xì)小病毒、鵝副黏病毒、H9N2亞型禽流感病毒、大腸桿菌和沙門菌單一樣品，同時(shí)設(shè)置生理鹽水為陰性對(duì)照，用建立的一步法雙重RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，檢驗(yàn)該方法的特異性。

1.8 一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)

將構(gòu)建好的新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等體積混合，用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋，取1×10-2～1×10-109個(gè)稀釋度各2 μl混合質(zhì)粒作為模板進(jìn)行一步法雙重RT-PCR擴(kuò)增，以檢驗(yàn)該方法的敏感性。

1.9 一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)3份新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株均為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，以檢驗(yàn)該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)2020年江蘇地區(qū)124份21日齡內(nèi)揚(yáng)州白鵝泄殖腔拭子樣本分別用本研究建立的單一和雙重RT-PCR方法檢測(cè)其中的新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株，以評(píng)價(jià)該一步法雙重RT- PCR檢測(cè)方法的臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一RT-PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

以提取的新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株RNA為模板，利用引物nGoAstV-F/R和vGoAstV-F/R分別進(jìn)行單一的一步法RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，新型鵝星狀病毒目的基因片段大小為658 bp，鵝星狀病毒變異株目的基因片段大小為381 bp，與預(yù)期片段大小相符。

將2個(gè)目的基因片段分別回收純化后連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5αE.coli，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，酶切片段與預(yù)期大小相符(圖2)。測(cè)序后經(jīng)NCBI BLAST比較分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)目的基因片段與新型鵝星狀病毒(GenBank登錄號(hào)：MF772821.1)和鵝星狀病毒變異株(GenBank登錄號(hào)：MH410610.1)的同源性分別為98.2%和97.6%，表明陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建成功。用超微量分光光度計(jì)測(cè)定pMD19T-nGoAstV和pMD19T-vGoAstV的質(zhì)量濃度，其質(zhì)量濃度分別為62.83 ng/μl和57.40 ng/μl，計(jì)算其拷貝數(shù)分別為1 μl 1.71×1010拷貝和1 μl 1.70×1010拷貝。

M：DL2 000 DNA marker；1：新型鵝星狀病毒；2：陰性對(duì)照；3：鵝星狀病毒變異株；4：陰性對(duì)照。圖1 新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株單一RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 The single RT-PCR amplification of novel goose astrovirus and variant of goose astrovirus

M：DL5 000 DNA marker；1：新型鵝星狀病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD19T-nGoAstV酶切鑒定； 2：鵝星狀病毒變異株質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD19T-vGoAstV酶切鑒定。圖2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的酶切鑒定Fig.2 Identification of standard recombinant plasmids digested by Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ

2.2 一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及反應(yīng)條件優(yōu)化

將新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株陽(yáng)性培養(yǎng)物等量混合后提取RNA作為模板，用引物nGoAstV-F/R和vGoAstV-F/R進(jìn)行一步法雙重RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，可同時(shí)擴(kuò)增出658 bp和381 bp 2個(gè)條帶，與單一RT-PCR擴(kuò)增條帶大小相同，陰性對(duì)照未擴(kuò)增出任何條帶(圖3)。

固定其他條件不變，對(duì)加入的引物nGoAstV-F/R和vGoAstV-F/R設(shè)置0.1 μl、0.3 μl、0.5 μl、0.7 μl和0.9 μl 5個(gè)梯度，進(jìn)行一步法雙重RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，當(dāng)2對(duì)上、下游引物(10 μmol/L)各加入0.5 μl時(shí)即可獲得較高的擴(kuò)增效率，因此確定引物最適用量為0.5 μl(圖4)。

固定其他反應(yīng)條件不變，2對(duì)引物用量均為0.5 μl，在RT-PCR擴(kuò)增時(shí)設(shè)置52.0 ℃、53.0 ℃、54.0 ℃、55.2 ℃、56.4 ℃、57.6℃、58.8 ℃和60.0 ℃ 8個(gè)退火溫度梯度，結(jié)果顯示，退火溫度為57.6 ℃及以下時(shí)，目的條帶均較亮，最終確定 57.6 ℃為最佳退火溫度(圖5)。

M：DL2 000 DNA marker；1：新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株一步法雙重RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照。圖3 新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株一步法雙重RT-PCR擴(kuò)增Fig.3 The one-step duplex RT-PCR amplification of novel goose astrovirus and variant of goose astrovirus

M：DL2 000 DNA marker；1～5：引物用量依次為0.1 μl、0.3 μl、0.5 μl、0.7 μl、0.9 μl。圖4 一步法雙重RT-PCR引物用量的優(yōu)化Fig.4 Optimization of primer dosage for the one-step duplex RT-PCR

M：DL2 000 DNA marker；1～8：退火溫度依次為52.0 ℃、53.0 ℃、54.0 ℃、55.2 ℃、56.4 ℃、57.6℃、58.8 ℃和60.0 ℃。圖5 一步法雙重RT-PCR退火溫度的優(yōu)化Fig.5 Optimization of annealing temperature for the one-step duplex RT-PCR

2.3 一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)

應(yīng)用優(yōu)化的一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法分別對(duì)新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株單一和混合陽(yáng)性樣品以及坦布蘇病毒、鵝細(xì)小病毒、鵝副黏病毒、H9N2亞型禽流感病毒、大腸桿菌和沙門菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖6)顯示，2種鵝星狀病毒的單一樣品和混合樣品均能擴(kuò)增出與預(yù)期一致的特異性條帶，而其他病原菌均未擴(kuò)增出特異性條帶，說(shuō)明該方法具有較高的特異性。

M：DL2 000 DNA marker；1：新型鵝星狀病毒；2：鵝星狀病毒變異株；3：新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株；4：坦布蘇病毒；5:鵝細(xì)小病毒；6：鵝副黏病毒；7： H9N2亞型禽流感病毒；8：大腸桿菌；9：沙門菌；10：陰性對(duì)照。圖6 一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)Fig.6 Specificity test of the one-step duplex RT-PCR detection method

2.4 一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)

將新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等體積混合后進(jìn)行10倍梯度稀釋，取1×10-2～1×10-109個(gè)稀釋度各2 μl混合質(zhì)粒為模板，用建立的一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果(圖7)顯示，當(dāng)混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1×10-7時(shí)仍能同時(shí)檢測(cè)出2種鵝星狀病毒的特異性條帶，即對(duì)新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的最低檢出量分別為1 μl 1.71×103拷貝和1 μl 1.70×103拷貝，表明該方法具有良好的敏感性。

M：DL2 000 DNA marker；1～9：新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度分別為10-2～10-10；10：陰性對(duì)照。圖7 一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)Fig.7 Sensitivity test of the one-step duplex RT-PCR detection method

2.5 一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)3份新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株均為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，均能同時(shí)擴(kuò)增出2種鵝星狀病毒的特異性條帶(圖8)，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

M：DL2 000 DNA marker；1～3、5～7、9～11：3份新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株均為陽(yáng)性樣品的3次重復(fù)性檢測(cè)；4、8、12：陰性對(duì)照。圖8 一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)Fig.8 Repeatability test of the one-step duplex RT-PCR detection method

2.6 臨床樣品的檢測(cè)

用本研究建立的單一和一步法雙重RT-PCR方法分別對(duì)2020年江蘇地區(qū)124份21日齡內(nèi)揚(yáng)州白鵝泄殖腔拭子樣本中的2種鵝星狀病毒進(jìn)行檢測(cè)。在124份雛鵝泄殖腔拭子樣本中，新型鵝星狀病毒陽(yáng)性樣本56份，陽(yáng)性率為45.16%；鵝星狀病毒變異株陽(yáng)性樣本35份，陽(yáng)性率為28.23%；2種鵝星狀病毒均為陽(yáng)性的樣本14份，陽(yáng)性率為11.29%。檢測(cè)結(jié)果與單一RT-PCR方法結(jié)果一致，符合率為100.00%。表明本研究建立的一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法可以對(duì)臨床樣品中的2種鵝星狀病毒進(jìn)行鑒別診斷。

3 討論

2016年以來(lái)，中國(guó)主要養(yǎng)鵝地區(qū)陸續(xù)暴發(fā)一種以腎炎、痛風(fēng)為主要特征的傳染病，對(duì)中國(guó)養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病主要影響21日齡以內(nèi)的雛鵝，患病雛鵝食欲減退、精神沉郁、腹瀉，死亡率高達(dá)50%。剖檢可見(jiàn)多個(gè)內(nèi)臟器官表面及關(guān)節(jié)內(nèi)有白色尿酸鹽樣滲出物，膽囊腫大，內(nèi)有尿酸鹽沉積，腎臟腫脹，輸尿管內(nèi)有白色尿酸鹽樣沉積物。國(guó)內(nèi)多位學(xué)者從具有痛風(fēng)癥狀的雛鵝體內(nèi)分離到一種新的星狀病毒[13-18]，基因序列分析結(jié)果表明，這些鵝星狀病毒與禽星狀病毒屬其他代表性毒株的基因組核苷酸同源性較低，遺傳距離較遠(yuǎn)，是一種新的鵝星狀病毒種，因此許多學(xué)者將引起雛鵝痛風(fēng)的鵝星狀病毒定義為新型鵝星狀病毒。

Zhang等[10]從具有腸炎癥狀的雛鵝體內(nèi)鑒定出1株鵝源星狀病毒FLX株。之后有學(xué)者從臨床鵝群中分離到與新型鵝星狀病毒不同的鵝源星狀病毒。遺傳序列分析結(jié)果表明，這些鵝源星狀病毒與鵝星狀病毒FLX株為同一星狀病毒種，但存在一定的遺傳距離，可定義為變異株，本文暫時(shí)稱為鵝星狀病毒變異株。鵝星狀病毒變異株與新型鵝星狀病毒的ORF2基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸同源性為40.4%～42.5%，低于同種星狀病毒的劃分標(biāo)準(zhǔn)75.0%，是2種不同的星狀病毒種。有文獻(xiàn)報(bào)道，在臨床發(fā)生痛風(fēng)癥狀的鵝群內(nèi)存在2種鵝星狀病毒混合感染的情況，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，2種鵝星狀病毒混合感染引起的痛風(fēng)癥狀及死亡率要高于單獨(dú)感染組[11,21]。但這2種鵝星狀病毒在雛鵝痛風(fēng)中發(fā)揮的具體作用及致病機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于2種鵝星狀病毒的研究均處于初期階段[22-23]，僅有單獨(dú)檢測(cè)新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的RT-PCR方法或?qū)崟r(shí)熒光定量RT-PCR方法[24-25]，還沒(méi)有同時(shí)鑒別區(qū)分2種鵝星狀病毒感染的診斷方法。因此，本研究建立了一種一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法，可以同時(shí)、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)這2種鵝星狀病毒，具有重要的臨床意義。

傳統(tǒng)的病原分離鑒定存在耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)人員設(shè)備要求高等缺點(diǎn)。RT-PCR技術(shù)是一種比較成熟的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，而且擴(kuò)增出的特異性片段可以進(jìn)行基因測(cè)序，進(jìn)一步進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。2種鵝星狀病毒均為RNA病毒，檢測(cè)時(shí)需先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本研究采用一步法RT-PCR方法，減少了操作步驟，降低了樣本被污染的風(fēng)險(xiǎn)，提高了檢測(cè)效率。

本研究根據(jù)新型鵝星狀病毒的ORF2基因和鵝星狀病毒變異株的ORF1a基因的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)了特異性引物，并對(duì)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳引物使用量和退火溫度，首次建立了針對(duì)這2種鵝星狀病毒的一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法。該方法可在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增出新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的2個(gè)特異性條帶，對(duì)其他鵝常見(jiàn)病毒性和細(xì)菌性病原的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，具有較高的特異性。本研究建立的一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的最低檢測(cè)量分別是1 μl 1.71×103拷貝和1 μl 1.70×103拷貝，具有良好的敏感性，同時(shí)具有較好的重復(fù)性。應(yīng)用已建立的一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床采集的雛鵝泄殖腔拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，124份雛鵝泄殖腔拭子中新型鵝星狀病毒陽(yáng)性率為45.16%，鵝星狀病毒變異株陽(yáng)性率為28.23%，2種鵝星狀病毒均為陽(yáng)性的占11.29%，證實(shí)臨床上鵝群中確實(shí)存在2種鵝星狀病毒混合感染的情況。檢測(cè)結(jié)果與單一RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為100.00%。

本研究建立的檢測(cè)新型鵝星狀病毒和鵝星狀病毒變異株的一步法雙重RT-PCR檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以快速高效地檢測(cè)出2種鵝星狀病毒，為上述2種病毒病的流行病學(xué)調(diào)查和臨床早期鑒別診斷提供技術(shù)支持，對(duì)2種鵝星狀病毒病的病原監(jiān)測(cè)和有效防控以及混合感染的致病性研究具有重要意義。