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    豬偽狂犬病病毒糖蛋白gD在谷氨酸棒桿菌中的表達及優(yōu)化

    2022-02-06 02:07:14惠萌萌孫曼曼劉秀霞楊艷坤白仲虎
    江蘇農(nóng)業(yè)學報 2022年6期
    關(guān)鍵詞:生長分析

    惠萌萌, 孫曼曼, 劉秀霞,2,3, 楊艷坤,2,3, 白仲虎,2,3

    (1.江南大學糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇無錫214122;2.江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫214122;3.江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心,江蘇無錫214122)

    偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是一種由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的傳染性、病毒性疾病,宿主范圍廣,可引起多種家畜、家禽以及野生動物共患,屬α皰疹病毒亞科[1]。PRV在豬群中呈暴發(fā)性流行,臨床癥狀包括豬的生長遲緩和呼吸困難、母豬流產(chǎn)和種豬不孕,大都呈致死性感染,對全世界養(yǎng)豬業(yè)危害極大[2-3]。自1914年以來,基于臨床癥狀、動物接觸史或血清抗體檢測結(jié)果,偶有關(guān)于人類感染PRV的爭議性報道[4-5]。2019年,Wang等[6]報道了4例人急性腦炎病例,均由偽狂犬病病毒感染引起,首次提供了PRV向人群跨種傳播的病毒分離證據(jù)。研究結(jié)果表明,PRV基因組由線性雙股DNA組成,大約長150 kb,具獨特長區(qū)段(UL)和短區(qū)段(US),位于UL區(qū)的主要編碼蛋白質(zhì)有g(shù)B、gC、gH、TK等,位于US區(qū)的主要編碼蛋白質(zhì)有g(shù)D、gE、gG、gI和gL等。gC、TK和gE是PRV主要毒力蛋白質(zhì),gB、gD和gH是病毒復(fù)制的必需蛋白質(zhì)[7]。目前已發(fā)現(xiàn)的11種PRV糖蛋白中,gB、gC、gD均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體,其單克隆抗體在體內(nèi)、體外均能中和PRV,是制造亞單位疫苗的首選蛋白質(zhì)。gD,又稱gp50,開放閱讀框由1 206個堿基組成,蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為4.5×104,是成熟PRV表面的主要囊膜糖蛋白,參與病毒的穿透過程;gD作為必需的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),在PRV侵入宿主細胞時的感染和增殖過程中具有重要作用[8]。研究結(jié)果表明,不同毒株間gD的DNA水平和蛋白質(zhì)水平的同源性都非常高,說明gD在遺傳過程中是高度保守的。

    基因工程亞單位疫苗是指將病原的保護性抗原編碼基因在原核或真核細胞中表達,再將基因產(chǎn)物制成疫苗,其優(yōu)點是:安全性高,接種后不會引起機體急性感染;穩(wěn)定性好,便于輸送和貯存;可與野毒感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答區(qū)分,利于疫病的控制與根除[9-11]。Marchioli等[12]篩選出一株表達gD的細胞株,免疫豬后能產(chǎn)生中和性抗體并抵抗PRV的強毒攻擊。作為PRV最重要的保護性抗原,gD在刺激動物機體后,可以產(chǎn)生中和抗體[13],是PRV亞單位疫苗的主要候選蛋白質(zhì),在PRV的免疫防控中意義重大[14-15]。為進一步加強對PR的疫情監(jiān)測和流行病學調(diào)查,gD還可作為理想的血清學檢測用抗原。

    谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種典型高GC含量的革蘭氏陽性菌[16],被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認證為安全菌株(Generally recognized as safe,GRAS),具有無內(nèi)毒素、胞外蛋白酶含量少[17]、可高密度發(fā)酵且易于分泌[18-21]等優(yōu)良特性,是目前工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的優(yōu)越表達系統(tǒng)[22-23]。

    PRV蛋白的表達有一定的難度,構(gòu)建的表達載體往往不能表達,其主要原因可能是PRV蛋白與工程菌的兼容性不好,現(xiàn)有的研究多用病毒或真核載體表達,在大腸桿菌中以包涵體形式表達[24-25],尚未有在谷氨酸棒桿菌中表達生產(chǎn)gD的研究報道。本研究擬在谷氨酸棒桿菌中進行g(shù)D的可溶性表達,通過Western Blot和酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)法檢測gD蛋白的表達和抗原活性,并優(yōu)化發(fā)酵條件以提高產(chǎn)量,為進一步研制PRV亞單位疫苗提供一種可用的表達體系,也為PRV免疫學檢測方法提供理論和技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 本研究所用的菌株見表1。大腸桿菌用于構(gòu)建質(zhì)粒,谷氨酸棒桿菌用于表達重組蛋白質(zhì),均由本實驗室保存。

    1.1.2 質(zhì)粒 本研究所用的質(zhì)粒見表2。質(zhì)粒pXMJ19用作谷氨酸棒桿菌外源蛋白質(zhì)表達載體,由本實驗室保存。

    1.2 方法

    1.2.1 培養(yǎng)條件 大腸桿菌培養(yǎng)條件:LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,蒸餾水定容),37 ℃,220 r/min。谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)條件:LBB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,腦心浸出液10 g/L,蒸餾水定容),30 ℃,220 r/min。大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)體系中使用的氯霉素質(zhì)量濃度分別為30 μg/ml和20 μg/ml。

    1.2.2gD表達質(zhì)粒的構(gòu)建 從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)官網(wǎng)上獲取gD的氨基酸序列(GenBank:ABR13825.1),對其編碼序列進行密碼子優(yōu)化(參考CorynebacteriumglutamicumATCC13032)?;蚝铣捎商K州安升達生物科技有限公司完成,添加5′(Hind Ⅲ)和3′(EcoR Ⅰ)。將基因通過5′(Hind Ⅲ)和3′(EcoR Ⅰ)酶切連接克隆至表達載體pXMJ19,獲得重組基因表達質(zhì)粒pXMJ19-gD。

    1.2.3 gD表達菌株的構(gòu)建 將構(gòu)建好的質(zhì)粒pXMJ19-gD電擊轉(zhuǎn)化C.glutamicum獲得表達菌株Cg-gD,30 ℃培養(yǎng)36 h,對長出的單菌落進行PCR和測序驗證。為更好地反映gD的表達情況,同時構(gòu)建Cg-pXMJ19作為空白對照。

    表1 本研究所用菌株

    表2 本研究所用質(zhì)粒

    1.2.4gD的誘導(dǎo)表達 Cg-gD和Cg-pXMJ19分別接種于10 ml氯霉素抗性LBB培養(yǎng)基中,在30 ℃、220 r/min條件下過夜培養(yǎng),之后以2%接種量轉(zhuǎn)接到50 ml新鮮的氯霉素抗性LBB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)3~5 h(OD600=0.6~0.8)時添加1‰(質(zhì)量體積比)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)(100 mmol/L IPTG),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集菌體進行蛋白質(zhì)分析。

    1.2.5 生長曲線的測定 將蛋白質(zhì)表達菌株接種于10 ml氯霉素抗性LBB培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min條件下過夜培養(yǎng),轉(zhuǎn)接至100 ml新鮮的LBB培養(yǎng)基中,使初始OD600=0.2。30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)48 h,每4 h取1次樣并測定OD600。

    1.2.6 蛋白質(zhì)表達鑒定 取gD發(fā)酵產(chǎn)物(定量OD600=10)在12 000 r/min離心,棄上清液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗菌體2次,并用PBS重懸菌體,破碎,取全菌液、上清液和沉淀(用PBS重懸)制成相應(yīng)蛋白質(zhì)樣品,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析。使用組氨酸(His)單抗進行Western Blot定性分析。純化后使用ELISA法進行蛋白質(zhì)檢測,封閉液用5%牛血清白蛋白(BSA),一抗用gD陽性血清,二抗用辣根過氧化物羊抗豬IgG。ELISA方法:將純化液按一定梯度進行稀釋后,每孔100 μl,37 ℃、1 h孵育至酶標板上,用洗液清洗5次后甩干;按1∶800的體積比每孔100 μl繼續(xù)孵育一抗試劑,37 ℃,1 h,用洗液清洗5次后甩干;按1∶2 000的體積比每孔加入100 μl繼續(xù)孵育二抗試劑,37 ℃,1 h,用洗液清洗5次后甩干;每孔加入200 μl顯色液,37 ℃,1 h;最后每孔加入50 μl終止液,觀察顏色反應(yīng)或檢測OD450值。

    1.2.7 蛋白質(zhì)純化及定量分析 取50 ml發(fā)酵液,收集菌體沉淀,用50 ml結(jié)合液(Binding buffer)重懸,并進行高壓勻漿破碎,于12 000 r/min、4 ℃離心30 min,收集上清液,用鎳離子親和層析柱進行目標蛋白質(zhì)的純化,用不同濃度洗脫液(Elution buffer)梯度洗脫目標蛋白質(zhì)。結(jié)合液:Na2HPO4·12 H2O 5.8 g/L,NaH2PO4·2H2O 0.593 g/L,NaCl 29.22 g/L,用蒸餾水定容;洗脫液:Na2HPO4·12H2O 5.8 g/L,NaH2PO4·2H2O 0.593 g/L,NaCl 29.22 g/L,咪唑34 g/L,用蒸餾水定容。使用BCA試劑盒法進行蛋白質(zhì)定量分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 表達gD的菌株構(gòu)建與驗證

    為獲得表達gD的谷氨酸棒桿菌,首先構(gòu)建質(zhì)粒pXMJ19-gD,質(zhì)粒圖譜如圖1a所示,載體質(zhì)粒pXMJ19酶切結(jié)果如圖1b所示。為觀察谷氨酸棒桿菌表達gD對菌株生長的影響,對Cg-gD和Cg-pXMJ19進行了生長曲線測定,結(jié)果顯示,表達gD的菌株前期生長稍顯緩慢,對菌株生長的影響較小(圖1c)。Cg-gD發(fā)酵24 h后,取樣進行蛋白質(zhì)表達分析,Western Blot分析結(jié)果如圖1d所示,在相對分子質(zhì)量4.5×104處有明顯條帶,與gD理論大小相符,且基本為可溶性表達,但在1.7×104處有降解,SDS-PAGE條帶較淺,表明表達量較低。

    a:pXMJ19-gD的質(zhì)粒圖譜;b:pXMJ19載體酶切結(jié)果,M為10 000 marker,L1~L3為生物學平行樣本;c:Cg-pXMJ19和Cg-gD 菌株48 h生長曲線;d:十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析結(jié)果,M為蛋白質(zhì)marker,1~3分別為Cg-pXMJ19發(fā)酵全菌、破碎后上清液、沉淀,4~6分別為Cg-gD發(fā)酵全菌、破碎后上清液、沉淀。圖1 質(zhì)粒pXMJ19-gD的構(gòu)建與目的蛋白質(zhì)分析Fig.1 Construction of plasmid pXMJ19-gD and analysis of target protein

    2.2 gD表達元件優(yōu)化

    為進一步提高gD的表達量,對表達元件啟動子和信號肽進行了優(yōu)化。由于C.glutamicum中組成型啟動子更有利于外源蛋白質(zhì)的表達[26],因此分別選用組成型H36啟動子(圖2a)、cspB和0949信號肽對gD的表達進行優(yōu)化(圖3a)。

    為構(gòu)建組成型表達質(zhì)粒H36-gD,對pXMJ19-gD質(zhì)粒進行Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切,凝膠回收后獲得含目的基因的載體,H36序列(300 bp)使用引物H36-F+H36-R擴增獲得,載體和片段以1∶3濃度比例進行同源重組,轉(zhuǎn)化E.coliJM109并測序驗證。用相同方法構(gòu)建對照質(zhì)粒H36-pXMJ19。將菌落PCR和測序正確的H36-gD電轉(zhuǎn)入C.glutamicum進行發(fā)酵表達。SDS-PAGE和Western Blot分析結(jié)果如圖2所示,可見組成型質(zhì)粒H36-gD的蛋白質(zhì)表達條帶顏色深,灰度分析結(jié)果顯示,其蛋白質(zhì)表達量比誘導(dǎo)型質(zhì)粒pXMJ19-gD的蛋白質(zhì)表達量高4.5倍。

    a:H36-gD構(gòu)建示意;b:Cg-H36-gD菌株P(guān)CR驗證,M為2000 marker,1~6平行樣品;c:十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析結(jié)果,M為蛋白質(zhì)marker,1為Cg-pXMJ19破碎后上清液,2為Cg-gD破碎后上清液,3為Cg-H36-gD破碎后上清液。圖2 組成型表達質(zhì)粒H36-gD的構(gòu)建與目的蛋白質(zhì)分析Fig.2 Construction of constitutive expression plasmid H36-gD and analysis of target protein

    為了研究分泌表達對gD表達量的影響,分別增加cspB和0949 2種信號肽構(gòu)建分泌型表達質(zhì)粒cspB-gD和0949-gD。以pXMJ19-gD質(zhì)粒為模板,使用引物cspB-F+sp-R、cspB-R+sp-F擴增片段,凝膠回收后兩片段以1∶1濃度比例進行同源重組,轉(zhuǎn)化E.coliJM109并測序驗證,獲得cspB-gD。cspB-pXMJ19的構(gòu)建模板為pXMJ19。以pXMJ19-gD質(zhì)粒為模板,使用引物gD-F+ gD-R擴增載體,0949-F+0949-R直接引物退火,延伸獲得片段,載體和片段以1∶3濃度比例進行同源重組,轉(zhuǎn)化JM109并測序驗證,獲得0949-gD。0949-pXMJ19的構(gòu)建模板為pXMJ19。長出的轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR和測序來驗證,用測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化C.glutamicum進行發(fā)酵誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果(圖3)顯示,在相對分子質(zhì)量4.5×104處無條帶,這表明增加信號肽序列,gD在谷氨酸棒桿菌中反而不表達,猜測是因為蛋白質(zhì)自身特性,在添加信號肽后不能正確折疊導(dǎo)致無法表達。

    a:質(zhì)粒cspB-gD和0949-gD構(gòu)建示意;b:十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析結(jié)果,M為蛋白質(zhì)marker,1~3分別為Cg-pXMJ19發(fā)酵液上清液、全菌、細胞破碎后上清液,4~7分別為Cg-cspB-gD發(fā)酵液上清液、全菌、細胞破碎后上清液、細胞破碎后沉淀,8~11分別為Cg-0949-gD發(fā)酵液上清液、全菌、細胞破碎后上清液、細胞破碎后沉淀。圖3 糖蛋白gD分泌系統(tǒng)的構(gòu)建與目的蛋白質(zhì)分析Fig.3 Construction of glycoprotein gD secretion system and analysis of target protein

    2.3 gD的表達底盤菌株優(yōu)化

    為了分析不同底盤菌株對gD表達的影響,以提高蛋白質(zhì)表達量,在前期研究基礎(chǔ)上,選取3株底盤菌株(分別為C.glutamicumCGMCC1.15647、蛋白酶敲除菌株Cg-△clpC和Cg-△clpS)進行研究。首先進行生長曲線的測定,結(jié)果如圖4a所示,與對照菌株Cg-pXMJ19相比,表達gD的其他菌株生長都受到不同程度的影響,△clpC -H36-gD長勢最弱。SDS-PAGE和Western Blot分析結(jié)果(圖4b)顯示,Cg-△clpS-gD的蛋白質(zhì)表達條帶最深,經(jīng)灰度分析發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)表達量比組成型表達菌株Cg-H36-gD高2.4倍。由此可見clpS蛋白酶對外源蛋白質(zhì)在C.glutamicum中表達的影響最大。

    a:不同底盤菌株的36 h生長曲線;b:Western Blot分析結(jié)果,M為蛋白質(zhì)marker,1~6均為發(fā)酵后破碎上清液,1為Cg-pXMJ19,2為Cg-H36-gD,3為Cg-△clpS-gD,4為Cg-△clpC-gD,5為Cg-△clpS-H36-gD,6為Cg-△clpC-H36-gD。圖4 gD的表達底盤菌株優(yōu)化Fig.4 Optimization of chasis strain expressing gD

    2.4 gD的表達發(fā)酵條件優(yōu)化

    選取最優(yōu)表達菌株Cg-△clpS-gD進行發(fā)酵條件優(yōu)化,以進一步提高gD的表達量,分別從發(fā)酵溫度和誘導(dǎo)時間進行優(yōu)化。根據(jù)谷氨酸棒桿菌生長特性,選取16 ℃、23 ℃、30 ℃ 3個溫度進行g(shù)D的表達,以Cg-△clpS-pXMJ19作為陰性對照,搖瓶培養(yǎng)24 h后進行SDS-PAGE和Western Blot分析。結(jié)果(圖5a)顯示,30 ℃培養(yǎng)條件下,蛋白質(zhì)條帶最深,16 ℃和23 ℃條件下蛋白質(zhì)條帶較淺,且菌株長勢弱于30 ℃培養(yǎng)條件。這表明對于gD的表達而言,30 ℃不僅有利于菌株生長,還有利于蛋白質(zhì)的表達。為探究誘導(dǎo)時長對gD表達的影響,分別在誘導(dǎo)后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h取樣進行目的蛋白質(zhì)表達量分析。結(jié)果(圖5b)顯示,gD在誘導(dǎo)后24 h才開始明顯表達,且后期增量不明顯,這表明菌株前期主要側(cè)重于生長,在穩(wěn)定期進行外源蛋白質(zhì)表達。

    a:不同溫度發(fā)酵表達gD的SDS-PAGE(上圖)和Western Blot分析結(jié)果(下圖),其中1為Cg-pXMJ19發(fā)酵后破碎上清液,2~4分別為16 ℃、23 ℃、30 ℃下Cg-△clpS-gD發(fā)酵后破碎上清液;b:不同誘導(dǎo)時長發(fā)酵表達gD的SDS-PAGE(上圖)和Western Blot分析結(jié)果(下圖),其中1為Cg-pXMJ19發(fā)酵后破碎上清液,2~7分別為Cg-△clpS-gD發(fā)酵后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h破碎上清液;M:蛋白質(zhì)marker。圖5 不同溫度、誘導(dǎo)時長發(fā)酵表達gD的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blot 分析Fig.5 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blot analysis of gD expression at different fermentation temperatures and induction durations

    2.5 gD的純化及定量分析

    在目的蛋白質(zhì)3′端添加6×His標簽,使用鎳離子親和層析柱對其進行純化分析,結(jié)果表明,使用5%洗脫液即可將目的蛋白質(zhì)洗脫,純化樣品SDS-PAGE結(jié)果如圖6a所示。使用BCA試劑盒對目的蛋白質(zhì)進行定量分析,經(jīng)計算,200 ml搖瓶發(fā)酵液中,菌株Cg-△clpS-gD發(fā)酵后gD質(zhì)量濃度約為517 mg/L。洗脫液蛋白質(zhì)電泳結(jié)果顯示仍有少量雜蛋白質(zhì),且流穿液也含有目的蛋白質(zhì),說明目的蛋白質(zhì)和純化柱結(jié)合得不夠緊密。使用ELISA法檢測純化后的gD,以5% BSA為封閉液,gD抗體陽性血清為一抗、HRP羊抗豬IgG為二抗進行包板試驗,以2.1倍陰性對照值作為陽性結(jié)果的判斷標準,OD450目的蛋白>2.1倍OD450陰性對照,純化后gD呈陽性。以gD抗體陽性血清作單抗孵育,Western Blot結(jié)果(圖6c)顯示,gD有特異性條帶。

    a:△clpS-gD純化后樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果,1為Cg-pXMJ19破碎后上清液,2為△clpS-gD純化流穿液,3~4為純化蛋白質(zhì)樣品;b:BSA質(zhì)量濃度標準曲線;c:OD450值和Western Blot結(jié)果,CK為陰性對照,A1為純化流穿液,A2為純化蛋白質(zhì)樣品。圖6 糖蛋白gD的定量定性檢測Fig.6 Quantitative and qualitative detection of glycoprotein gD

    3 討論

    谷氨酸棒桿菌在表達異源蛋白質(zhì)上具有很大潛力,相較于大腸桿菌表達系統(tǒng),C.glutamicum不含內(nèi)毒素,更適合醫(yī)藥蛋白質(zhì)生產(chǎn);與同為革蘭氏陽性菌的枯草芽孢桿菌相比,C.glutamicum能正確折疊蛋白質(zhì),確保蛋白質(zhì)活性;與真核細胞相比,C.glutamicum生長周期短,培養(yǎng)成本不高,基因操作成熟,可高密度發(fā)酵,有利于異源蛋白質(zhì)的發(fā)酵放大。本研究中,為了在谷氨酸棒桿菌中表達gD,首先進行pXMJ19-gD的構(gòu)建與表達,初步通過SDS-PAGE和Western Blot條帶分析,驗證gD可在谷氨酸棒桿菌中可溶性表達。其次通過表達元件、底盤菌株、發(fā)酵條件等優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)與誘導(dǎo)型表達質(zhì)粒相比,組成型表達質(zhì)粒更有利于gD的表達,蛋白質(zhì)表達量提高了4.5倍;蛋白酶敲除菌株Cg-△clpS誘導(dǎo)表達gD的能力最強,蛋白質(zhì)表達量是組成型的2.5倍。上述研究結(jié)果說明,不同菌株對于不同啟動子的適配能力不同。根據(jù)谷氨酸棒桿菌的生長特性,30 ℃培養(yǎng)、誘導(dǎo)24 h是gD表達的最優(yōu)條件。推測表達gD對宿主菌有一定毒性,所以使宿主菌生長緩慢,生長到一定程度后,延遲表達。最后,通過鎳離子層析柱純化目的蛋白質(zhì),經(jīng)BCA試劑盒檢測,在搖瓶水平200 ml發(fā)酵液中目的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度可達517 mg/L。利用ELISA法檢測目的蛋白質(zhì),OD450值和顯色反應(yīng)均顯示純化后的gD呈陽性。綜上所述,本研究成功構(gòu)建了表達可溶性gD的谷氨酸棒桿菌系統(tǒng),該系統(tǒng)同樣可以用于其他異源蛋白質(zhì)的表達,目前已有用C.glutamicum表達VHH和scFv等異源蛋白質(zhì)的報道。

    本研究中還存在一些需要進一步探索的問題,比如本研究只驗證了蛋白酶單敲除菌株對gD表達的影響,組合敲除的情況有待進一步研究。其次,gD與鎳離子親和層析柱結(jié)合的緊密性也需要進一步研究,以獲得更高純度的目的蛋白質(zhì)。最后,沒有進行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng),優(yōu)化更多的發(fā)酵條件,比如碳源、溶解氧含量等。這些未解決的問題同樣具有重要意義,亟待研究人員進一步探索。

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