豬偽狂犬病病毒糖蛋白gD在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)及優(yōu)化

惠萌萌， 孫曼曼， 劉秀霞,2,3， 楊艷坤,2,3， 白仲虎,2,3

(1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；3.江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇無(wú)錫214122)

偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是一種由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的傳染性、病毒性疾病，宿主范圍廣，可引起多種家畜、家禽以及野生動(dòng)物共患，屬α皰疹病毒亞科[1]。PRV在豬群中呈暴發(fā)性流行，臨床癥狀包括豬的生長(zhǎng)遲緩和呼吸困難、母豬流產(chǎn)和種豬不孕，大都呈致死性感染，對(duì)全世界養(yǎng)豬業(yè)危害極大[2-3]。自1914年以來(lái)，基于臨床癥狀、動(dòng)物接觸史或血清抗體檢測(cè)結(jié)果，偶有關(guān)于人類感染PRV的爭(zhēng)議性報(bào)道[4-5]。2019年，Wang等[6]報(bào)道了4例人急性腦炎病例，均由偽狂犬病病毒感染引起，首次提供了PRV向人群跨種傳播的病毒分離證據(jù)。研究結(jié)果表明，PRV基因組由線性雙股DNA組成，大約長(zhǎng)150 kb，具獨(dú)特長(zhǎng)區(qū)段(UL)和短區(qū)段(US)，位于UL區(qū)的主要編碼蛋白質(zhì)有g(shù)B、gC、gH、TK等，位于US區(qū)的主要編碼蛋白質(zhì)有g(shù)D、gE、gG、gI和gL等。gC、TK和gE是PRV主要毒力蛋白質(zhì)，gB、gD和gH是病毒復(fù)制的必需蛋白質(zhì)[7]。目前已發(fā)現(xiàn)的11種PRV糖蛋白中，gB、gC、gD均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，其單克隆抗體在體內(nèi)、體外均能中和PRV，是制造亞單位疫苗的首選蛋白質(zhì)。gD，又稱gp50，開(kāi)放閱讀框由1 206個(gè)堿基組成，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量約為4.5×104，是成熟PRV表面的主要囊膜糖蛋白，參與病毒的穿透過(guò)程；gD作為必需的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在PRV侵入宿主細(xì)胞時(shí)的感染和增殖過(guò)程中具有重要作用[8]。研究結(jié)果表明，不同毒株間gD的DNA水平和蛋白質(zhì)水平的同源性都非常高，說(shuō)明gD在遺傳過(guò)程中是高度保守的。

基因工程亞單位疫苗是指將病原的保護(hù)性抗原編碼基因在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，再將基因產(chǎn)物制成疫苗，其優(yōu)點(diǎn)是：安全性高，接種后不會(huì)引起機(jī)體急性感染；穩(wěn)定性好，便于輸送和貯存；可與野毒感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答區(qū)分，利于疫病的控制與根除[9-11]。Marchioli等[12]篩選出一株表達(dá)gD的細(xì)胞株，免疫豬后能產(chǎn)生中和性抗體并抵抗PRV的強(qiáng)毒攻擊。作為PRV最重要的保護(hù)性抗原，gD在刺激動(dòng)物機(jī)體后，可以產(chǎn)生中和抗體[13]，是PRV亞單位疫苗的主要候選蛋白質(zhì)，在PRV的免疫防控中意義重大[14-15]。為進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)PR的疫情監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，gD還可作為理想的血清學(xué)檢測(cè)用抗原。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種典型高GC含量的革蘭氏陽(yáng)性菌[16]，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證為安全菌株(Generally recognized as safe，GRAS)，具有無(wú)內(nèi)毒素、胞外蛋白酶含量少[17]、可高密度發(fā)酵且易于分泌[18-21]等優(yōu)良特性，是目前工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的優(yōu)越表達(dá)系統(tǒng)[22-23]。

PRV蛋白的表達(dá)有一定的難度，構(gòu)建的表達(dá)載體往往不能表達(dá)，其主要原因可能是PRV蛋白與工程菌的兼容性不好，現(xiàn)有的研究多用病毒或真核載體表達(dá)，在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)[24-25]，尚未有在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)生產(chǎn)gD的研究報(bào)道。本研究擬在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行g(shù)D的可溶性表達(dá)，通過(guò)Western Blot和酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)gD蛋白的表達(dá)和抗原活性，并優(yōu)化發(fā)酵條件以提高產(chǎn)量，為進(jìn)一步研制PRV亞單位疫苗提供一種可用的表達(dá)體系，也為PRV免疫學(xué)檢測(cè)方法提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究所用的菌株見(jiàn)表1。大腸桿菌用于構(gòu)建質(zhì)粒，谷氨酸棒桿菌用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 質(zhì)粒 本研究所用的質(zhì)粒見(jiàn)表2。質(zhì)粒pXMJ19用作谷氨酸棒桿菌外源蛋白質(zhì)表達(dá)載體，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 大腸桿菌培養(yǎng)條件：LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，蒸餾水定容)，37 ℃，220 r/min。谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)條件：LBB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，腦心浸出液10 g/L，蒸餾水定容)，30 ℃，220 r/min。大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)體系中使用的氯霉素質(zhì)量濃度分別為30 μg/ml和20 μg/ml。

1.2.2gD表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)官網(wǎng)上獲取gD的氨基酸序列(GenBank：ABR13825.1)，對(duì)其編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化(參考CorynebacteriumglutamicumATCC13032)?；蚝铣捎商K州安升達(dá)生物科技有限公司完成，添加5′(Hind Ⅲ)和3′(EcoR Ⅰ)。將基因通過(guò)5′(Hind Ⅲ)和3′(EcoR Ⅰ)酶切連接克隆至表達(dá)載體pXMJ19，獲得重組基因表達(dá)質(zhì)粒pXMJ19-gD。

1.2.3 gD表達(dá)菌株的構(gòu)建 將構(gòu)建好的質(zhì)粒pXMJ19-gD電擊轉(zhuǎn)化C.glutamicum獲得表達(dá)菌株Cg-gD，30 ℃培養(yǎng)36 h，對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證。為更好地反映gD的表達(dá)情況，同時(shí)構(gòu)建Cg-pXMJ19作為空白對(duì)照。

表1 本研究所用菌株

表2 本研究所用質(zhì)粒

1.2.4gD的誘導(dǎo)表達(dá) Cg-gD和Cg-pXMJ19分別接種于10 ml氯霉素抗性LBB培養(yǎng)基中，在30 ℃、220 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)，之后以2%接種量轉(zhuǎn)接到50 ml新鮮的氯霉素抗性LBB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～5 h(OD600=0.6～0.8)時(shí)添加1‰(質(zhì)量體積比)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)(100 mmol/L IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集菌體進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將蛋白質(zhì)表達(dá)菌株接種于10 ml氯霉素抗性LBB培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接至100 ml新鮮的LBB培養(yǎng)基中，使初始OD600=0.2。30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)48 h，每4 h取1次樣并測(cè)定OD600。

1.2.6 蛋白質(zhì)表達(dá)鑒定 取gD發(fā)酵產(chǎn)物(定量OD600=10)在12 000 r/min離心，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗菌體2次，并用PBS重懸菌體，破碎，取全菌液、上清液和沉淀(用PBS重懸)制成相應(yīng)蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析。使用組氨酸(His)單抗進(jìn)行Western Blot定性分析。純化后使用ELISA法進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)，封閉液用5%牛血清白蛋白(BSA)，一抗用gD陽(yáng)性血清，二抗用辣根過(guò)氧化物羊抗豬IgG。ELISA方法：將純化液按一定梯度進(jìn)行稀釋后，每孔100 μl，37 ℃、1 h孵育至酶標(biāo)板上，用洗液清洗5次后甩干；按1∶800的體積比每孔100 μl繼續(xù)孵育一抗試劑，37 ℃，1 h，用洗液清洗5次后甩干；按1∶2 000的體積比每孔加入100 μl繼續(xù)孵育二抗試劑，37 ℃，1 h，用洗液清洗5次后甩干；每孔加入200 μl顯色液，37 ℃，1 h；最后每孔加入50 μl終止液，觀察顏色反應(yīng)或檢測(cè)OD450值。

1.2.7 蛋白質(zhì)純化及定量分析 取50 ml發(fā)酵液，收集菌體沉淀，用50 ml結(jié)合液(Binding buffer)重懸，并進(jìn)行高壓勻漿破碎，于12 000 r/min、4 ℃離心30 min，收集上清液，用鎳離子親和層析柱進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化，用不同濃度洗脫液(Elution buffer)梯度洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)。結(jié)合液：Na2HPO4·12 H2O 5.8 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.593 g/L，NaCl 29.22 g/L，用蒸餾水定容；洗脫液：Na2HPO4·12H2O 5.8 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.593 g/L，NaCl 29.22 g/L，咪唑34 g/L，用蒸餾水定容。使用BCA試劑盒法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)gD的菌株構(gòu)建與驗(yàn)證

為獲得表達(dá)gD的谷氨酸棒桿菌，首先構(gòu)建質(zhì)粒pXMJ19-gD，質(zhì)粒圖譜如圖1a所示，載體質(zhì)粒pXMJ19酶切結(jié)果如圖1b所示。為觀察谷氨酸棒桿菌表達(dá)gD對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，對(duì)Cg-gD和Cg-pXMJ19進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線測(cè)定，結(jié)果顯示，表達(dá)gD的菌株前期生長(zhǎng)稍顯緩慢，對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響較小(圖1c)。Cg-gD發(fā)酵24 h后，取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)分析，Western Blot分析結(jié)果如圖1d所示，在相對(duì)分子質(zhì)量4.5×104處有明顯條帶，與gD理論大小相符，且基本為可溶性表達(dá)，但在1.7×104處有降解，SDS-PAGE條帶較淺，表明表達(dá)量較低。

a：pXMJ19-gD的質(zhì)粒圖譜；b：pXMJ19載體酶切結(jié)果，M為10 000 marker，L1～L3為生物學(xué)平行樣本；c：Cg-pXMJ19和Cg-gD 菌株48 h生長(zhǎng)曲線；d：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析結(jié)果，M為蛋白質(zhì)marker，1～3分別為Cg-pXMJ19發(fā)酵全菌、破碎后上清液、沉淀，4～6分別為Cg-gD發(fā)酵全菌、破碎后上清液、沉淀。圖1 質(zhì)粒pXMJ19-gD的構(gòu)建與目的蛋白質(zhì)分析Fig.1 Construction of plasmid pXMJ19-gD and analysis of target protein

2.2 gD表達(dá)元件優(yōu)化

為進(jìn)一步提高gD的表達(dá)量，對(duì)表達(dá)元件啟動(dòng)子和信號(hào)肽進(jìn)行了優(yōu)化。由于C.glutamicum中組成型啟動(dòng)子更有利于外源蛋白質(zhì)的表達(dá)[26]，因此分別選用組成型H36啟動(dòng)子(圖2a)、cspB和0949信號(hào)肽對(duì)gD的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化(圖3a)。

為構(gòu)建組成型表達(dá)質(zhì)粒H36-gD，對(duì)pXMJ19-gD質(zhì)粒進(jìn)行Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切，凝膠回收后獲得含目的基因的載體，H36序列(300 bp)使用引物H36-F+H36-R擴(kuò)增獲得，載體和片段以1∶3濃度比例進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)化E.coliJM109并測(cè)序驗(yàn)證。用相同方法構(gòu)建對(duì)照質(zhì)粒H36-pXMJ19。將菌落PCR和測(cè)序正確的H36-gD電轉(zhuǎn)入C.glutamicum進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)。SDS-PAGE和Western Blot分析結(jié)果如圖2所示，可見(jiàn)組成型質(zhì)粒H36-gD的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶顏色深，灰度分析結(jié)果顯示，其蛋白質(zhì)表達(dá)量比誘導(dǎo)型質(zhì)粒pXMJ19-gD的蛋白質(zhì)表達(dá)量高4.5倍。

a：H36-gD構(gòu)建示意；b：Cg-H36-gD菌株P(guān)CR驗(yàn)證，M為2000 marker，1～6平行樣品；c：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析結(jié)果，M為蛋白質(zhì)marker，1為Cg-pXMJ19破碎后上清液，2為Cg-gD破碎后上清液，3為Cg-H36-gD破碎后上清液。圖2 組成型表達(dá)質(zhì)粒H36-gD的構(gòu)建與目的蛋白質(zhì)分析Fig.2 Construction of constitutive expression plasmid H36-gD and analysis of target protein

為了研究分泌表達(dá)對(duì)gD表達(dá)量的影響，分別增加cspB和0949 2種信號(hào)肽構(gòu)建分泌型表達(dá)質(zhì)粒cspB-gD和0949-gD。以pXMJ19-gD質(zhì)粒為模板，使用引物cspB-F+sp-R、cspB-R+sp-F擴(kuò)增片段，凝膠回收后兩片段以1∶1濃度比例進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)化E.coliJM109并測(cè)序驗(yàn)證，獲得cspB-gD。cspB-pXMJ19的構(gòu)建模板為pXMJ19。以pXMJ19-gD質(zhì)粒為模板，使用引物gD-F+ gD-R擴(kuò)增載體，0949-F+0949-R直接引物退火，延伸獲得片段，載體和片段以1∶3濃度比例進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)化JM109并測(cè)序驗(yàn)證，獲得0949-gD。0949-pXMJ19的構(gòu)建模板為pXMJ19。長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子通過(guò)菌落PCR和測(cè)序來(lái)驗(yàn)證，用測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化C.glutamicum進(jìn)行發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果(圖3)顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量4.5×104處無(wú)條帶，這表明增加信號(hào)肽序列，gD在谷氨酸棒桿菌中反而不表達(dá)，猜測(cè)是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)自身特性，在添加信號(hào)肽后不能正確折疊導(dǎo)致無(wú)法表達(dá)。

a：質(zhì)粒cspB-gD和0949-gD構(gòu)建示意；b：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析結(jié)果，M為蛋白質(zhì)marker，1～3分別為Cg-pXMJ19發(fā)酵液上清液、全菌、細(xì)胞破碎后上清液，4～7分別為Cg-cspB-gD發(fā)酵液上清液、全菌、細(xì)胞破碎后上清液、細(xì)胞破碎后沉淀，8～11分別為Cg-0949-gD發(fā)酵液上清液、全菌、細(xì)胞破碎后上清液、細(xì)胞破碎后沉淀。圖3 糖蛋白gD分泌系統(tǒng)的構(gòu)建與目的蛋白質(zhì)分析Fig.3 Construction of glycoprotein gD secretion system and analysis of target protein

2.3 gD的表達(dá)底盤菌株優(yōu)化

為了分析不同底盤菌株對(duì)gD表達(dá)的影響，以提高蛋白質(zhì)表達(dá)量，在前期研究基礎(chǔ)上，選取3株底盤菌株(分別為C.glutamicumCGMCC1.15647、蛋白酶敲除菌株Cg-△clpC和Cg-△clpS)進(jìn)行研究。首先進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，結(jié)果如圖4a所示，與對(duì)照菌株Cg-pXMJ19相比，表達(dá)gD的其他菌株生長(zhǎng)都受到不同程度的影響，△clpC -H36-gD長(zhǎng)勢(shì)最弱。SDS-PAGE和Western Blot分析結(jié)果(圖4b)顯示，Cg-△clpS-gD的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶最深，經(jīng)灰度分析發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)表達(dá)量比組成型表達(dá)菌株Cg-H36-gD高2.4倍。由此可見(jiàn)clpS蛋白酶對(duì)外源蛋白質(zhì)在C.glutamicum中表達(dá)的影響最大。

a：不同底盤菌株的36 h生長(zhǎng)曲線；b：Western Blot分析結(jié)果，M為蛋白質(zhì)marker，1～6均為發(fā)酵后破碎上清液，1為Cg-pXMJ19，2為Cg-H36-gD，3為Cg-△clpS-gD，4為Cg-△clpC-gD，5為Cg-△clpS-H36-gD，6為Cg-△clpC-H36-gD。圖4 gD的表達(dá)底盤菌株優(yōu)化Fig.4 Optimization of chasis strain expressing gD

2.4 gD的表達(dá)發(fā)酵條件優(yōu)化

選取最優(yōu)表達(dá)菌株Cg-△clpS-gD進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，以進(jìn)一步提高gD的表達(dá)量，分別從發(fā)酵溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)谷氨酸棒桿菌生長(zhǎng)特性，選取16 ℃、23 ℃、30 ℃ 3個(gè)溫度進(jìn)行g(shù)D的表達(dá)，以Cg-△clpS-pXMJ19作為陰性對(duì)照，搖瓶培養(yǎng)24 h后進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析。結(jié)果(圖5a)顯示，30 ℃培養(yǎng)條件下，蛋白質(zhì)條帶最深，16 ℃和23 ℃條件下蛋白質(zhì)條帶較淺，且菌株長(zhǎng)勢(shì)弱于30 ℃培養(yǎng)條件。這表明對(duì)于gD的表達(dá)而言，30 ℃不僅有利于菌株生長(zhǎng)，還有利于蛋白質(zhì)的表達(dá)。為探究誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)gD表達(dá)的影響，分別在誘導(dǎo)后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h取樣進(jìn)行目的蛋白質(zhì)表達(dá)量分析。結(jié)果(圖5b)顯示，gD在誘導(dǎo)后24 h才開(kāi)始明顯表達(dá)，且后期增量不明顯，這表明菌株前期主要側(cè)重于生長(zhǎng)，在穩(wěn)定期進(jìn)行外源蛋白質(zhì)表達(dá)。

a：不同溫度發(fā)酵表達(dá)gD的SDS-PAGE(上圖)和Western Blot分析結(jié)果(下圖)，其中1為Cg-pXMJ19發(fā)酵后破碎上清液，2～4分別為16 ℃、23 ℃、30 ℃下Cg-△clpS-gD發(fā)酵后破碎上清液；b：不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)發(fā)酵表達(dá)gD的SDS-PAGE(上圖)和Western Blot分析結(jié)果(下圖)，其中1為Cg-pXMJ19發(fā)酵后破碎上清液，2～7分別為Cg-△clpS-gD發(fā)酵后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h破碎上清液；M：蛋白質(zhì)marker。圖5 不同溫度、誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)發(fā)酵表達(dá)gD的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blot 分析Fig.5 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blot analysis of gD expression at different fermentation temperatures and induction durations

2.5 gD的純化及定量分析

在目的蛋白質(zhì)3′端添加6×His標(biāo)簽，使用鎳離子親和層析柱對(duì)其進(jìn)行純化分析，結(jié)果表明，使用5%洗脫液即可將目的蛋白質(zhì)洗脫，純化樣品SDS-PAGE結(jié)果如圖6a所示。使用BCA試劑盒對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，經(jīng)計(jì)算，200 ml搖瓶發(fā)酵液中，菌株Cg-△clpS-gD發(fā)酵后gD質(zhì)量濃度約為517 mg/L。洗脫液蛋白質(zhì)電泳結(jié)果顯示仍有少量雜蛋白質(zhì)，且流穿液也含有目的蛋白質(zhì)，說(shuō)明目的蛋白質(zhì)和純化柱結(jié)合得不夠緊密。使用ELISA法檢測(cè)純化后的gD，以5% BSA為封閉液，gD抗體陽(yáng)性血清為一抗、HRP羊抗豬IgG為二抗進(jìn)行包板試驗(yàn)，以2.1倍陰性對(duì)照值作為陽(yáng)性結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)，OD450目的蛋白>2.1倍OD450陰性對(duì)照，純化后gD呈陽(yáng)性。以gD抗體陽(yáng)性血清作單抗孵育，Western Blot結(jié)果(圖6c)顯示，gD有特異性條帶。

a：△clpS-gD純化后樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果，1為Cg-pXMJ19破碎后上清液，2為△clpS-gD純化流穿液，3～4為純化蛋白質(zhì)樣品；b：BSA質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；c：OD450值和Western Blot結(jié)果，CK為陰性對(duì)照，A1為純化流穿液，A2為純化蛋白質(zhì)樣品。圖6 糖蛋白gD的定量定性檢測(cè)Fig.6 Quantitative and qualitative detection of glycoprotein gD

3 討論

谷氨酸棒桿菌在表達(dá)異源蛋白質(zhì)上具有很大潛力，相較于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，C.glutamicum不含內(nèi)毒素，更適合醫(yī)藥蛋白質(zhì)生產(chǎn)；與同為革蘭氏陽(yáng)性菌的枯草芽孢桿菌相比，C.glutamicum能正確折疊蛋白質(zhì)，確保蛋白質(zhì)活性；與真核細(xì)胞相比，C.glutamicum生長(zhǎng)周期短，培養(yǎng)成本不高，基因操作成熟，可高密度發(fā)酵，有利于異源蛋白質(zhì)的發(fā)酵放大。本研究中，為了在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)gD，首先進(jìn)行pXMJ19-gD的構(gòu)建與表達(dá)，初步通過(guò)SDS-PAGE和Western Blot條帶分析，驗(yàn)證gD可在谷氨酸棒桿菌中可溶性表達(dá)。其次通過(guò)表達(dá)元件、底盤菌株、發(fā)酵條件等優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)與誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒相比，組成型表達(dá)質(zhì)粒更有利于gD的表達(dá)，蛋白質(zhì)表達(dá)量提高了4.5倍；蛋白酶敲除菌株Cg-△clpS誘導(dǎo)表達(dá)gD的能力最強(qiáng)，蛋白質(zhì)表達(dá)量是組成型的2.5倍。上述研究結(jié)果說(shuō)明，不同菌株對(duì)于不同啟動(dòng)子的適配能力不同。根據(jù)谷氨酸棒桿菌的生長(zhǎng)特性，30 ℃培養(yǎng)、誘導(dǎo)24 h是gD表達(dá)的最優(yōu)條件。推測(cè)表達(dá)gD對(duì)宿主菌有一定毒性，所以使宿主菌生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)到一定程度后，延遲表達(dá)。最后，通過(guò)鎳離子層析柱純化目的蛋白質(zhì)，經(jīng)BCA試劑盒檢測(cè)，在搖瓶水平200 ml發(fā)酵液中目的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度可達(dá)517 mg/L。利用ELISA法檢測(cè)目的蛋白質(zhì)，OD450值和顯色反應(yīng)均顯示純化后的gD呈陽(yáng)性。綜上所述，本研究成功構(gòu)建了表達(dá)可溶性gD的谷氨酸棒桿菌系統(tǒng)，該系統(tǒng)同樣可以用于其他異源蛋白質(zhì)的表達(dá)，目前已有用C.glutamicum表達(dá)VHH和scFv等異源蛋白質(zhì)的報(bào)道。

本研究中還存在一些需要進(jìn)一步探索的問(wèn)題，比如本研究只驗(yàn)證了蛋白酶單敲除菌株對(duì)gD表達(dá)的影響，組合敲除的情況有待進(jìn)一步研究。其次，gD與鎳離子親和層析柱結(jié)合的緊密性也需要進(jìn)一步研究，以獲得更高純度的目的蛋白質(zhì)。最后，沒(méi)有進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化更多的發(fā)酵條件，比如碳源、溶解氧含量等。這些未解決的問(wèn)題同樣具有重要意義，亟待研究人員進(jìn)一步探索。