熱應(yīng)激對(duì)豬顆粒細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響

王澤平， 沈 婕， 趙為民， 付言峰， 李碧俠， 任守文， 程金花， 李 輝

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇宿遷223800;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇南京210014;3.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005)

豬的皮膚較厚，皮下脂肪含量高且汗腺不發(fā)達(dá)，故調(diào)節(jié)體溫能力相對(duì)較差。研究結(jié)果表明,豬最適溫度為12～21 ℃[1]，當(dāng)環(huán)境溫度由18 ℃升至29 ℃時(shí)，豬體溫將從34.6 ℃升至37.4 ℃[2]，而直腸溫度將從39.2 ℃升高至40.0 ℃[3]。因此當(dāng)外界氣溫超過27 ℃時(shí)，母豬體溫也將被動(dòng)升高而產(chǎn)生熱應(yīng)激[4]，并對(duì)豬機(jī)體造成不良影響。以母豬為例，當(dāng)受到熱應(yīng)激時(shí)可表現(xiàn)出發(fā)情不明顯、乏情或短促發(fā)情等癥狀,經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶7 d內(nèi)發(fā)情率顯著降低,而后備母豬則表現(xiàn)出初情期推遲等現(xiàn)象[5-6]。夏秋時(shí)節(jié)，中國(guó)大部分地區(qū)的氣溫超過30 ℃，因此母豬受到熱應(yīng)激是夏秋季節(jié)造成中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)受損的重要因素，隨著全球變暖，熱應(yīng)激的影響將更加嚴(yán)重。然而，目前人們對(duì)熱應(yīng)激影響母豬繁殖性能的機(jī)制并不清楚。

顆粒細(xì)胞介于膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間，是體內(nèi)唯一與卵母細(xì)胞直接接觸的體細(xì)胞。它們可以通過分泌類固醇類激素、供給卵母細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、接收并傳遞信號(hào)等方式參與維持卵泡發(fā)育、促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和誘導(dǎo)排卵等過程。顆粒細(xì)胞功能受損將影響動(dòng)物卵泡發(fā)育和繁殖活動(dòng)[7]。養(yǎng)殖過程中，動(dòng)物常常受到一些因素的影響，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞功能紊亂，主要表現(xiàn)在類固醇激素分泌能力下降、細(xì)胞增殖抑制/凋亡、黃體化受阻等[8-10]，其直接后果是抑制動(dòng)物的繁殖性能，最終影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展。遺憾的是，目前關(guān)于熱應(yīng)激直接影響顆粒細(xì)胞的研究相對(duì)較少且大多從單一角度或者在某一點(diǎn)上展開研究，例如，前人研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可抑制顆粒細(xì)胞中促卵泡素受體(FSHR)表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激處理豬顆粒細(xì)胞可顯著抑制雌激素的分泌，造成熱休克蛋白HSP70表達(dá)量上調(diào)[9, 12]?？傮w而言，目前在熱應(yīng)激影響卵泡顆粒細(xì)胞功能方面缺乏系統(tǒng)性、整體性的認(rèn)識(shí)。為解決該問題，本研究擬先解析熱應(yīng)激對(duì)豬顆粒細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將在屠宰場(chǎng)取的豬卵巢，放置于裝有37 ℃生理鹽水(預(yù)先加入1%青霉素/鏈霉素)的保溫瓶中盡快拿回實(shí)驗(yàn)室處理。在實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)中清洗消毒卵巢，擦凈殘留液體后，選取直徑大于5 mm卵泡，用一次性注射器抽取其卵泡液，并利用Ficoll-Paque梯度離心法分離出顆粒細(xì)胞[13]。分離出的細(xì)胞經(jīng)多次清洗后用DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)稀釋后接種于6孔板中，并置于37 ℃，含有5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中持續(xù)靜止培養(yǎng)24 h后，用溫?zé)岬臒oCa2+、Mg2+的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗2～3次，洗掉未貼壁細(xì)胞，更換新的DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)后進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2 熱應(yīng)激處理

將獲得的細(xì)胞隨機(jī)分為2組。一組為對(duì)照組，將細(xì)胞放入37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h；另一組作為熱應(yīng)激組，將細(xì)胞放入41 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。處理結(jié)束后，用溫?zé)岬臒oCa2+、Mg2+的PBS徹底清洗細(xì)胞，確保無培養(yǎng)基殘留，然后將細(xì)胞刮下備用。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 蛋白質(zhì)的提取及定量

收集的細(xì)胞按照蛋白質(zhì)組學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行處理。處理過程簡(jiǎn)述如下：細(xì)胞沉淀先用四乙基溴化銨緩沖溶液(TEAB)溶解；裂解后的初始蛋白質(zhì)溶液經(jīng)超聲破碎后離心并收集上清液，棄掉細(xì)胞碎片。在收集的上清液中加入4倍體積的預(yù)冷丙酮[含有10 mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)]，充分混勻后放置在4 ℃冰箱中靜置2 h，蛋白質(zhì)沉淀逐漸析出后通過離心將蛋白質(zhì)沉淀收集至管底，再用預(yù)冷丙酮(含10 mmol/L的DTT)清洗蛋白質(zhì)沉淀后進(jìn)行干燥。最終用四乙基溴化銨(TEAB)溶解蛋白質(zhì)沉淀，并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。

1.4 蛋白質(zhì)樣品酶解、脫鹽及標(biāo)記

選取一定質(zhì)量的蛋白質(zhì)溶液，調(diào)整體積后用NH4HCO3(50 mmol/L)進(jìn)行稀釋，加入胰蛋白酶溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中酶解過夜。酶解結(jié)束后將酶解液進(jìn)行脫鹽處理；脫鹽后的蛋白質(zhì)按照試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記結(jié)束后在所有標(biāo)記樣本中取相同體積進(jìn)行混合，準(zhǔn)備上機(jī)分離。

1.5 蛋白質(zhì)樣品組分分離及液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測(cè)

將上述混合后的樣本用Thermo DINOEX Ultimate 3000 BioRS分成12個(gè)組分，并利用AB SCIEX nano LC-MS/MS(Triple TOF 5600 plus)對(duì)每個(gè)組分依次進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.6 蛋白質(zhì)的鑒定、差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能注釋和通路分析

以可信度95%為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所得的肽段進(jìn)行篩選，可信度大于95%的肽段用搜索引擎ProteinpilotTMV4.5進(jìn)行搜索。當(dāng)差異表達(dá)倍數(shù)≥1.5倍(即上調(diào)≥1.5倍或下調(diào)≤0.67倍)且P值≤0.05時(shí)，視為顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并利用在線分析系統(tǒng)BLAST2GO (http://www.Blast2GO.com/)對(duì)所有差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能注釋，隨后利用通路數(shù)據(jù)庫KEGG進(jìn)行通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激后豬顆粒細(xì)胞的蛋白質(zhì)總體鑒定情況

利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)對(duì)受熱應(yīng)激處理的豬顆粒細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，共鑒定到5 451個(gè)蛋白質(zhì)。鑒定肽段數(shù)為35 936個(gè)，其中至少包含2個(gè)Unique肽段的蛋白質(zhì)數(shù)為4 448個(gè)。本研究鑒定到的肽段的長(zhǎng)度主要分布在7.00～20.00 aa，其中大多數(shù)肽段的長(zhǎng)度為11.00 aa，平均長(zhǎng)度為14.57 aa，處于肽段長(zhǎng)度合理范圍(圖1A)。對(duì)可信度≥95%的肽段覆蓋度分布的分析結(jié)果顯示，覆蓋度介于0～10.0%的蛋白質(zhì)數(shù)量占總鑒定蛋白質(zhì)數(shù)量的38.49%(圖1B)。

A:肽段長(zhǎng)度分布；B：蛋白質(zhì)鑒定覆蓋度分布。a:0～10.0%; b:10.1%～20.0%; c:20.1%～30.0%; d:30.1%～40.0%; e:40.1%～50.0%; f:50.1%～60.0%; g:60.1%～70.0%; h:70.1%～80.0%; i:80.1%～90.0%; j:90.0%～100.0%。圖1 肽段長(zhǎng)度分布和蛋白質(zhì)覆蓋度Fig.1 Distribution of peptides length and protein sequence coverage

2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析

通過對(duì)熱應(yīng)激處理的豬顆粒細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的分析，共鑒定到289個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)162個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)127個(gè)(部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)見表1和表2)。從表1中可以看出，熱休克蛋白HSP70、HSP90等與熱應(yīng)激相關(guān)的標(biāo)志性蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá)。這些蛋白質(zhì)的上調(diào)表達(dá)也可被視為熱應(yīng)激處理成功的標(biāo)志。同時(shí)，肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶、鈣網(wǎng)蛋白、鈣調(diào)理蛋白等蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá)(表1)。而組蛋白H4、載脂蛋白E、芳香化酶3、雌二醇17β-脫氫酶、三磷酸腺苷合成酶α亞基等蛋白質(zhì)表達(dá)顯著下調(diào)(表2)。

我們進(jìn)一步對(duì)對(duì)照組和熱應(yīng)激組樣品的分析結(jié)果進(jìn)行聚類分析，從圖2可以看出，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間重復(fù)性良好，且差異表達(dá)蛋白質(zhì)的聚類清晰。

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的直系同源簇(COG)注釋

為預(yù)測(cè)和系統(tǒng)了解所鑒定到的蛋白質(zhì)的潛在生物學(xué)功能，我們對(duì)所有鑒定到的蛋白質(zhì)與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比對(duì)分析和分類統(tǒng)計(jì)。圖3是本次鑒定結(jié)果比對(duì)到COG數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO分類和KEGG分析

為解析差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，本研究對(duì)所有的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了注釋。如圖4所示，本研究所鑒定到的差異表達(dá)蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞過程、代謝過程、生物調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)功能的調(diào)控。

表1 部分上調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)

表2 部分下調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)

Ctl：對(duì)照；HS: 熱應(yīng)激。圖2 豬顆粒細(xì)胞受熱應(yīng)激過程中差異表達(dá)蛋白質(zhì)的聚類分析Fig.2 Clustering results of differentially expressed proteins in porcine granulosa cells during heat stress

A:RNA加工和修飾; B:染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化; C:能量產(chǎn)生和變化; D:細(xì)胞周期控制，細(xì)胞分裂，染色體分割; E:氨基酸運(yùn)輸和代謝; F:核苷酸轉(zhuǎn)移和代謝; G:碳水化合物轉(zhuǎn)移和代謝; H:輔酶轉(zhuǎn)移和代謝; I:脂類轉(zhuǎn)移和代謝; J:翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生; K:轉(zhuǎn)錄; L:復(fù)制，重組和修復(fù); M:細(xì)胞壁/膜/殼生成; N:細(xì)胞運(yùn)動(dòng); O:轉(zhuǎn)錄后修飾，蛋白質(zhì)折疊，分子伴侶; P:無機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; Q:次級(jí)代謝產(chǎn)物生成，轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; R:功能預(yù)測(cè); S:未知功能; T:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制; U:胞內(nèi)交通，分泌和微囊轉(zhuǎn)運(yùn); V:防御機(jī)制; Y:核結(jié)構(gòu); Z:細(xì)胞骨架。圖3 蛋白質(zhì)的直系同源簇注釋分析Fig.3 COG annotation analysis of proteins

1:細(xì)胞過程; 2:代謝過程; 3:生物調(diào)控; 4:應(yīng)激反應(yīng); 5:生物過程調(diào)控; 6:細(xì)胞組分配置或生物發(fā)生; 7:發(fā)育過程; 8:多細(xì)胞生物過程; 9:定位; 10:定位建立; 11:信號(hào); 12:死亡; 13:免疫系統(tǒng)過程; 14:正調(diào)控生物過程; 15:負(fù)調(diào)控生物過程; 16:細(xì)胞增殖; 17:運(yùn)動(dòng); 18:繁殖; 19:繁殖過程; 20:多物種過程; 21:生長(zhǎng); 22:病毒繁殖; 23:生物黏附; 24:細(xì)胞; 25:細(xì)胞組分; 26:細(xì)胞器; 27:細(xì)胞器組分; 28:大分子復(fù)合物; 29:膜封閉腔; 30:胞外域; 31:部分胞外域； 32：結(jié)合; 33:催化活性; 34:結(jié)構(gòu)分子活動(dòng); 35:轉(zhuǎn)運(yùn)活性; 36:能量調(diào)控活性; 37:蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性; 38:抗氧化活性; 39:受體調(diào)控活性。圖4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能注釋結(jié)果Fig.4 GO function annotation results of differentially expressed proteins

為進(jìn)一步了解差異表達(dá)蛋白質(zhì)所富集的通路，進(jìn)行了KEGG通路分析。如圖5所示，表達(dá)量上調(diào)的蛋白質(zhì)主要富集在剪接體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工、代謝通路、胞吞、RNA降解和氧化磷酸化等信號(hào)通路中。而下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)則顯著富集在代謝通路、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、嘌呤代謝、泛素化蛋白質(zhì)降解、糖酵解/糖異生以及胞間緊密連接等信號(hào)通路中。

A:上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)富集的通路及數(shù)量占比；B:下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)富集的通路及數(shù)量占比。a1:剪接體; b1:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工; c1:代謝通路; d1:胞吞; e1:帕金森病; f1:亨廷頓癥; g1:抗原加工和遞呈; h1:RNA降解; i1:氧化磷酸化; j1:阿爾茨海默病。a:代謝通路; b:次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成; c:不同環(huán)境下微生物的代謝; d:嘌呤代謝; e:泛素化蛋白質(zhì)降解; f:糖酵解/糖異生; g:胞間緊密連接; h:磷酸戊糖途徑; i:淀粉和糖代謝; j:氨糖和核糖代謝。圖5 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG通路分析結(jié)果Fig.5 KEGG pathway analysis results of differentially expressed proteins

3 討論

熱應(yīng)激可導(dǎo)致雌性動(dòng)物短促發(fā)情或乏情、降低受胎率、早期胚胎死亡和流產(chǎn)等問題[12]。前人研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可經(jīng)下丘腦-垂體-性腺軸對(duì)動(dòng)物的內(nèi)分泌產(chǎn)生不良影響進(jìn)而造成上述問題[14]。熱應(yīng)激導(dǎo)致動(dòng)物內(nèi)分泌紊亂主要表現(xiàn)在性激素[促性腺激素釋放激素(GnRH)、促卵泡激素(FSH)和促黃體激素(LH)等]分泌量下降、抑制促性腺激素受體基因的表達(dá)[15-17]等。此外，通過下丘腦-垂體-性腺軸，熱應(yīng)激還可調(diào)控其他激素的分泌，例如抑制促甲狀腺激素[18]、甲狀腺激素[19]以及促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素[20]等激素的合成和分泌，從而增加腎上腺皮質(zhì)激素分泌量，造成黃體提早溶解，引起早期胚胎死亡或流產(chǎn)[21]。

熱應(yīng)激通過下丘腦-垂體-性腺軸對(duì)顆粒細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，是其重要的內(nèi)分泌調(diào)控路徑。然而，就顆粒細(xì)胞所處的位置來講，其位于動(dòng)物腹腔最深處，受熱應(yīng)激時(shí)，豬機(jī)體深處的體溫，即核心體溫顯著升高[22]，升高的核心溫度必然直接作用于顆粒細(xì)胞而影響其功能。遺憾的是，當(dāng)前對(duì)于熱應(yīng)激直接影響顆粒細(xì)胞的研究較少。因此本研究通過體外培養(yǎng)的方式，將顆粒細(xì)胞所處的卵泡微環(huán)境、下丘腦-垂體-性腺軸以及內(nèi)分泌環(huán)境的影響剝離，純粹在細(xì)胞水平上對(duì)熱應(yīng)激調(diào)控顆粒細(xì)胞功能的分子機(jī)理開展研究。我們前期在體外模擬了顆粒細(xì)胞受到熱應(yīng)激的狀態(tài)：將顆粒細(xì)胞分別在37 ℃(對(duì)照組)和41 ℃(熱應(yīng)激組)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞合成雌激素和孕酮的能力隨著溫度的升高顯著下降，且與之相關(guān)的CYP11A1、CYP19A1和FSHR基因表達(dá)量顯著下調(diào)，但HSP70的表達(dá)量顯著上調(diào)[9]。上述結(jié)果說明熱應(yīng)激可直接對(duì)顆粒細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響。

為深入了解熱應(yīng)激對(duì)豬卵泡顆粒細(xì)胞功能的影響，并最終為解決受熱應(yīng)激的母豬繁殖性能降低的問題提供理論依據(jù)，本研究利用iTRAQ技術(shù)對(duì)受熱應(yīng)激處理的豬顆粒細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)差異進(jìn)行了系統(tǒng)研究，共鑒定到5 451個(gè)蛋白質(zhì)。這是目前已知鑒定到的相對(duì)較多的豬卵泡顆粒細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，并篩選出了289個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)162個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)127個(gè)。通過對(duì)這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO分類和KEGG通路分析，初步闡明其分類屬性和富集的功能通路。我們推測(cè)這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)在細(xì)胞抵抗熱應(yīng)激和減輕熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成損傷方面起到重要作用。例如，熱休克蛋白HSP70和HSP90是細(xì)胞受熱應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，作為分子伴侶，它們參與蛋白質(zhì)折疊，在抵御不利因素造成的應(yīng)激或凋亡過程中發(fā)揮了重要作用[23]，其表達(dá)量的升高也標(biāo)志著細(xì)胞正在抵御熱應(yīng)激帶來的損害[24]。

在對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集的KEGG通路分析中我們發(fā)現(xiàn)了參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、RNA降解以及氧化磷酸化等過程的重要通路，說明這些通路的激活參與顆粒細(xì)胞抵抗熱應(yīng)激的過程。以氧化磷酸化為例，該過程是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)通過氧化制造細(xì)胞代謝的重要能量載體——三磷酸腺苷(ATP)的過程[25]，其詳細(xì)過程為：電子經(jīng)電子傳遞鏈從供體轉(zhuǎn)移至載體上，最后傳遞到受體，同時(shí)釋放能量以便ATP的合成[26]。Yin等[27]也發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激處理可促進(jìn)卵丘顆粒細(xì)胞中ATP的合成，在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)脂多糖(LPS)處理亦可上調(diào)豬顆粒細(xì)胞中ATP的合成[28]。這些結(jié)果充分說明，細(xì)胞提高胞內(nèi)ATP的合成可能是為了抵御受到的不良刺激。然而合成的ATP如何參與抵御不良刺激，目前尚不清晰，這需要我們通過進(jìn)一步的研究加以闡明。

4 結(jié)論

本研究利用iTRAQ技術(shù)對(duì)受熱應(yīng)激處理的豬顆粒細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行了研究，初步篩選出289個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并分別富集到蛋白質(zhì)的泛素化降解、蛋白質(zhì)加工、胞吞、RNA降解、氧化磷酸化、嘌呤代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、糖酵解以及胞間緊密連接等信號(hào)通路中，也預(yù)示這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)和信號(hào)通路參與了熱應(yīng)激對(duì)豬顆粒細(xì)胞功能影響的過程。