基于UPLC-MS/MS 對(duì)阿卡波糖和米卡芬凈鈉中異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯的質(zhì)量控制

王琰，和燕玲，李春燕，朱靈龍，潘婷，葉繼威，段光玉，邵伍軍

（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺(tái)州 318000）

磺酸及其衍生物在藥物合成過程中常被用作烷基化或催化試劑，未反應(yīng)完全的磺酸及其衍生物可能與藥物合成過程中微量的醇類發(fā)生酯化反應(yīng)，產(chǎn)生磺酸酯類基因毒雜質(zhì)[1]。磺酸酯類是I 類潛在基因毒雜質(zhì)，能夠直接或者間接地將自身結(jié)構(gòu)上的烷基殘基轉(zhuǎn)移至富電子的DNA 堿基上引起DNA 突變或重組，甚至有可能是誘發(fā)腫瘤發(fā)生的物質(zhì)[2-3]。藥物中磺酸酯的檢測(cè)屬于藥物中有機(jī)雜質(zhì)檢測(cè)范疇，但其限度的控制需控制到μg/g 級(jí)別，所以磺酸酯的標(biāo)準(zhǔn)比普通有機(jī)雜質(zhì)嚴(yán)格了近百倍乃至幾千倍，高效液相色譜、氣相色譜法已無法滿足限度要求，目前常用的方法為高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用或氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法[4]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甲磺酸酯、苯磺酸酯、對(duì)甲苯磺酸酯的檢測(cè)方法報(bào)道較多，未發(fā)現(xiàn)異丙苯磺酸甲酯和異丙苯磺酸乙酯的檢測(cè)方法，本方法基于UPLC-MS/MS 首次建立了阿卡波糖和米卡芬凈鈉中異丙苯磺酸甲酯和異丙苯磺酸乙酯檢測(cè)方法，為阿卡波糖、米卡芬凈鈉質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY I UPLC Class-TQ-S micro 超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）； Milli-Q Advantage A10 超 純 水 儀（ 美 國Merck 公 司）；XPE205 電子天平（瑞士梅特勒公司）。

甲酸銨為質(zhì)譜純（德國Sigma 公司）；甲醇為色譜純（美國Merck 公司）；異丙苯磺酸甲酯，異丙苯磺酸乙酯對(duì)照品，純度均為98%（桑迪亞醫(yī)藥技術(shù)上海有限責(zé)任公司）。阿卡波糖（浙江海正藥業(yè)生產(chǎn)），米卡芬凈鈉（浙江海正藥業(yè)生產(chǎn)）。

1.2 對(duì)照品及樣品溶液配制

對(duì)照品溶液配制：分別精密稱取異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯對(duì)照品適量，用30%甲醇水溶液（V/V）溶解稀釋成含有異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯濃度均為500 ng/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

樣品溶液配制：稱取阿卡波糖樣品適量用30%甲醇水溶液（V/V）溶解稀釋成含有阿卡波糖4 mg/ mL 的溶液；稱取米卡芬凈鈉樣品適量用30%甲醇水溶液（V/V）溶解稀釋成含有米卡芬凈鈉4 mg/mL 的溶液。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色 譜 柱： Agilent Eclipse Plus C18RRHD 50 ×2.1 mm ，1.8 μm；流動(dòng)相A 為0.01 moL/L 甲酸銨水溶液，流動(dòng)相B 為甲醇；梯度洗脫程序：0 ～ 4.0 min，30% ～ 80% B；4.0 ～ 5.0 min，80% B；5.0 ～ 5.1 min，80% ～ 30% B；5.1 ～ 7.0 min，30% B；柱 溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5.0 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離（ESI）正模式；離子化電壓3.5 kV；離子源溫度150 ℃；霧化氣溫度500 ℃；霧化氣流速1 000 L/h；錐孔電壓30 V；檢測(cè)模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Tab.1 Multiple reaction monitorning（MRM） parameters for detection of methyl 4-isopropylbenzenesulfonate and ethyl 4-isopropylbenzenesulfonate

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的確定

試驗(yàn)考察了甲酸-甲醇、甲酸-乙腈、甲酸銨-甲醇、甲酸銨-乙腈等流動(dòng)相體系，試驗(yàn)結(jié)果表明，以甲醇為有機(jī)相，異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯的質(zhì)譜響應(yīng)值明顯高于乙腈；由于異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯易在溶液中形成加銨母離子，以甲酸銨緩沖鹽為無機(jī)相，既能保證體系中穩(wěn)定的銨離子濃度，還能保證異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯液相中的保留時(shí)間及pH 值的穩(wěn)定，且能增強(qiáng)離子化效率；試驗(yàn)中使用甲酸體系時(shí)，對(duì)異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯有降解作用。因此本試驗(yàn)選擇0.01 moL/ L 甲酸銨水溶液-甲醇流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫。

2.2 色譜柱的確定

試驗(yàn)考察了Agilent Eclipse Plus C18、Waters BEH C18、Waters CSH C18、Waters HSS T3 色 譜 柱，發(fā) 現(xiàn)異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯及阿卡波糖、米卡芬凈鈉在Agilent Eclipse Plus C18色譜柱均有保留，分離度較好，選擇粒徑1.8 μm，柱長為50 mm 的色譜柱，流速設(shè)為0.3 mL/min，同時(shí)調(diào)節(jié)流動(dòng)相有機(jī)相初始比例為30%進(jìn)行梯度洗脫，既可以保證柱效及適宜的保留時(shí)間，也可以增強(qiáng)離子化效率，異丙苯磺酸甲酯的保留時(shí)間約為2.47 min，異丙苯磺酸乙酯的保留時(shí)間約為3.68 min。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將濃度分別為500 ng/mL 異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液以10 μL/min 的流速通過蠕動(dòng)泵注入質(zhì)譜儀中，在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，調(diào)節(jié)錐孔電壓及離子化電壓，使異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯母離子響應(yīng)值最高。全掃描結(jié)果表明，錐孔電壓為30 V，離子化電壓為3.5 kV時(shí)，異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯響應(yīng)值最高；在流動(dòng)相條件下異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯主要以[M+NH4]+形式存在，由于流動(dòng)相中含有NH4+，[M+NH4]+峰響應(yīng)值較穩(wěn)定，所以選擇異丙苯磺酸甲酯[M+NH4]+m/z 為232.1 作為母離子，異丙苯磺酸乙酯[M+NH4]+m/z 為246.1 作為母離子。二級(jí)質(zhì)譜掃描時(shí)，每種化合物選擇2 個(gè)特征離子作為定量和定性離子，優(yōu)化碰撞能量，使每組離子質(zhì)譜響應(yīng)值最高。二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果表明，異丙苯磺酸甲酯離子對(duì)232.1/91在碰撞能量為12 eV 時(shí)響應(yīng)值最高，232.1/201 在碰撞能量為12 eV 時(shí)響應(yīng)值次高；異丙苯磺酸乙酯離子對(duì)246.1/201 在碰撞能量為15 eV 時(shí)響應(yīng)值最高，246.1/91 在碰撞能量為13 eV 時(shí)響應(yīng)值次高。異丙苯磺酸甲酯選擇232.1/91 離子對(duì)為定量離子，異丙苯磺酸乙酯選擇246.1/201 離子對(duì)為定量離子。基于UPLC-MSMS 分析異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯MRM 特征定量離子質(zhì)譜圖如圖1。

圖1 異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯定量離子質(zhì)譜圖Fig.1 Quantitative ion chromatograms of methyl 4-isopropylbenzenesulfonate and ethyl 4-isopropylbenzenesulfonate

2.4 專屬性試驗(yàn)

在1.3 節(jié)，進(jìn)樣空白溶液（30%甲醇水溶液）、對(duì)照品溶液、樣品溶液。由圖2 可知，空白溶液及樣品溶液對(duì)異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯測(cè)定無干 擾。

圖2 空白溶液、對(duì)照品溶液、樣品溶液干擾試驗(yàn)質(zhì)譜圖Fig.2 Specific mass chromatograms of blank solution,reference solution and sample solution

2.5 線性范圍、檢測(cè)限和定量限

采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照“1.2 色譜-質(zhì)譜條件”對(duì)配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行LC-MS/MS 分析，以異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯定量離子對(duì)的峰面積對(duì)被測(cè)組分的濃度進(jìn)行線性回歸，得到各濃度的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，如表2 所示。結(jié)果表明，2 種化合物的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均為0.999 9。按照定量限S/N ≥10 的要求，異丙苯磺酸甲酯的定量限為5.735 0 ng/mL；異丙苯磺酸乙酯的定量限為4.950 0 ng/mL。按照檢測(cè)限S/N ≥3的要求，異丙苯磺酸甲酯的檢測(cè)限為1.720 5 ng/mL；異丙苯磺酸乙酯的檢測(cè)限為1.485 0 ng/mL，該方法的靈敏度較好。

表2 異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Tab.2 Linear ranges， regression equations， correlation coeffients（r）， limit of detection（LOD） and limit of quantitation（LOQ）of methyl 4-isopropylbenzenesulfonate and ethyl 4-isopropylbenzenesulfonate

2.6 加樣精密度試驗(yàn)

在5.00 μg/g 的添加濃度下，分別對(duì)阿卡波糖和米卡芬凈鈉樣品進(jìn)行加樣精密度試驗(yàn)（n= 6），異丙苯磺酸甲酯的回收率在98.00% ～ 102.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.49%與0.82%；異丙苯磺酸乙酯回收率在98.00% ～ 102.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.37%與0.90%，如表3 所示。結(jié)果表明，該方法有較好的重現(xiàn)性，能滿足阿卡波糖和米卡芬凈鈉中異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯分析檢測(cè)要求。

表3 阿卡波糖和米卡芬凈鈉中異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯加樣精密度Tab.3 Sample precision of methyl 4-isopropylbenzenesulfonate and ethyl 4-isopropylbenzenesulfonate in acarbose and micafungin sodium

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

在1.25 μg/g、5.00 μg/g、7.50 μg/g 的 添 加 濃 度下，分別對(duì)阿卡波糖和米卡芬凈鈉樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度試驗(yàn)（n= 3），異丙苯磺酸甲酯回收率在98.00% ～102.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.83% ～ 2.65%；異丙苯磺酸乙酯回收率在98.00% ～ 102.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.38% ～ 1.08%，如表4 所示。結(jié)果表明，該方法有較好的回收率，能滿足阿卡波糖和米卡芬凈鈉中異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯分析檢測(cè)要求。

表4 阿卡波糖和米卡芬凈鈉中異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯準(zhǔn)確度Tab.4 Accuracy of methyl 4-isopropylbenzenesulfonate and ethyl 4-isopropylbenzenesulfonate in acarbose and micafungin sodium

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)阿卡波糖3 批樣品和米卡芬凈鈉3 批樣品檢測(cè)，結(jié)果表明，六批樣品中均未檢測(cè)到異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯即小于檢測(cè)限限度0.4 μg/g。

3 結(jié)論

由于磺酸鹽及其衍生物在藥物中應(yīng)用范圍比較廣，對(duì)人類造成的風(fēng)險(xiǎn)也比較高。針對(duì)藥物中可能存在的磺酸酯基因毒性雜質(zhì)控制，建立相應(yīng)的安全標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)志著基因毒性雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與防控邁入新的一步。針對(duì)基因毒雜質(zhì)帶來的安全隱患，歐洲藥品監(jiān)督管理局（EMA）[5]最先出臺(tái)了關(guān)于基因毒雜質(zhì)的控制法規(guī)，并于2006 年頒布的《基因毒雜質(zhì)限度指南》首次引入了“毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）”概念[6]。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）[7]于2008 年出臺(tái)了關(guān)于基因毒雜質(zhì)控制的指南草案，該草案對(duì)于基因毒雜質(zhì)的控制與EMA 頒布的指南基本一致。ICH[8]也于2014 年發(fā)布了基因毒雜質(zhì)研究指南，進(jìn)一步肯定了“毒理學(xué)閾值”控制策略及“五分類”策略對(duì)基因毒雜質(zhì)進(jìn)行控制的科學(xué)性。磺酸酯類是I 類基因毒雜質(zhì)，限度要求低，普通液相已無法滿足檢測(cè)要求，本試驗(yàn)首次建立了超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定阿卡波糖和米卡芬凈鈉中異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯分析方法，以0.01 moL/L 甲酸銨水溶液和甲醇為流動(dòng)相，Agilent Eclipse Plus C18RRHD（50×2.1 mm 1.8 μm）為色譜柱進(jìn)行梯度洗脫分離，質(zhì)譜采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式采集數(shù)據(jù)，離子化電壓3.5 kV，離子源溫度150 ℃，霧化氣溫度500 ℃，霧化氣流速1 000 L/h 進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異丙苯磺酸甲酯在5.735 0 ～ 45.880 0 ng/ mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，異丙苯磺酸乙酯在4.950 0 ～ 39.600 0 ng/ mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.999；異丙苯磺酸甲酯檢出限和定量限為1.725 0 ng/ mL、5.735 0 ng/mL，異丙苯磺酸乙酯檢出限和定量限為1.485 0 ng/mL、4.950 0 ng/mL；阿卡波糖和米卡芬凈鈉樣品中高、中、低三個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率在98.00% ～ 102.00%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.38% ～ 4.58%之間，準(zhǔn)確度良好；以上結(jié)果表明，該方法選擇性強(qiáng)，靈敏度高，回收率好，適用于阿卡波糖和米卡芬凈鈉中異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯的檢測(cè)，有助于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化，也可以推廣到其他藥物中異丙苯磺酸甲酯、異丙苯磺酸乙酯的檢測(cè)。