金蓮花總黃酮下調miR-215-5p抑制PI3K/AKT信號通路影響AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖和遷移

鄒勇 徐亞寧 劉波 莊紅 尹俊 張?zhí)K川

(江漢大學附屬醫(yī)院心血管內科，湖北 武漢 430016)

心肌成纖維細胞(CFs)是心臟的主要細胞類型，在心肌纖維化中起主要作用。在正常情況下，纖維細胞處于相對靜止狀態(tài)，在持續(xù)性高血壓或系統(tǒng)性血管緊張素(Ang)Ⅱ慢性升高等應激條件下纖維細胞分化為成纖維細胞，其增殖、遷移、積極參與合成分泌細胞外基質，導致心肌纖維化和收縮功能障礙〔1，2〕。因此，降低CFs的增殖和遷移能力可能是治療心肌纖維化的潛在策略。金蓮花總黃酮為毛茛科金蓮花屬的植物金蓮花的主要活性成分之一，具有清熱解毒、抗菌消炎等藥用功能，廣泛用于咽炎、扁桃體炎、上呼吸道感染治療。近年研究顯示，金蓮花總黃酮可能通過抗氧化、抗凋亡機制對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用〔3〕。miR-215-5p是一種纖維化相關非編碼RNA，研究顯示隨著炎癥活動程度和纖維化程度的增加，慢性乙肝肝損傷患者血漿中miR-215-5p表達顯著降低，是潛在的肝損傷標志物〔4〕。本研究通過觀察金蓮花總黃酮對AngⅡ誘導的CFs增殖、遷移及miR-215-5p表達的影響，探討其潛在分子機制，旨在為金蓮花總黃酮用于防治心肌纖維化奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料 大鼠CFs購于上海博湖生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Hyclone公司；金蓮花總黃酮(純度為98%)由江漢大學附屬醫(yī)院中藥制劑室提供；Lipofectamine 2000、Trizol試劑盒、miRNA universal master mix、miRNA逆轉錄試劑盒購于美國Invitrogen公司；胰蛋白酶、AngⅡ購于美國Sigma公司；細胞技術試劑盒(CCK-8)、放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所；miRNA模擬物(miRNA mimics)、模擬物對照(miR-NC)、miRNA抑制物、抑制物對照(anti-miR-NC)購于廣州銳博生物技術公司；Transwell小室購于美國康寧公司；兔源Ki67抗體、兔源基質金屬蛋白酶(MMP)2抗體、兔源MMP9抗體、兔源磷酸化的磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)抗體和兔源磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)抗體、兔源β-actin抗體、羊抗兔IgG購于上海賽信通公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉染 大鼠CFs采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于飽和濕度、5% CO2和37℃的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2 d換液一次，當細胞融合度達85%以上時，加胰蛋白酶消化傳代，收集第3～5代細胞進行實驗。取2×105個對數(shù)期CFs接種6孔板中，當細胞融合度為60%時，更換為血清培養(yǎng)基。利用Lipofectamine 2000轉染試劑將miR-NC、miR-215-5p mimic、anti-miR-NC、anti-miR-215-5p分別轉染CFs，轉染6 h后，更換為換血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2實驗分組和處理 取2×104個CFs接種24孔板。未轉染CFs分為正常對照(NC)組、AngⅡ組、0.2、0.4、0.8 mmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組。NC組為正常培養(yǎng)的CFs；AngⅡ組使用AngⅡ終濃度為10-7mol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)〔5〕；0.2、0.4、0.8 mmol/L金蓮花總黃酮組分別使用金蓮花總黃酮終濃度為0.2、0.4、0.8 mmol/L和AngⅡ終濃度為10-7mol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)；轉染miR-NC、miR-215-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-215-5p的CFs用AngⅡ終濃度為10-7mol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次記為miR-NC+AngⅡ組、miR-215-5p+AngⅡ組、anti-miR-NC+AngⅡ組、anti-miR-215-5p+AngⅡ組。轉染miR-NC、miR-215-5p mimics的CFs用含0.8 mmol/L金蓮花總黃酮和10-7mol/L AngⅡ的培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次命名為金蓮花總黃酮+miR-NC+AngⅡ組、金蓮花總黃酮+miR-215-5p+AngⅡ組。培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3CCK-8法檢測細胞活力 將各組細胞按照每孔1×104個細胞的密度接種于96孔板，孵育48 h后，將10 μl的CCK-8溶液加入96孔板各孔內，細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2.5 h?？瞻卓渍{零后，酶標儀在450 nm下測量每孔的光密度(OD)值。

1.2.4Transwell法檢測細胞遷移 取600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基添加到24孔板下室。取200 μl細胞數(shù)約為5×104個的細胞懸液添加到Transwell上腔室。置于37℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱孵育24 h。無菌濕棉簽擦去Transwell膜上表明未遷移細胞，分別用70%乙醇、0.1%結晶紫溶液進行Transwell膜下表面進行固定和染色。顯微鏡下觀察細胞遷移情況、以3個視野細胞數(shù)均值表示遷移細胞數(shù)。

1.2.5Western印跡檢測Ki67、MMP2、MMP9、p-PI3K和p-AKT表達水平 RIPA緩沖液提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒進行定量。取適量蛋白樣品與上樣緩沖液混勻后煮沸5 min變性。配置濃縮膠、分離膠，每泳道加入30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。當溴酚藍到達凝膠底部時，停止電泳利用濕法轉膜裝置將已分離的蛋白轉移至硝酸纖維素膜。將膜置于5%脫脂牛奶溶液中室溫封閉2 h。用稀釋的一抗溶液室溫孵育膜2 h。用稀釋的二抗溶液室溫孵育膜1 h。加入電化學發(fā)光(ECL)試劑暗室顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光、拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對表達量以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1.2.6實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-215-5p表達水平 Trizol試劑盒提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。miRNA逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA，隨后以cDNA為模板利用miRNA universal master mix進行RT-qPCR擴增。反應條件為預變性95℃ 5 min；變性95℃ 10 s，退火延伸60℃ 30 s，共40個循環(huán)。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法分析miR-215-5p相對表達水平。每組設置3個平行實驗，獨立重復3次。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度金蓮花總黃酮對AngⅡ處理的CFs細胞增殖的影響 與NC組比較，AngⅡ組CFs細胞活力、Ki67蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與AngⅡ組比較，0.2 mmol/L 金蓮花總黃酮+AngⅡ組、0.4 μmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組、0.8 μmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組CFs細胞活力、Ki67蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

1～5：NC組、AngⅡ組、0.2 mmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組、0.4 mmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組、0.8 mmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組圖1 Western印跡檢測Ki67蛋白的表達

表1 不同濃度金蓮花總黃酮對AngⅡ處理的CFs細胞 增殖的影響

2.2金蓮花總黃酮對AngⅡ處理的CFs細胞遷移的影響 與NC組比較，AngⅡ組CFs細胞遷移數(shù)量、MMP2和MMP9蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與AngⅡ組比較，金蓮花總黃酮+AngⅡ組CFs細胞遷移數(shù)量、MMP2和MMP9蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 金蓮花總黃酮對AngⅡ處理的CFs細胞遷移的 影響

圖2 金蓮花總黃酮對AngⅡ處理的CFs細胞遷移的影響(結晶紫染色，×200)

2.3金蓮花總黃酮對miR-215-5p表達的影響 與NC組(1.00±0.09)比較，AngⅡ組CFs細胞miR-215-5p表達顯著升高(4.37±0.37，P<0.05)；與AngⅡ組比較，金蓮花總黃酮+AngⅡ組CFs細胞miR-215-5p表達顯著降低(1.82±0.12，F(xiàn)=523.169，P=0.000)。

2.4miR-215-5p對AngⅡ處理的CFs細胞增殖和遷移的影響 與miR-NC+AngⅡ組比較，miR-215-5p+AngⅡ組CFs細胞miR-215-5p、細胞活力、遷移細胞數(shù)、Ki67、MMP2和MMP9蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與anti-miR-NC+AngⅡ組比較，anti-miR-215-5p+AngⅡ組CFs細胞miR-215-5p、細胞活力、遷移細胞數(shù)、Ki67、MMP2和MMP9蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖3、表3。

1～4：miR-NC+AngⅡ組、miR-215-5p+AngⅡ組、anti-miR-NC+AngⅡ組、anti-miR-215-5p+AngⅡ組圖3 Western印跡檢測Ki67、MMP2、MMP9蛋白的表達

表3 miR-215-5p對AngⅡ處理的CFs細胞增殖和遷移的影響

2.5miR-215-5p可以逆轉金蓮花總黃酮對AngⅡ處理的CFs細胞增殖和遷移的影響 與金蓮花總黃酮+AngⅡ組比較，金蓮花總黃酮+miR-215-5p+AngⅡ組CFs細胞miR-215-5p的表達顯著升高，細胞活力、遷移細胞數(shù)、Ki67、MMP2和MMP9蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表4、圖4。

表4 miR-215-5p可以逆轉金蓮花總黃酮對AngⅡ處理的CFs細胞增殖和遷移的影響

1～3：金蓮花總黃酮+AngⅡ組、金蓮花總黃酮+miR-NC+AngⅡ組、金蓮花總黃酮+miR-215-5p+AngⅡ組圖4 Western印跡檢測Ki67、MMP2、MMP9蛋白表達

2.6PI3K/AKT信號通路蛋白的表達情況 與NC組比較，AngⅡ組CFs細胞p-PI3K和p-AKT水平顯著升高(P<0.05)；與AngⅡ組比較，金蓮花總黃酮+AngⅡ組CFs細胞p-PI3K和p-AKT水平顯著降低(P<0.05)；與金蓮花總黃酮+AngⅡ組比較，金蓮花總黃酮+miR-215-5p+AngⅡ組CFs細胞p-PI3K和p-AKT水平顯著降低(P<0.05)。見圖5、表5。

1～5：NC組、AngⅡ組、金蓮花總黃酮+AngⅡ組、金蓮花總黃酮+miR-NC+AngⅡ組、金蓮花總黃酮+miR-215-5p+AngⅡ組圖5 Western印跡檢測p-PI3K、p-AKT蛋白表達

表5 PI3K/AKT信號通路蛋白的表達情況

3 討 論

金蓮花總黃酮是從金蓮花中提取的黃酮類化合物的總稱，具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗腫瘤作用〔6，7〕。然而，其在心肌纖維化中的作用有待闡明。既往研究顯示，AngⅡ通過激活多種細胞內信號通路促進CFs增殖和遷移，在心肌纖維化發(fā)病和進展過程中起中心作用〔8，9〕。因此本研究使用AngⅡ刺激心肌細胞模擬心肌纖維化進程，探索金蓮花總黃酮對CFs增殖和遷移的影響。結果顯示，AngⅡ誘導CFs后，細胞活力、Ki67蛋白表達顯著降低，而金蓮花總黃酮呈劑量依賴性降低AngⅡ對CFs的促增殖作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，金蓮花總黃酮還可降低AngⅡ對CFs的促遷移作用，降低促遷移蛋白MMP2和MMP9的表達水平。以上數(shù)據(jù)表明，金蓮花總黃酮可能通過抑制CFs增殖和遷移進而減輕心肌纖維化。

miRNA是一類內源性多功能非編碼RNA，其通過調控細胞增殖、分化、遷移和侵襲在包括心臟纖維化在內的心血管疾病中發(fā)揮重要作用〔10〕。研究顯示，硒缺乏導致的miR-215-5p表達增加可能導致心肌基因轉錄紊亂、線粒體生物合成失衡，影響心肌發(fā)育及分化〔11〕。抑制miR-215-5p通過抑制活性氧(ROS)依賴性絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，激活心肌細胞中的PI3K/AKT通路對抗自噬增強細胞的生存能力〔12〕。此外，下調miR-215-5p表達對轉化生長因子-β誘導的人肺成纖維細胞IMR-90增殖具有抑制作用，抑制其向肌成纖維細胞轉化〔13〕。本研究通過轉染miR-215-5p mimics上調miR-215-5p表達發(fā)現(xiàn)，次誘導CFs活力、遷移能力、Ki67、MMP2和MMP9蛋白的表達顯著升高，而下調miR-215-5p則顯著降低AngⅡ誘導對CFs的增殖和遷移促進作用，提示下調miR-215-5p表達具有潛在抑制心肌纖維化作用。進一步研究顯示，AngⅡ可升高CFs中miR-215-5p表達水平，而金蓮花總黃酮則減輕AngⅡ對miR-215-5p表達的促進作用，提示金蓮花總黃酮可能通過下調miR-215-5p表達進而發(fā)揮抗CFs增殖和遷移作用。后續(xù)研究顯示，過表達miR-215-5p能夠逆轉金蓮花總黃酮對AngⅡ誘導的CFs增殖和遷移的影響，這進一步說明金蓮花總黃酮可能通過下調miR-215-5p表達抑制AngⅡ誘導的CFs增殖和遷移。

PI3K/AKT信號通路是體內一條重要的調控通路，具有調控細胞在增殖、遷移、分化和血管生成等多種功能，抑制PI3K/Akt信號通路對大鼠CFs的增殖、遷移具有顯著的抑制作用〔14，15〕。本研究顯示，金蓮花總黃酮可降低AngⅡ誘導的CFs中PI3K和AKT的磷酸化水平，而下調miR-215-5p表達可降低金蓮花總黃酮對AngⅡ誘導的CFs中PI3K和AKT的磷酸化的影響，說明金蓮花總黃酮對AngⅡ誘導的CFs的抗增殖、遷移作用可能與下調miR-215-5p和抑制PI3K/Akt信號通路有關。

綜上所述，金蓮花總黃酮能夠降低AngⅡ誘導的CFs增殖和遷移，其機制可能與下調miR-215-5p表達和抑制PI3K/AKT信號通路有關，這為金蓮花總黃酮用于防治心肌纖維化提供了理論支持。