貴州普安四球茶(Camellia tetracocca Zhang)種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

羅 雯，陳艷艷，尹世華，王莉飛，黃曉霞，耿 芳，程小毛

（西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院/云南省古茶樹資源保護與利用研究中心，云南 昆明 650224）

【研究意義】近年來，隨著茶葉消費觀念由求量向求質(zhì)轉(zhuǎn)變，古茶樹逐漸受到重視，政府及茶農(nóng)開始對優(yōu)質(zhì)的古茶樹種質(zhì)資源進行保護性開發(fā)和種植推廣[1]。四球茶（Camellia tetracoccaZhang）屬于山茶屬茶亞屬Subgen.Thea 茶組Sect.Thea 五室茶系Ser.Quiquelocularis 中的一種，又名炒青茶，是1981 年張宏達先生發(fā)現(xiàn)的新種，集中分布在貴州省普安縣海拔1 700～1 950 m 的森林中，為貴州特有種[2]。2009 年袁茂琴等[3]通過野外調(diào)查比較了大廠茶和四球茶的花、葉、果及地域范圍的差異，提供了四球茶作為一個新種從大廠茶里分離出來的形態(tài)依據(jù)。同時四球茶具有高抗寒性，能夠忍受-6.0 ℃以下的低溫，可作為遠緣雜交、基因轉(zhuǎn)移聚合等茶樹育種材料，是實現(xiàn)突破性育種和選育優(yōu)良茶樹品種不可替代的基因源[4]，故四球茶在遺傳學(xué)上具有較高的保護和研究價值?！厩叭搜芯窟M展】目前，對四球茶的研究多見于對其生理[4]、生化[5]、種子繁育[6]和土壤[7]等方面。此外，一些學(xué)者也陸續(xù)開展了四球茶SSR[8]及SNP[9]分子標記的挖掘，而針對四球茶遺傳多樣性的研究還較少，這對四球茶的種質(zhì)保存和遺傳育種是非常不利的。而四球茶作為具有地方特色的茶種，其豐富的資源在品種發(fā)掘、利用和保護上具有非常重要的價值。因此研究四球茶遺傳多樣性是今后開展育種工作的基礎(chǔ)。

【本研究切入點】EST-SSR 標記又叫基于表達序列標簽微衛(wèi)星（expressed sequence tag based simple sequence repeat），除了具有SSR 的特點外，還有引物廉價、通用性好、條帶清晰、容易統(tǒng)計等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性等方面研究[10]。目前EST-SSR 在茶樹上的應(yīng)用主要在親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析方面[11-12]?！緮M解決的問題】研究通過EST-SSR 標記方法對普安四球茶進行遺傳多樣性和居群結(jié)構(gòu)分析，旨在從分子水平上分析四球茶的現(xiàn)狀，為四球茶育種親本的選擇、生態(tài)適應(yīng)性等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取貴州省普安縣青山鎮(zhèn)普白林場和馬家坪141份四球茶樹資源作為實驗材料，其中野生型古茶樹62 株，千年野生型古茶樹5 株，栽培型古茶樹17 株，栽培型茶樹57 株。采集當年生完全展開的幼嫩葉片，放入裝有有色硅膠的自封袋中，做好相應(yīng)標記，帶回實驗室自然保存以備用。

根據(jù)普安縣青山鎮(zhèn)茶樹分布特點，將所采集材料分為野生型古茶樹、千年野生型古茶樹、栽培型古茶樹和栽培型茶樹4個居群，其中野生型古茶樹、千年野生型古茶樹和栽培型古茶樹居群的樹齡均是經(jīng)專家調(diào)查鑒定。

1.2 DNA提取

采用CTAB 法[13]提取茶樹葉片基因組DNA，再經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量和微量核酸蛋白檢測儀測定濃度和純度后，稀釋DNA溶液至50 ng/μL左右。

1.3 EST-SSR引物選擇

在程小毛等[14]設(shè)計的、由生工生物工程（上海）有限公司合成的200 對茶樹EST-SSR 引物中篩選出22對擴增條帶清晰、多態(tài)性高的引物，有關(guān)引物的具體信息見表1。

表1 22對EST-SSR引物合成信息Tab.1 22 pairs of EST-SSR primers correlation properties

1.4 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

參照唐探等[15]的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序，擴增產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)為6%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，并參照程小毛等[14]的方法進行銀染顯色，最后放在燈箱上拍照記錄。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用人工讀帶的方法，將電泳圖上清晰的條帶記為“1”，同一位置無帶或不易分辨的弱帶記為“0”，建立原始數(shù)據(jù)矩陣，利用Data Trans 1.0 軟件[16]將0/1 轉(zhuǎn)換為基因型數(shù)據(jù)類型。利用POPGENE v1.32[17]軟件分析其遺傳參數(shù)。根據(jù)遺傳相似度值，利用NTsys 2.1[18]軟件進行UPGMA 聚類分析。采用GenALEx[19]軟件進行AMOVA 分子差異分析及PCA 分析。利用軟件Structure 2.3.4[20]進行居群遺傳結(jié)構(gòu)分析，設(shè)定K值為1～10，MCMC（markov chain monte carlo）為10 000 次，根據(jù)似然值最大的原則，在運算結(jié)果中選取一個合適的K值。

2 結(jié)果分析

2.1 遺傳多樣性分析

利用22 對EST-SSR 引物對141 份材料進行PCR 擴增，共擴增出72 條多態(tài)性帶，每個位點擴增出的等位基因數(shù)在2～5 個，平均擴增數(shù)為3.272 7 個，擴增位點多態(tài)率100%；從表中可知，觀測等位基因（Na）的數(shù)值最小為3.000 0，分別是CsEMS147、CsEMS148、CsEMS152 和CsEMS194，最大 為6.000 0，是CsEMS27 和CsEMS117，平均4.227 3，有效等位基因數(shù)（Ne）最小值為1.647 3，是CsEMS152，最大值為3.798 1，是CsEMS117，平均2.787 4。22 對EST-SSR 引物中，Shannon 信息多樣性指數(shù)（I）在0.684 6（CsEMS152）～1.505 9（CsEMS117），變幅0.821 3，變化范圍較大，平均Shannon指數(shù)為1.145 4，說明普安四球茶古茶樹具有豐富的遺傳多樣性。觀測純合度（Obs-Ho）范圍為0.049 6（CsEMS38）～0.822 7（CsEMS148），平均0.458 7，高于平均期望純合度（Exp-Ho為0.375 1）。觀測雜合度（Obs-He）為0.177 3（CSEMS148）～0.950 4（CSEMS38），均值為0.541 3，期望雜合度（Exp-He）均值為0.624 9，說明擴增位點的平均純合度略高于平均雜合程度。Nei 基因多樣性指數(shù)（H）平均值是0.622 7，范圍在0.392 9（CsEMS152）～0.736 7（CsEMS117）；引物的多態(tài)信息含量（PIC）在13.3%～78.69%，平均為64.38%，表明22對EST-SSR引物的多態(tài)率較高。

表2 普安四球茶茶樹EST-SSR的多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of Camellia tetracocca Zhang populations in Pu’an based on EST-SSR

不同居群的四球茶遺傳多樣性的差異見表3。從表中可知，觀測等位基因數(shù)（Na）分別為4.090 9、3.090 9、3.772 7 和4.090 9，有效等位基因數(shù)（Ne）分別為2.551 2、2.641 7、2.747 6 和2.799 6，4 個居群間Shannon 信息指數(shù)（I）值大小順序為：栽培型茶樹，栽培型古茶樹，野生型古茶樹，千年野生型茶樹，栽培型的茶樹居群的I值為1.133 0，茶樹居群遺傳多樣性豐富，而千年野生型古茶樹的茶樹居群I值為1.015 5，相比其他類型而言其茶樹資源豐富度較小，4 個居群間Nei 基因多樣性指數(shù)（H）大小順序為：栽培型茶樹，栽培型古茶樹，千年野生型古茶樹和野生型古茶樹。

表3 EST-SSR標記在四球茶茶樹居群間的遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversity for population of Camellia tetracocca Zhang plants by EST-SSR markers

2.2 遺傳分化分析

通過POPGENE 分析得到不同居群的遺傳分化結(jié)果，本研究居群內(nèi)的近交系數(shù)（Fis）為0.129 3，總居群的近交系數(shù)（Fit）為0.170 1，居群分化系數(shù)（Fst）為0.046 9，說明四球茶樹的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。居群基因流Nm為5.085 3，基因交流豐富。AMOVA 分析表明，四球茶樹居群7%的遺傳變異發(fā)生在居群間，93%的遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi)，說明普安四球茶的遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi)（表4）。

表4 普安不同四球茶茶樹居群遺傳分化參數(shù)Tab.4 Genetic differentiation parameters of Camellia tetracocca Zhang populations in Pu’an

普安四球茶居群間的遺傳相似度和遺傳距離見表5，從表中可以看出各居群間遺傳一致度較高，在0.838 0～0.943 8，平均值為0.898 0，說明各居群間相似度較高；相應(yīng)居群間的遺傳距離較小，范圍在0.057 8～0.176 7，平均值為0.108 4。其中栽培型古茶樹與野生型古茶樹居群間遺傳相似度最高，達到0.943 8，遺傳距離最小，為0.057 8；栽培型茶樹與千年野生型古茶樹遺傳相似度最低，為0.838 0，遺傳距離最大，為0.176 7。

表5 普安四球茶居群間EST-SSR標記的遺傳相似性和距離Tab.5 Genetic similarity and genetic distances of Camellia tetracocca Zhang populations in Pu’an by EST-SSR markers

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 普安四球茶不同茶樹居群的聚類分析 通過NTsys 2.1 軟件對普安四球茶居群進行聚類分析，當遺傳相似度閾值為0.86 時，四球茶居群分為兩個亞群，第一個亞群包括居群Y1、Z1、Z2，即野生型古茶樹、栽培型古茶樹和栽培型茶樹居群，第二個亞群為Y2，即野生千年型古茶樹居群；其中第一亞群在遺傳相似度閾值為0.925時又分為兩個亞群，一個亞群是Y1、Z1，即野生型古茶樹和栽培型古茶樹居群，另一個亞群是Z2，即栽培型茶樹居群。從圖2中可以看出野生型古茶樹和栽培型古茶樹遺傳相似度最高，栽培型茶樹和千年野生型古茶樹遺傳相似性最小，與POPGENE 分析得到的不同居群遺傳相似性和遺傳距離結(jié)果一致。

圖1 基于Nei遺傳相似系數(shù)的普安四球茶居群UPGMA聚類分析Fig.1 UPGMA dendrogram for 4 populations of Camellia tetracocca Zhang plants in Pu’an based on Nei’s genetic identity

2.3.2 四球茶樹居群結(jié)構(gòu)分析 居群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明（圖2），當K=3時，STRUCTURE 將141份普安四球茶種質(zhì)資源分類為4 個亞群，分類基本與按其生長年限劃分的居群相吻合，而且4 個居群間存在頻繁的基因交流：紫色柱形是居群A，為野生型古茶樹；黃色柱形是居群B，為千年野生型古茶樹；綠色柱形是居群C，為栽培型古茶樹；紅色柱形是居群D，為栽培型茶樹。4個居群間存在頻繁的基因交流。

圖2 四球茶樹4個居群STURCTURE 分析結(jié)果Fig.2 Structure analysis with 4 populations of Camellia tetracocca Zhang for the model

2.3.3 基于EST-SSR 的主成分分析 主成分分析（PCA）結(jié)果顯示（圖3），普安四球茶樹不同居群間表現(xiàn)出顯著差異性，野生型古茶樹和栽培型茶樹居群較為緊密，栽培型古茶樹、千年野生古茶樹居群分化明顯。其中第一成分占62.8%，第二主成分占31.8%。PCA 分析大部分結(jié)果與聚類結(jié)果具有相似性，進一步表明所選用的EST-SSR多態(tài)性位點具有鑒別普安四球茶樹不同居群的能力。

圖3 基于EST-SSR標記的主成分分析Fig.3 Principal component analysis（PCA）based on EST-SSR markers

3 結(jié)論與討論

3.1 遺傳多樣性

本研究中四球茶居群在物種水平上，shannon 信息指數(shù)I平均為1.145 4，Nei 遺傳多樣性指數(shù)H平均為0.622 7，多態(tài)信息含量PIC平均為0.643 8，物種間遺傳多樣性豐富，遺傳結(jié)構(gòu)差異大。居群水平上，四球茶樹居群Na、Ne、I和H的平均值分別為3.761 4、2.685 0、1.076 1和0.607 4，可見四球茶樹居群遺傳多樣性豐富。牛素貞等[9]應(yīng)用EST-SSR 對貴州具有代表性的茶樹品種居群進行遺傳多樣性研究、和曹爍[10]利用SNP 標記對51 份貴州省野生茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行分析，結(jié)果都表明的貴州茶樹種質(zhì)資源具有豐富多樣性，與本研究結(jié)果一致。因此，普安四球茶居群遺傳多樣性豐富的原因可能與茶樹是長壽命異交木本植物，而長壽命異交木本植物具有更高的遺傳多樣性[21]；以及貴州具有悠久的植茶歷史和多樣的生態(tài)環(huán)境，是茶樹起源演化中心之一[22-23]。

本研究中4 個居群間Shannon 信息指數(shù)（I）值和Nei 基因多樣性指數(shù)（H）均表現(xiàn)出栽培四球茶樹＞野生四球茶樹，說明普安四球茶栽培茶樹遺傳多樣性高于野生茶樹。這一結(jié)果與姜燕華[24]人為選擇會導(dǎo)致茶樹多態(tài)性降低和遺傳多樣性喪失的觀點不一致。但是季鵬章等[25]基于形態(tài)研究云南阿薩姆茶、茶、白毛茶和野生茶樹大理茶種質(zhì)資源多樣性，結(jié)果表明栽培茶樹、阿薩姆茶和茶的遺傳多樣性高于野生茶樹大理茶。陳進[26]在對云南不同地區(qū)的地方栽培品種與野生近緣種的遺傳多樣性的研究中，也得到栽培品種遺傳多樣性并不低于其野生近緣種，均與本研究中普安四球茶栽培茶樹遺傳多樣性高于野生茶樹的結(jié)果相一致。Zhao等[27]利用14個微衛(wèi)星標記研究了茶樹野生、種植和新近馴化的居群遺傳多樣性，結(jié)果表明野生居群由于過度開發(fā)和生境破壞導(dǎo)致遺傳多樣性喪失。本研究中栽培茶樹遺傳多樣性高于野生茶樹，說明普安四球茶遺傳多樣性受到人為破壞。原因可能是早期當?shù)鼐用駴]有意識到茶樹的功效和價值，故沒有保護野生茶樹的意識，甚至為了耕地，對野生茶樹肆意損傷、砍伐。另外，由于對純天然有機茶的需求導(dǎo)致野生茶樹價格不斷攀升，致使當?shù)鼐用竦倪^度采摘或隨意挖掘部分野生茶樹，故造成了一些野生茶樹資源的流失。

3.2 遺傳分化

Wright[28]指出，F(xiàn)st值在0～0.05，居群遺傳分化較弱；0.05～0.15，居群遺傳分化中等；0.15～0.25，表示居群遺傳分化較大；當Fst值大于0.25 時，表示分化極大。本研究中，普安縣四球茶樹居群分化系數(shù)為0.046 9，說明四球茶樹居群遺傳分化較弱，居群間遺傳多樣性水平低，這與四球茶樹居群間的基因流較大有關(guān)，在本研究中四球茶樹居群間的基因流（Nm）高達5.085 3，足以抵制遺傳漂變的作用，防止居群分化。AMOVA 分析表明，普安縣四球茶樹居群93%的遺傳變異來自于居群內(nèi)，居群間的遺傳變異為7%。這與Matsumoto 等[29]關(guān)于茶樹品種資源的遺傳多樣性研究結(jié)果類似。辛桐[30]對云南山茶（Camellia reticulata）遺傳多樣性研究得到云南山茶居群內(nèi)部變異大于居群間變異的主要原因是受到人為的從不同居群進行引種雜交。植物的花粉與種子類型、散布方式和散布范圍會對遺傳多樣性造成影響[31]，普安四球茶的散播方式主要是靠種子重力傳播，理論上，這樣的傳播方式因其傳播距離有限，其居群間的遺傳變異應(yīng)大于居群內(nèi)的遺傳變異[30]，但是本研究的普安四球茶居群內(nèi)的遺傳變異大于居群間的遺傳變異，說明在普安四球茶散播過程中，人為因素起了很大作用。

居群的遺傳多樣性可用平均遺傳相似性來度量[32]。本研究中遺傳相似度范圍為0.838 0～0.943 8，平均值為0.898，大于周萌等[33]基于EST-SSR 標記的云南大茶樹遺傳多樣性分析中遺傳相似系數(shù)0.41～0.91，平均值為0.65；也大于黃壽輝等[34]對廣西部分地區(qū)野生茶樹遺傳關(guān)系EST-SSR 標記分析中遺傳相似系數(shù)在0.53～0.9，平均值為0.71。說明普安縣四球茶樹居群遺傳基礎(chǔ)相對比較窄。遺傳距離與進化趨異有關(guān)，居群或個體間遺傳距離越小，表明居群之間的親緣關(guān)系越近；反之，居群或個體間的遺傳距離越遠，那么，它們之間的親緣關(guān)系越遠[35]。本研究中平均遺傳距離值為0.108 4，說明普安四球茶居群間親緣關(guān)系近。原因可能是栽培型古茶樹是早年間茶農(nóng)從山里移栽的，來源于野生型四球茶樹；栽培型四球茶則是用千年野生型或野生型四球茶的種子進行繁殖的。四球茶野生型古茶樹和栽培型古茶樹的遺傳相似度和遺傳距離分別處于最大值（0.943 8）和最小值（0.057 8）。分析原因可能是：茶樹屬于異花授粉植物，在自然環(huán)境中，野生茶樹的結(jié)實率較低[36]。在古茶樹居群中，因自然結(jié)實率較低，繁殖后代的能力較弱，在長期的進化過程中，居群內(nèi)個體的差異性加大，故導(dǎo)致野生型四球茶樹居群和栽培型古茶樹居群之間的遺傳差異加大，遺傳分化程度高。

3.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

本研究對普安四球茶樹不同居群的遺傳結(jié)構(gòu)進行了UPGMA 聚類分析、STRUCTURE 分析和PCA 主成分分析：UPGMA 聚類分析表明生長年限對普安四球茶茶樹的遺傳分化和遺傳多樣性影響小，造成這一結(jié)果的原因可能是不同生長年限的茶樹居群由于人為原因不斷異交，導(dǎo)致普安四球茶不同居群間茶樹基因交流頻繁，居群間親緣關(guān)系亦較近[37]。STRUCTURE 軟件統(tǒng)計普安四球茶個體聚類雖然多聚于各自居群內(nèi)，但一些個體還是偏離本居群，造成各柱形交叉明顯，這可能是栽培過程中，普安四球茶生境中野生近緣植物的基因滲入栽培類型中，或當?shù)鼐用裰苯佑卯數(shù)匾吧枧嘤鲂碌脑耘嗖桀愋停瑥亩鴮?dǎo)致遺傳上的復(fù)雜性[38]。PCA 主成分分析表明普安四球茶遺傳距離相近，遺傳背景復(fù)雜，原因可能是長期以來茶樹育種多采用從自然授粉居群中單株選擇或從優(yōu)良品種中采集種子進行后代選擇的方式[39]。本研究中，栽培型古茶樹是當?shù)鼐用褡孑厪纳钌揭浦捕鴣?，栽培型茶樹則是選取生長發(fā)育良好的野生古茶樹的種子繁殖所得，故形成了栽培茶樹復(fù)雜的遺傳背景。

致謝：云南省萬人計劃青年拔尖人才項目（80201453）、云南省省級重點學(xué)科“園林植物與觀賞園藝”建設(shè)經(jīng)費（50097401）同時對本研究給予了資助，謹致謝意！