伊春林下參皂苷超高壓提取技術(shù)優(yōu)化

王丹麗，邢振楠，劉艷杰，馬珂，劉邦

(黑龍江省林業(yè)科學院伊春分院，黑龍江伊春153000)

人參(PanaxginsengC．A．Meyer)為傘形目五加科人參屬多年生草本植物[1]，是一種名貴的中藥材，它通體具有較高藥性，最主要的成分是人參皂苷，功效強，常被用于研發(fā)生產(chǎn)抗癌癥、改善心律失常、緩解心肌缺血等方面的藥物。目前，研究者們常用的提取方法有煎煮法、浸漬法[2]、回流法、索氏提取法、水解法、泡沫分離法、微波輔助萃取法、超聲輔助提取法、生物提取法等,利用上述技術(shù)方法提取皂苷，存在耗時長、提取率不高、不節(jié)約能源等缺點[3]。采用超高壓提取林下參皂苷是一種新興有效的提取手段[4]，利用流體靜壓驟減作用于目標物細胞璧，使其膜透化，快速提取目標成份，此方法一般較多用來提取中草藥中熱不穩(wěn)定成份，因為它不會受到溫度的制約，而且操作反應(yīng)時間短[5]。試驗進行伊春林下參皂苷的提取，采用超高壓技術(shù)，并合理設(shè)計優(yōu)化林下參皂苷的提取工藝[6]。工藝具有可操作性高、用時短，節(jié)能環(huán)保、綠色無污染等明顯優(yōu)勢。

1 儀器與材料

超高壓等靜壓機，電子天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，紫外可見分光光度計，超聲波發(fā)生器，恒溫水浴禍，離心機。林下參(產(chǎn)于小興安嶺伊春)，人參皂苷對照品Re，實驗過程中所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參皂苷的測定

標準曲線的制備：精確稱取人參皂苷Re對照品6.2 mg，取25 mL容量瓶加甲醇定容標準液，精確量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于具塞試管中，待溶劑揮干后，繼續(xù)每支試管里量取加入5%香草醛-冰醋酸0.2 mL 、HClO40.8 mL，將試管放于于恒溫水浴鍋中，設(shè)定溫度60 ℃定時15 min，加入CH3COOH5mL，冷卻[7]。紫外分光光度計設(shè)置波長在350～850 nm進行掃描，測定550 nm為最大吸收波長，在此處測A值，得人參皂苷Re質(zhì)量濃度y (mg/mL)與吸光度值A(chǔ)的回歸方程：Y=0.033A該方程的相關(guān)系數(shù)r=0.9994[6]。

2.2 樣品處理

林下參干根樣品干燥，破碎機粉碎后過0.425 mm篩，按每40 mL加入1 g干粉的比例加入CHCl3，回流3 h后進行脫脂把溶劑回收，剩下的樣品殘渣揮干溶劑后備用。

2.3 人參皂苷提取

精確稱取林下參干粉末0.5 g，按實驗設(shè)計加入溶劑后封口搖勻，在經(jīng)過高壓處理后，用離心機4000 r/min離心后取上清液，測量吸光度(A)值。

樣品測定：精確量取處理好的樣品0.2 mL,測吸光值A(chǔ)，并計算林下參皂苷提取收率Y(%)。

Y(%)=0.0198×A×(V/V1)×(1/m) ×100

其中：A為吸光度值，V為提取液總體積，V1為檢測時所取溶液體積，m為人參樣品質(zhì)量。

2.4 單因素試驗及結(jié)果

2.4.1 溶劑的選擇。稱取4份處理后的樣品，每份0.5 g，分別加入25 mL的水、水飽和CH3(CH2)3OH、CH3OH、50%CH3CH2OH后封口搖勻，調(diào)整壓力為500 MPa，保壓2 min，用離心機4000 r/min離心后取上清液，測量吸光度(A)值，結(jié)果見(表1)。

表1 超高壓提取林下參皂苷的不同溶劑選擇

為了高速、高效提取林下參皂苷，選好一種適合的溶劑很重要，這樣可以減少雜質(zhì)含量，目前常用的提取溶劑有水、正丁醇、甲醇、乙醇等，它們對人參皂苷的溶出率各不相同，所采取的工藝條件也存在一定差異。由于乙醇提取率高、無毒害、方便回收等突出優(yōu)點，所以選擇乙醇作為超高壓提取林下參皂苷的溶劑。

2.4.2 溶劑體積分數(shù)的選擇。首先用50%的乙醇配置出體積分數(shù)為10%、20%、30%、70%、90%的溶劑，稱取5份處理后的樣品，每份0.5 g，分別加入25 mL的不同體積分數(shù)的溶劑，封口搖勻，調(diào)整壓力為500 MPa，保壓2 min，取上清液離心測定A值，結(jié)果見(表2)。

表2 超高壓提取林下參皂苷的乙醇體積分數(shù)的選擇

在乙醇溶劑體積分數(shù)在10%～70%之間時，溶劑體積分數(shù)大小與人參皂苷的提取得率成正比。而當溶劑體積分數(shù)為90%時，人參皂苷的提取收率有了明顯的降低。

2.4.3 固液比的選擇。用70%乙醇按固液比1∶10、1∶25、1∶50、1∶75、1∶100分別配置溶液，稱取5份處理后的樣品，每份0.5 g，分別加入,封口搖勻，在經(jīng)過500 MPa高壓、保壓2 min處理后，用離心機4000 r/min離心后取上清液，測量吸光度(A)值，結(jié)果見(表3)。

由表3分析，隨著固液比的變化，林下參皂苷的提取率也在發(fā)生變化它的得率是逐漸穩(wěn)步提高的。從實驗角度出發(fā)，將固液比范圍選定為為1∶25～1∶75之間，能夠更好的提取有效成分，經(jīng)濟性也更合理。

表3 超高壓提取林下參皂苷的不同固液比的選擇

2.4.4 壓力的選擇。稱取5份處理后的樣品，每份0.5 g，分別抽取25 mL固液比為1∶100的70%乙醇，封口后搖勻，分別在壓力100、200、300、400、500、600 MPa的壓力處理下，保壓2 min、離心機4000 r/min離心取上清液，測定A值，結(jié)果見(表4)。

表4 超高壓提取林下參皂苷的不同壓力得率比較選擇

壓力對超高壓提取林下參皂苷的影響因子很大，從表4可見，壓力在100～500 MPa之間時，提取壓力與提取率呈線性正相關(guān)關(guān)系，當壓力超過600 MPa時，提取收率緩慢降低。所以，確定最佳壓力范圍100～500 MPa之間。

2.4.5 提取時間的選擇。在林下參皂苷超高壓提取的時間中，所需提取時間也是一個重要因子。在實驗條件一致下，實驗結(jié)果見(圖1)。

圖1 不同提取時間對提取收率的影響

通過圖1可以看出，林下參皂苷的提取率和提取時間的長短之間并無明顯正相關(guān)線性關(guān)系，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是提取過程中壓力較高，外部溶劑能夠迅速透過細胞壁進入到細胞里。

2.5 單因素試驗及結(jié)果

試驗參照陳瑞戰(zhàn)等[5]的實驗進行了單因素的實驗，結(jié)果表明，得到了超高壓提取林下參皂苷的合適溶劑為乙醇、溶劑濃度范圍、提取壓力范圍100～500 MPa、固液比1∶25～1∶75、保壓時間1～2 min。

2.6 正交試驗結(jié)果分析

在單因素實驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9(34)正交實驗(見表5、表6)。

表5 因素水平表

表6 L9(34)正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果

由表6可以得出，3種因素對人參皂苷提取率的影響依次為A>B>C，即提取壓力對人參皂苷提取率有極顯著影響，而溶劑體積分數(shù)和固液比對人參皂苷提取率的影響不明顯。結(jié)果表明，三種因素的優(yōu)化組合為 A3B2C3，即伊春林下參皂苷超高提取技術(shù)工藝及條件為提取壓力500 MPa、溶劑體積分數(shù)為50%、固液比1∶75、提取時間2 min，在優(yōu)化條件下，提取林下參皂苷收率最高。經(jīng)進一步試驗驗證，按優(yōu)化條件提取人參皂苷，測得提取率高達7.61%。

3 結(jié)論

在常溫下使用超高壓提取林下參皂苷是一個新興的提取工藝，能夠很好的減少高熱對皂苷結(jié)構(gòu)的影響。通過優(yōu)化試驗，在提取壓力達到500 MPa、料液比在1∶75的比例下、溶劑為濃度50%的乙醇時，林下參皂苷的提取得率最高可達到7.61%，林下參皂苷技術(shù)優(yōu)化也為森林食品天然產(chǎn)物有效成分的提取開拓了一種新的工藝。它打破了很多傳統(tǒng)提取手段的瓶頸，具有很多突出的優(yōu)點，因為在采用超高壓提取皂苷的整個過程中是封閉的，沒有溶劑揮發(fā)，能耗低、所以綠色環(huán)保，該方法用時短，簡易環(huán)保、適合用于人參皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)，可為目前其他熱門森林食品的天然產(chǎn)物活性成分提取提供參考。