益生菌協(xié)同蒲公英發(fā)酵對(duì)其抗氧化功能的促進(jìn)作用

Seyitmammedov Eziz，張智*，蔣士龍，解慶剛

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱150000；2.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，黑龍江齊齊哈爾161000)

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)是菊科(Asteraceae)多年生草本植物，是我國(guó)常見的藥食兩用植物，在世界范圍內(nèi)廣泛分布[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)有70種蒲公英，其中藥用蒲公英27種，最常見的是生長(zhǎng)在內(nèi)蒙古、東北等地的6種蒲公英[4]。蒲公英含有黃酮類、酚類、生物堿、萜類等多種生物活性成分，具有保護(hù)肝臟、利尿、抗癌、抗炎和抗氧化等特性[5-6]。蒲公英及其提取物，天然安全有效，廣泛用于治療肝臟疾病、胃腸道疾病、骨關(guān)節(jié)炎、癌癥、眼病等疾病[7]。

研究表明，微生物發(fā)酵可以提高植物中生物活性物質(zhì)提取率[8-10]。微生物可以分解植物細(xì)胞中的纖維素、木質(zhì)素等大分子物質(zhì)，破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而更有效地提取植物中的活性物質(zhì)，提高生物利用度[11]。固體發(fā)酵是蒲公英的增值和利用的一種獨(dú)特工藝方法，與液態(tài)發(fā)酵相比固態(tài)發(fā)酵具有成本低、產(chǎn)后續(xù)處理簡(jiǎn)單和產(chǎn)率高等優(yōu)勢(shì)。目前，微生物發(fā)酵技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物中活性物質(zhì)的提取，而利用固態(tài)發(fā)酵法提取蒲公英中黃酮類化合物研究報(bào)道較少。

黃酮類化合物是一大類植物次生代謝產(chǎn)物，具有清除自由基和參與抗氧化反應(yīng)的能力，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[12-13]，可用于治療人體免受慢性疾病[14]和炎癥性疾病[15]。研究蒲公英經(jīng)固態(tài)發(fā)酵處理后，黃酮類化合物的含量及抗氧化活性的變化，為固態(tài)發(fā)酵蒲公英的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒲公英,市售；益生菌制劑,東北林業(yè)大學(xué)食品發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保藏；1，2-二苯基代苦味肼基自由基(DPPH)Sigma公司；硫酸、苯酚、95% 乙醇、瓊脂、MRS 液體培養(yǎng)基成分等試劑，均為分析純。

立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)安泰公司；GL-20B型全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī),湘西儀器儀表總廠機(jī)械儀器廠；上海精密科學(xué)儀器廠；PHS-3C型精密pH計(jì) 上海恒磁電子科技有限公司；UV-5500PC紫外可見分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng)

1.2.1.1 菌種活化:將斜面保存的益生菌制劑接種到種子培養(yǎng)基(MRS液體培養(yǎng)基)中，120 r/min，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，重復(fù)活化 2 次，備用。

1.2.1.2 菌懸液的制備:將活化的益生菌制劑，以1%的量再次接種入滅菌后 MRS 液體培養(yǎng)基中，使益生菌制劑處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，然后分裝于50 mL無(wú)菌離心管中，4 ℃離心(10000 r/min，10 min)，棄去上清液。將益生菌制劑細(xì)胞稱重后按照1∶1的比例加入滅菌生理鹽水(0.9%的濃度)，振蕩混勻后，制成益生菌制劑的菌懸液。

1.2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng):將益生菌制劑菌懸液按10%接種量接種至蒲公英粉末中，含水比為1∶3，35 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 碳源種類對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液按10%接種量接種至蒲公英粉末中，含水比為1∶3，分別加入2.5%的蔗糖、葡萄糖、乳糖，在35 ℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分別測(cè)定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.2.2 蔗糖添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液按10%接種量接種至蒲公英粉末中，在含水比為1∶3，發(fā)酵溫度35 ℃的條件下，分別加入0、2.5%、5%、7.5%、10%的蔗糖，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分別測(cè)定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.2.3 含水比對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液按10%接種量接種至蒲公英粉末中，加入2.5%的蔗糖，在含水比分別為1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1:4的條件下，在35 ℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分別測(cè)定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.2.4 接菌量對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液分別按10%、15%、20%、25%、30%接種量接種至蒲公英粉末中，加入2.5%的蔗糖，在含水比為1∶2.5條件下，在35 ℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分別測(cè)定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.2.5 發(fā)酵溫度對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液按25%接種量接種至蒲公英粉末中，加入2.5%的蔗糖，在含水比分別1∶2.5，發(fā)酵溫度分別為32、35、37、40、43℃的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分別測(cè)定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液按25%接種量接種至蒲公英粉末中，加入2.5%的蔗糖，在含水比分別1∶2.5，在35 ℃條件下，分別發(fā)酵培養(yǎng)12、18、24、30、36 h的條件下。分別測(cè)定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用 Box-Behnken(BBD)中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇接菌量(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、發(fā)酵溫度(C)、含水比(D)為自變量，以活菌數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)表 1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

1.2.4 DPPH 自由基清除率[16]

采用95%的乙醇溶液DPPH粉末，配制成0.2 mmol/L的溶液。取樣液2 mL與2 mL的DPPH溶液混合搖勻，室溫下避光放置30 min后，于517 nm下測(cè)吸光值，記為A樣品；用95%的乙醇代替DPPH溶液，同樣條件下室溫避光放置30 min后，于517 nm下測(cè)吸光值，記為A空白；管以95%的乙醇代替樣品，于517nm下測(cè)吸光值，記為A對(duì)照。

式中：A樣品為樣液加DPPH的吸光度值；A對(duì)照為樣液加乙醇溶液的吸光度值；A空白為DPPH加乙醇溶液的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

碳源是微生物發(fā)酵過(guò)程中重要的營(yíng)養(yǎng)成分之一，蔗糖、葡萄糖、乳糖是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中常用的碳源[17]。乳酸菌代謝的糖類的種類和數(shù)量不同，其產(chǎn)酸量也不同，蒲公英中低聚糖含量較少，不利于益生菌制劑生長(zhǎng)與產(chǎn)酸，所以需要補(bǔ)充一定的碳源。如圖1所示。在蒲公英固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中添加2.5%蔗糖，更有利益于益生菌制劑的生長(zhǎng)。

圖1 碳源對(duì)固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.2 蔗糖添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

蔗糖作為乳酸菌發(fā)酵的有效碳源，可以促進(jìn)益生菌。由圖2可知，發(fā)酵液中的活菌數(shù)，呈先增加后下降的趨勢(shì)。在蔗糖添加量在2.5%時(shí)，發(fā)酵液中活菌數(shù)含量最高。因此選取2.5%為單因素中蔗糖最佳添加量。

圖2 蔗糖添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.3 料水比對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

由圖3可知，發(fā)酵液中的活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)基含水比例為1∶2.5時(shí)活菌數(shù)含量最高，此后有所降低。原因可能是在固體發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基含水量過(guò)低，不能滿足其生長(zhǎng)繁殖的需要，而含水量高導(dǎo)致培養(yǎng)基中溶解氧不足，影響新陳代謝[18]。因此選取1∶2.5為單因素中最佳培養(yǎng)基最佳水料比。

圖3 料水比對(duì)固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.4 接菌量對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

由圖4可知，當(dāng)蒲公英固態(tài)發(fā)酵的接菌量在10%～25%，發(fā)酵液活菌數(shù)隨著接菌量的增加而增加，接種量為25%時(shí)活菌數(shù)最高，接種量大于25%時(shí)活菌數(shù)開始下降。接菌量濃度低時(shí)，活菌數(shù)少，發(fā)酵緩慢。當(dāng)接菌量過(guò)大，抑制了菌體生長(zhǎng)，導(dǎo)致活菌數(shù)降低。因此選取接菌量為25%，為單因素中最佳培養(yǎng)基最佳接菌量。

圖4 接菌量對(duì)固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

由圖5可知，隨著蒲公英固態(tài)發(fā)酵的進(jìn)行，在12～24 h時(shí)發(fā)酵液中的活菌數(shù)不斷增加，在24 h增長(zhǎng)達(dá)到了最高點(diǎn)，活菌數(shù)為3.25×108cfu/mL，發(fā)酵時(shí)間超過(guò)24 h后，活菌數(shù)顯著下降。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵底物中碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少影響了益生菌制劑的生長(zhǎng)。因此選取發(fā)酵時(shí)間24 h，為單因素中最佳培養(yǎng)基最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.6 發(fā)酵溫度對(duì)固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在32～37 ℃時(shí)，發(fā)酵液中的活菌數(shù)隨著溫度的增加不斷增加，在37 ℃時(shí)，增長(zhǎng)達(dá)到了最高點(diǎn)，活菌數(shù)為3.2×108cfu/mL，發(fā)酵溫度超過(guò)37 ℃后，隨著發(fā)酵溫度的上升，活菌數(shù)顯著下降。因此選取發(fā)酵溫度為37 ℃，為單因素中最佳培養(yǎng)基最佳發(fā)酵溫度。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.7 蒲公英固態(tài)發(fā)酵響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)及其優(yōu)化

采用響應(yīng)面法優(yōu)化提高蒲公英固態(tài)發(fā)酵活菌數(shù)，按照表1的設(shè)計(jì)方案利用Design-Expert 8.0.5設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)及其測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù)表2

對(duì)表2中的發(fā)酵蒲公英活菌數(shù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接菌量、含水量對(duì)蒲公英固態(tài)發(fā)酵DPPH清除率的二次回歸方程模型為：

Y=+3.5-0.055A+0.049B+0.10C-0.041D-0.15AB-0.19AC+0.048AD+0.050BC+0.098BD-0.12CD-0.63A2-0.46B2-0.59CC-0.57D2

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

續(xù)表3

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面圖形，分析各因素間的交互作用。圖7為接菌量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、料水比對(duì)蒲公英固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物DPPH清除率影響的3D曲面圖和等高線圖。3D曲面開口向下，傾斜程度大，等高線為橢圓形，表明兩個(gè)因素之間交互作用顯著，表明四個(gè)因素的交互作用影響顯著，并且存在一個(gè)最優(yōu)值。響應(yīng)面優(yōu)化模型預(yù)測(cè)結(jié)果：接菌量為24.48%，發(fā)酵時(shí)間為24.61 h，發(fā)酵溫度為37.95 ℃，含水1∶2.56，為操作方便將最優(yōu)條件修正為接菌量24%，發(fā)酵時(shí)間25 h，發(fā)酵溫度38 ℃，料水比1∶2.6。

圖7 各因素間交互作用的響應(yīng)曲面圖

2.8 驗(yàn)證性試驗(yàn)

蒲公英固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物活菌數(shù)的理論值為3.16×109cfu/mL，DPPH清除率理論值為91.59%。在響應(yīng)面優(yōu)化獲得的最佳發(fā)酵條件下，進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，活菌數(shù)的實(shí)際結(jié)果為2.98×109cfu/mL，此時(shí)DPPH為清除率90.7%，與理論值分別相差6%、0.9%，說(shuō)明此模型可靠。

2.9 蒲公英固態(tài)發(fā)酵前后生物活性物質(zhì)含量變化

微生物發(fā)酵能夠破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有效促進(jìn)黃酮類化合物的釋放[19-20]。如圖8所示，益生菌制劑發(fā)酵對(duì)蒲公英黃酮含量有顯著提高(P<0.05)，發(fā)酵后蒲公英黃酮含量達(dá)98.70 mg/g，是發(fā)酵前蒲公英黃酮含量(35.96 mg/g)的2.74倍，說(shuō)明經(jīng)過(guò)益生菌制劑發(fā)酵可以顯著提高蒲公英黃酮含量。

圖8 蒲公英固態(tài)發(fā)酵前后中黃酮含量變化

3 討論

近年來(lái)，微生物發(fā)酵被廣泛應(yīng)用于提高植物中生物活性物質(zhì)產(chǎn)量，通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的各種酶，包括脂肪酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶和淀粉酶，促進(jìn)從底物中釋放或合成生物活性化合物[21-22]。目前，大多數(shù)益生菌產(chǎn)品都是液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量廢水，需要收集細(xì)菌，且操作復(fù)雜。相對(duì)于液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵環(huán)境中水活度低，微生物易于生長(zhǎng)，酶活度高，酶系統(tǒng)豐富。微生物的固態(tài)發(fā)酵受多種因素的影響，如接種量、溫度、時(shí)間、含水量等[23]。因此，本文采用益生菌制劑對(duì)蒲公英進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件，最大限度地提高蒲公英中黃酮類化合物的含量和抗氧化活性。

微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中氮源用于菌體蛋白及核酸的合成，碳源用于為微生物生長(zhǎng)提供能源物質(zhì)[24-25]。在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，添加適宜的氮、碳源的能促進(jìn)菌體快速生長(zhǎng)并提高產(chǎn)物的合成速度。本文通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)微生物發(fā)酵常用碳源進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)添加2.5%的葡萄糖，更有利于益生菌制劑的生長(zhǎng)，此條件下發(fā)酵產(chǎn)物中的活菌數(shù)含量最高。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種量24%、接種量24%，發(fā)酵時(shí)間25 h，發(fā)酵溫度38 ℃，料水比1∶2.6。在此條件下活菌數(shù)為2.98×109cfu/mL，此時(shí)DPPH為清除率90.7%，比優(yōu)化前提高1.28倍。

黃酮類化合物是一大類植物次生代謝產(chǎn)物[26]，是人類和動(dòng)物飲食中不可或缺的一部分，具有清除自由基和參與抗氧化反應(yīng)的能力[27-29]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蒲公英經(jīng)過(guò)固態(tài)發(fā)酵后，具有更強(qiáng)的抗氧化活性，DPPH自由基清除率較未發(fā)酵蒲公英，提高了2.74倍。研究表明，微生物發(fā)酵會(huì)提高黃酮產(chǎn)量及抗氧化活性。郝紅梅等[30]采用酵母菌發(fā)酵黃芪藥材，黃酮產(chǎn)率與未發(fā)酵組比較提高了18%。閻欲曉等[31]利用米曲霉和黑曲霉進(jìn)行混合菌種固態(tài)發(fā)酵甘蔗葉，測(cè)定發(fā)酵甘蔗葉中黃酮和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)比未發(fā)酵甘蔗葉提高了50.72%和50.62%，并且抗氧化活性得到提高。

4 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面優(yōu)化，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：蔗糖添加量2.5%、接種量24%、接種量24%，發(fā)酵時(shí)間25 h，發(fā)酵溫度38 ℃，料水比1∶2.6。在此條件下活菌數(shù)為2.98×109cfu/mL，此時(shí)DPPH為清除率90.7%，比優(yōu)化前提高1.28倍。經(jīng)過(guò)益生菌制劑發(fā)酵后，蒲公英黃酮含量較未發(fā)酵蒲公英提高了2.74倍，試驗(yàn)為固態(tài)發(fā)酵工藝對(duì)蒲公英開發(fā)利用提供了一定理論依據(jù)。