6-磷酸-海藻糖對普通菜豆籽粒產(chǎn)量和鐮孢菌枯萎病抗性的影響

薛仁風，黃宇寧，姜 珊，趙 陽，陳 劍，葛維德

（1. 遼寧省農(nóng)業(yè)科學院 作物研究所，遼寧 沈陽 110161；2. 中共遼寧省委黨校（遼寧行政學院/遼寧省社會主義學院），遼寧 沈陽 110004）

普通菜豆（Phaseolus vulgarisL.）是世界上種植面積最大的食用豆類，產(chǎn)量約占全球食用豆類總產(chǎn)量的50%，特別是在非洲和美洲的部分地區(qū)更是作為一種重要的食物來源被廣泛種植[1-3]。產(chǎn)量和抗病性是普通菜豆育種中最受育種家關注的2 個要素，其中籽粒產(chǎn)量性狀是影響普通菜豆生產(chǎn)潛力的重要因素。尖鐮孢菌菜豆?；停‵usarium oxysporumf. sp.phaseoli，F(xiàn)op）引起的普通菜豆鐮孢菌枯萎?。‵usariumwilt）也是造成普通菜豆嚴重減產(chǎn)的重要原因[4]。因此，探索協(xié)同調控普通菜豆產(chǎn)量和枯萎病抗性方法與機制對于菜豆高產(chǎn)高抗品種的選育與種質創(chuàng)新具有重要的研究價值。

糖分子是調控植物生長發(fā)育、產(chǎn)量、籽粒性狀和抗性的重要信號分子之一。6-磷酸-海藻糖（T6P）作為維持糖穩(wěn)態(tài)的核心激素，參與調控植物的生長發(fā)育與逆境響應等生理過程[5]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，植物T6P具有類似動物胰島素的功能，可通過促進源-庫轉運等形式反饋調節(jié)糖水平[6]。在玉米中異源表達水稻6-磷酸-海藻糖磷酸酶基因OsTPP1可直接提升9%～49%的產(chǎn)量[7]。直接噴施可吸收的T6P 前體亦可使小麥增產(chǎn)20%[8]。2022年，張健研究員團隊與胡培松院士團隊合作首次揭示了T6P 調控水稻碳源分配與籽粒產(chǎn)量的機制，研究結果表明，T6P具有極大地改良作物產(chǎn)量的潛力，為作物高產(chǎn)遺傳改良提供了新思路[9]。在糖分子調控植物抗病性研究方面，前人研究結果表明，噴施外源海藻糖（Tre）能夠引起植物T6P 含量積累[10]，植物體內積累的Tre 很大程度是由T6P 水解產(chǎn)生，而Tre 作為一種內源性保護劑，參與植物對生物或非生物脅迫的響應。植物病原體在侵染寄主的過程中誘導植物細胞內積累大量的Tre。蕓苔瘧原蟲（Plasmodiophora brassicae）侵染擬南芥引起Tre 在根和下胚軸中迅速積累，蕓苔瘧原蟲的感染導致擬南芥體內海藻糖酶基因表達顯著增強，并且根和下胚軸中海藻糖酶活性也明顯升高[11]。直接噴施Tre 即可誘導小麥幾丁質酶、病程相關蛋白、草酸氧化酶活性的增加，經(jīng)過Tre 預處理的小麥白粉病的發(fā)病比例明顯低于對照，這證明施用外源Tre 可以誘導小麥對白粉病原菌（Blumeria graminis）的抗性[12]。此外，Tre 預處理能增強煙草對普通花葉病的抗性，誘導煙草葉片中過氧化氫和脯氨酸含量、防御酶活性與抗病基因表達水平顯著提升[13]。雖然目前已有大量研究證明，Tre 及其衍生物參與植物對生物逆境的響應，但有關T6P 是否能夠協(xié)同影響作物生長和抗病性的研究還較為缺乏。

Tre 及其衍生物廣泛參與植物生長發(fā)育與逆境響應等生理過程。T6P既是調控植物籽粒產(chǎn)量的糖代謝信號分子，同時也是合成調控植物產(chǎn)量和抗病性的重要信號分子Tre 的重要前體。目前，普通菜豆產(chǎn)量和枯萎病抗性協(xié)同調控的機制研究在世界范圍內尚屬空白，同時也是普通菜豆研究領域中亟待解決的重要科學難題。鑒于此，通過外源施用T6P 的方法，探索海藻糖代謝途徑對普通菜豆籽粒產(chǎn)量特性、可溶性糖含量、光合生理指標及鐮孢菌枯萎病抗性的影響，為闡明如何利用海藻糖代謝途徑關鍵因子改良作物的產(chǎn)量和抗病性等核心科學問題提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

普通菜豆品種龍飯豆1 號（編號：F0003346）和紅蕓豆（編號：F0002514）由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所提供，均屬感病基因型。將2 個基因型的菜豆種子播種于遼寧省農(nóng)業(yè)科學院試驗田，每個小區(qū)10 m2作為一個重復，每個處理各3 個重復，用于調查菜豆籽粒產(chǎn)量相關性狀；將紅蕓豆種子播種于滅菌的營養(yǎng)土中，23～28 ℃條件下，每日補充12 h光照，用于枯萎病抗性研究。供試病原菌株為尖鐮孢菌菜豆專化型FOP-DM01 菌株，保存于遼寧省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所。

1.2 激素處理與病原菌接種

激素處理參照GRIFFITHS 等[14]的方法。普通菜豆幼苗采用噴霧法處理，以蒸餾水作為溶劑，配制1 mmol/L 6-磷酸-海藻糖溶液（T6P），噴施蒸餾水作為對照。在菜豆開花后每隔5 d 噴灑整株植物1次，至植株進入成熟期為止；準備7 日齡的菜豆幼苗，每日噴1 次1 mmol/L T6P，連續(xù)處理7 d，用于接種病原菌，接種方法參照XUE 等[15]的方法。發(fā)病級別調查參考普通菜豆枯萎病1～9 級的病情分級標準［16］。

1.3 糖含量測定

在普通菜豆成熟期采集植株葉片，每個處理取3 次生物學重復；將采集樣品置于-20 ℃條件下保存，用于糖類物質含量的檢測。海藻糖含量測定參考LI 等[9]的方法；葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉含量的測定參考XUE等[17]的方法。

1.4 光合生理指標測定

在普通菜豆植株進入成熟期后，檢測植株葉片葉綠素總含量、凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率，每個處理取3次生物學重復，測定不同重復小區(qū)不同植株同一位置的10 張葉片。葉綠素總含量檢測方法參考薛仁風等[18]的方法；凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率采用GB-1102便攜式光合蒸騰儀進行測定。

1.5 植物防御反應關鍵因子與防御基因表達量的測定

分別在接種0、24、48 h 后的菜豆植株根部取樣，每個處理取3 次生物學重復；將采集樣品置于-80 ℃條件下保存，用于過氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙氨酸解氨酶（PAL）活性和過氧化氫（H2O2）含量等防御反應因子的檢測，參考XUE等[17]的方法。

采 用SuperRealPreMix（SYBR Green，TianGen，中國）熒光定量PCR 試劑盒和qTOWER 2.2 實時定量PCR 儀（Analytikjena，德國），以各個取樣時間點的cDNA 為模板分析PR1、PR2、PR5等防御基因表達情況，以普通菜豆的Actin基因作為內參，反應體系與程序參照試劑說明，檢測引物序列設計如表1。每個取樣時間點設3 個生物學重復，采用2-ΔΔCT法確定基因的相對表達量。

表1 引物序列設計Tab.1 Primer sequence designment

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，采用Excel 軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 外源6-磷酸-海藻糖對普通菜豆籽粒產(chǎn)量的影響

從表2 可以看出，在T6P 誘導條件下，龍飯豆1號的單株莢數(shù)略有升高，但相比對照不顯著，而單莢粒數(shù)、百粒質量和產(chǎn)量均顯著增加，分別達到4.5粒、42.7 g 和2 250.5 kg/hm2；而紅蕓豆的單株莢數(shù)、單莢粒數(shù)、百粒質量和產(chǎn)量均明顯提高，分別達到25.1個、5.3粒、43.2 g和2 549.6 kg/hm2。表明T6P激發(fā)了普通菜豆籽粒產(chǎn)量潛力，提升了籽粒產(chǎn)量相關性狀（圖1）。

表2 外源6-磷酸-海藻糖對普通菜豆籽粒性狀的影響Tab.2 The effect of 6-phosphate-trehalose on the seed characteristics of common beans

圖1 外源6-磷酸-海藻糖對普通菜豆籽粒表型的影響Fig.1 The effect of exogenous 6-phosphate-trehalose on the seed phenotype of common beans

2.2 外源6-磷酸-海藻糖對普通菜豆可溶性糖含量的影響

由表3 可以看出，在T6P 誘導條件下，龍飯豆1號和紅蕓豆葉片中海藻糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉含量均顯著高于對照，其中，紅蕓豆海藻糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉水平最高，分別達37.4 nmol/g、4.3μmol/g、5.5μmol/g、3.6μmol/g。龍飯豆1號果糖含量最高，達到8.4μmol/g。表明T6P激活了普通菜豆葉片可溶性糖分子的合成，提升了植株糖類化合物的儲備。

表3 外源6-磷酸-海藻糖對普通菜豆可溶性糖含量的影響Tab.3 The effect of 6-phosphate-trehalose on the soluble sugar content of common beans

2.3 外源6-磷酸-海藻糖對普通菜豆光合生理指標的影響

由表4 可以看出，在T6P 誘導條件下，龍飯豆1號和紅蕓豆葉片中葉綠素總含量略有升高，但變化并不明顯。凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率均明顯提升，其中龍飯豆1 號凈光合速率、胞間CO2濃度和蒸騰速率最高，分別達到18.6、249.6、6.5 μmol/（m2·s）。紅蕓豆氣孔導度最大，達0.57 μmol/（m2·s）。表明T6P 促進普通菜豆葉片光合作用，為碳水化合物合成與積累奠定基礎。

表4 外源6-磷酸-海藻糖對普通菜豆光合生理指標的影響Tab.4 The effect of 6-phosphate-trehalose on the photosynthetic physiological indicators of common beans

2.4 外源6-磷酸-海藻糖對普通菜豆抗病性的影響

接種病原菌14 d 后，1 mmol/L T6P 處理的普通菜豆紅蕓豆（感病材料）植株對枯萎病原菌抗性明顯增強；接種病原菌28 d 后，對照植株完全枯萎、死亡，而經(jīng)過T6P 溶液處理的植株發(fā)病級別顯著低于對照植株，發(fā)病級別僅為4.2（圖2）。

圖2 外源6-磷酸-海藻糖對普通菜豆枯萎病抗性的影響Fig.2 The effect of exogenous 6-phosphate-trehalose on the resistance of common beans to Fusarium wilt

2.5 外源6-磷酸-海藻糖對植物防御反應因子的影響

接種病原菌24 h 后，T6P 誘導的紅蕓豆根中重要防御因子POD 活性、SOD 活性、PAL 活性和H2O2含量均顯著提升（圖3）；接菌48 h后，菜豆根中防御因子活性或含量達到最高，POD 活性、SOD 活性和PAL 活性分別達到78.3、32.9、0.054 nk at/mg，H2O2含量達到0.33 ng/mg。植物防御因子的激活顯著提升了寄主對枯萎病原菌的抗性。

圖3 外源6-磷酸-海藻糖對普通菜豆防御因子的影響Fig.3 Effects of exogenous 6-phosphate-trehalose on the defense factors of common beans

2.6 外源6-磷酸-海藻糖對植物防御基因表達量的影響

防御基因表達量檢測結果表明，接種病原菌后，外源噴施T6P菜豆根中PR1、PR2、PR5基因相對表達量顯著提升，接種48 h后，3個防御基因的相對表達量達到最高，分別為接種0 h 基因表達量的8.3、13.2、9.4 倍（圖4）。植物防御基因表達量的升高，激活了寄主抗病性相關反應，提升了菜豆對枯萎病原菌侵染的抗性。

圖4 外源6-磷酸-海藻糖對普通菜豆防御基因表達的影響Fig.4 The effect of exogenous 6-phosphate-trehalose on the defense gene expression of common beans

3 結論與討論

作物病害嚴重影響作物生長，造成產(chǎn)量損失，并威脅糧食安全?？共⌒詮姷淖魑锲贩N可以有效地控制病害，然而高抗性經(jīng)常以“犧牲”產(chǎn)量為代價[19-20]。因此，研發(fā)協(xié)同調控產(chǎn)量和抗病性的作物化控調節(jié)劑對于保障糧食作物安全生產(chǎn)具有重要意義。籽粒產(chǎn)量與鐮孢菌枯萎病抗性協(xié)同調控的研究一直是普通菜豆研究領域的熱點和難點，研究一種既能提升菜豆產(chǎn)量，又能增加其枯萎病抗性的方法對普通菜豆生產(chǎn)的提質增效具有重要作用。

前人研究表明，T6P 在植物生長發(fā)育過程中充當一種關鍵的調控信號，可作為碳代謝的調控器以及光合能力的增強劑[21-22]。本研究結果表明，T6P誘導普通菜豆葉片中葉綠素總含量、凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率提升，這說明T6P能夠促進普通菜豆葉片光合作用，促進碳水化合物合成與積累，研究結果與前人研究十分相似。外源噴施T6P 前體后小麥籽粒產(chǎn)量明顯增加，增產(chǎn)幅度可達20%[8]。在日本晴、南粳46 和育種材料中水01三個水稻材料中過表達糖誘導表達轉錄因子OsNAC23，顯著提高了植株T6P 含量，相較于野生型，轉 基 因 植 株 產(chǎn) 量 提 升 8.7%～16.1%[9]。SCHLUEPMANN 等[10，23]的研究表明，T6P 作為信號分子能與其他信號途徑根據(jù)環(huán)境狀況協(xié)同調節(jié)植物的生長發(fā)育。本研究結果表明，在T6P 誘導條件下，普通菜豆的單株莢數(shù)、單莢粒數(shù)、百粒質量和產(chǎn)量均明顯提高，這些性狀是影響菜豆籽粒產(chǎn)量的重要因素，是決定普通菜豆產(chǎn)量的關鍵指標，這說明T6P 提升了籽粒產(chǎn)量相關性狀，激發(fā)了普通菜豆籽粒產(chǎn)量潛力，研究結果與前人一致。此外，菜豆葉片中糖類物質含量在T6P 誘導下也顯著高于對照，這表明T6P激活了普通菜豆葉片可溶性糖分子的合成，提升了植株糖類化合物的儲備，這可能也是促進菜豆籽粒產(chǎn)量提升的重要途徑之一。

T6P 除參與調控植物生長發(fā)育過程外，還是植物響應脅迫的重要信號分子，在植物調控自身生長發(fā)育和抗性反應過程中均發(fā)揮重要作用[5]。TAYEH等[12]研究表明，外源Tre 能夠誘導小麥PAL 和POD活性提高，增強小麥葉片表皮細胞中的乳突沉積，顯著提升小麥對白粉病原菌的抗性。本研究表明，T6P 誘導菜豆抗病性顯著增強，接菌28 d 后發(fā)病級別僅為4.2，寄主根中POD、SOD、PAL 活性和H2O2含量顯著提升，防御基因PR1、PR2、PR5相對表達量也迅速升高，這表明T6P 激活了寄主對鐮孢菌枯萎病的防御相關反應，提升了普通菜豆的抗病性，研究結果與前人很相似。

綜上，噴施外源T6P 溶液能夠顯著提升普通菜豆籽粒產(chǎn)量的相關性狀，誘導普通菜豆葉片可溶性糖類物質的合成，增加植株碳水化合物的儲備，提高植株光合效率，促進合成營養(yǎng)物質并轉運至籽粒，同時T6P 激活普通菜豆鐮孢菌枯萎病抗性相關反應，提升寄主抗病性。本研究為普通菜豆籽粒產(chǎn)量和鐮孢菌枯萎病抗性的協(xié)同調控理論研究奠定了堅實的基礎，對提升我國普通菜豆產(chǎn)量和抗性水平有重要意義，但目前對于T6P 參與調控的相關機制還不清楚，有待進一步深入研究。