雞Wnt3a的SNPs篩選及其與皮膚毛囊密度性狀關(guān)聯(lián)分析

屠云潔，姬改革，章明，劉一帆，巨曉軍，單艷菊，鄒劍敏，李華，陳智武，束婧婷

雞的SNPs篩選及其與皮膚毛囊密度性狀關(guān)聯(lián)分析

屠云潔1，姬改革1，章明1，劉一帆1，巨曉軍1，單艷菊1，鄒劍敏1，李華2，陳智武3，束婧婷1

1江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225125；2佛山科技學(xué)院，廣東佛山 528225；3廣西金陵農(nóng)牧集團(tuán)有限公司，南寧 530000

【目的】Wnt信號(hào)通路在動(dòng)物皮膚毛囊的發(fā)生發(fā)育中具有重要作用，前期研究結(jié)果表明可能是影響雞皮膚毛囊密度性狀的重要候選基因。為進(jìn)一步驗(yàn)證在皮膚毛囊生長發(fā)育中的作用，研究以金陵花雞為研究對象，篩選SNPs，并分析其與毛囊密度性狀的相關(guān)性，以期找到對皮膚毛囊密度有顯著影響的分子標(biāo)記，為培育屠體美觀的屠宰型肉雞的“分子編寫育種”提供參考?！痉椒ā坎捎肞CR擴(kuò)增直接測序法對的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行篩查，分析單個(gè)SNP標(biāo)記與皮膚毛囊密度性狀的相關(guān)性。采用Haploview軟件分析這些SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡（LD）程度，并分析不同單倍型組合與毛囊密度性狀的相關(guān)性。【結(jié)果】共發(fā)現(xiàn)14個(gè)SNP位點(diǎn)，在第2外顯子發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)（SNP1），為同義突變；第2內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變位點(diǎn)（ SNP2—SNP5），在第3內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNP位點(diǎn)（SNP6—SNP14）?？ǚ綑z驗(yàn)表明，第2外顯子的1個(gè)突變位點(diǎn)（SNP1）和第2內(nèi)含子的3個(gè)突變位點(diǎn)（SNP3—SNP5）的3個(gè)位點(diǎn)均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（＞0.05），第3內(nèi)含子的9個(gè)SNPs（SNP6-SNP14）偏離哈代-溫伯格平衡（＜0.05）。SNP1—SNP5的均小于0.50，均小于0.25，這5個(gè)SNP位點(diǎn)遺傳多樣性較低。第3內(nèi)含子的9個(gè)突變位點(diǎn)，SNP6、SNP7、SNP9位點(diǎn)＜0.25，其他6個(gè)突變位點(diǎn) 0.25＜＜0.5，為中度多態(tài)。單標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析表明，公、母雞SNP2位點(diǎn)的AG基因型的毛囊密度顯著高于GG基因型（＜0.05）；母雞SNP8位點(diǎn)的AA與GG基因型的毛囊密度顯著高于AG基因型（＜0.05），在公雞中3種基因型的毛囊密度差異不顯著。14個(gè)SNPs連鎖不平衡分析表明，SNP3、SNP4和SNP5的強(qiáng)連鎖產(chǎn)生了2種單倍型，H1（GAT）頻率為0.882和H2（TCC）頻率為0.118；SNP6—SNP13之間的強(qiáng)連鎖產(chǎn)生了5種單倍型，其中H1（ACATTATC）和H2（ACGTCCCA），H3（ACGTTCCA），H4（GTGCTATA），H5（ACGTCCCC），單倍型頻率分別為0.469、0.275、0.123、0.113、0.014。SNP3、SNP4和SNP5連鎖產(chǎn)生的2 種單倍型組合后產(chǎn)生了3種單倍型組合，關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)在公、母雞中3種單倍型組合的毛囊密度均差異不顯著；將SNP6—SNP13連鎖產(chǎn)生的5種主要單倍型組合后，公雞有7種組合單倍型組合，毛孔數(shù)量差異不顯著；母雞有8種主要單倍型組合，其中H1H1（AACCAATTTTAATTCC）毛囊密度最大。SNP2和SNP8位點(diǎn)與皮膚毛囊密度顯著相關(guān)，單倍型組合H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）為母雞優(yōu)勢單倍型?！窘Y(jié)論】篩選到的14個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中，SNP2（rs2587721 G＞A）和SNP8（rs2555967G＞A）位點(diǎn)與毛囊密度顯著相關(guān)，8個(gè)SNPs（SNP6—SNP13）位點(diǎn)處于強(qiáng)連鎖不平衡，母雞H1H1單倍型毛囊密度最大。的SNP2和SNP8位點(diǎn)的單倍型組合H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）和SNP6—SNP13連鎖產(chǎn)生的H1H1（AACCAATTTTAATTCC）單倍型組合與母雞毛囊密度顯著相關(guān)，可以為雞毛囊密度“分子編寫育種”提供重要遺傳信息。

雞；；皮膚毛囊；SNP位點(diǎn)；連鎖不平衡

0 引言

【研究意義】近年來，隨著禽流感事件和新冠疫情對家禽行業(yè)負(fù)面影響的加重和大眾對食品安全的重視，家禽行業(yè)進(jìn)入重要變革時(shí)期?；铍u市場的逐步關(guān)閉、屠宰后冷鮮上市已經(jīng)成為不可逆轉(zhuǎn)的趨勢[1-2]。雞屠體外觀逐漸成為消費(fèi)者的關(guān)注重點(diǎn)，其中皮膚毛孔更是屠體外觀關(guān)注的重點(diǎn)，受到育種工作者越來越多的重視[3-4]。【前人研究進(jìn)展】冰鮮雞具有毛孔細(xì)密、皮膚緊實(shí)度好的特征，更受到消費(fèi)者的青睞。毛囊密度直接影響雞的屠體外觀[5-7]。毛囊密度發(fā)育受Wnt、Edar 等信號(hào)通路和、、、等基因調(diào)控[5-10]，其中Wnt信號(hào)通路在雞、鵝等家禽的毛囊密度發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[11-16]。Wnt家族成員3a（）是Wnt信號(hào)通路中的重要成員，在毛囊的生長發(fā)育中具有重要作用[17-18]。對雞毛囊的大小起到重要作用[6,15-16]，能夠增加真皮厚度，擴(kuò)大了脊髓束大小，減少了芽間域間距，同時(shí)影響鳥類羽毛類型[19]，對黃羽肉雞胚胎期羽囊形態(tài)發(fā)生起到重要調(diào)控作用[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)和SNPs在雞不同部位皮膚毛囊密度差異的皮膚組織中具有顯著差異，推測可能是影響雞皮膚毛囊密度性狀的重要候選基因[15-16]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為進(jìn)一步驗(yàn)證在皮膚毛囊生長發(fā)育中的作用，篩選的SNPs位點(diǎn)，分析多態(tài)位點(diǎn)與雞毛囊密度的關(guān)聯(lián)性，找出對毛囊密度有顯著效應(yīng)的SNP標(biāo)記，以期為進(jìn)一步深入研究在皮膚毛囊生長發(fā)育中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)資料，為培育屠體美觀的屠宰型肉雞的“分子編寫育種”研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

2021年1—2月在廣西金陵農(nóng)牧集團(tuán)有限公司飼養(yǎng)金陵花雞、翅靜脈采血、屠宰和毛囊密度測定統(tǒng)計(jì)。2021年3—5月由江蘇省家禽科學(xué)研究所家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研人員開展金陵花雞PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

金陵花雞來自廣西金陵農(nóng)牧集團(tuán)有限公司培育的優(yōu)質(zhì)肉雞配套系，選取1 000個(gè)種蛋入孵，飼養(yǎng)至上市日齡（7周齡），隨機(jī)選擇金陵麻雞382只（公162只，母220只），記錄腳號(hào)，并進(jìn)行翅下靜脈采血1 mL，ACD抗凝，混勻后放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 毛囊密度數(shù)據(jù)的測定

毛囊密度統(tǒng)計(jì)方法：7周齡382只金陵花雞屠宰拔毛后，以背中線為軸，統(tǒng)計(jì)左側(cè)背部皮膚2 cm×2 cm=4 cm2面積內(nèi)毛囊的數(shù)目，所有毛囊密度均由同一人測量，所測部位基本一致[15]。公、母雞背部毛囊密度測定方法見圖1。

圖1 公、母雞背部毛囊密度測定方法

1.4 主要試劑和儀器

DYY-6D型電泳儀，離心機(jī)，渦旋振蕩器，梯度 PCR 儀，凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 2500）、紫外分光光度計(jì)（NanoDrop One）。Loadingbuffer，1.5%的瓊脂糖凝膠，TBE電泳液，PCR八連管，無菌超純水。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank登錄號(hào)：NC_006089DNA序列，設(shè)計(jì)部分外顯子和內(nèi)含子序列PCR引物，-1（F：CACGGAGGAACTGAAGATGC，R：TGAAATTCAGTCCTGTCTCCAC）、-2（F：GTCCATGCCATCGCCTCTG，R：TCCTACACCCA GG TACACATAGG），PCR產(chǎn)物長度分別為480、593 bp，引物由生工生物工程（上海)股份有限公司合成。

1.6 Wnt3a PCR擴(kuò)增與測序

采用全血基因組DNA提取試劑盒（DP348），提取的DNA溶于超純水中。PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR總反應(yīng)體系50 μL：DNA模板2 μL，dNTP（2 mmol/L）4 μL，Mg2+（3 mmol·L-1）0.6 μL，1×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，聚合酶（1U·μL-1）2.5 μL，補(bǔ)超純水至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增目的片段用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.7 SNP位點(diǎn)確定、基因分型和遺傳多態(tài)性分析

通過DNAMan6.0進(jìn)行比對，并用Chromas軟件（Ver.1.6.0）篩查SNP位點(diǎn)。針對SNP位點(diǎn)測序峰圖，對382個(gè)個(gè)體基因分型。利用PopGene（version 1.31）統(tǒng)計(jì)各個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率、基因頻率、雜合度（）和多態(tài)信息含量（）。對所有SNP位點(diǎn)利用Hapoview4.1進(jìn)行連鎖不平衡分析，利用卡方檢驗(yàn)（c2）檢測SNP位點(diǎn)是否處Hardy-Weinberg（H-W）平衡狀態(tài)。

1.8 Wnt3a SNP位點(diǎn)與毛囊密度相關(guān)性分析

以SPSS 16.0軟件的一般線性模型中單變量方差分析進(jìn)行位點(diǎn)3種基因型與雞毛囊密度性狀關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。固定因子：SNP標(biāo)記的不同基因型，因變量：毛囊密度，采用LSD法多重比較不同標(biāo)記基因型之間毛囊密度的差異顯著性，＜0.05表示差異顯著。SNP位點(diǎn)兩種基因型與雞毛囊密度性狀關(guān)聯(lián)分析采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法，比較不同基因型之間毛囊密度的差異顯著性，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 金陵花雞公母雞毛囊密度統(tǒng)計(jì)

金陵花雞公母雞毛囊密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1?？梢?，金陵花雞母雞毛囊密度顯著高于公雞。

2.2 Wnt3a SNP位點(diǎn)的測序峰圖和突變類型

SNP位點(diǎn)的相應(yīng)位置通過“http://asia. ensembl.org/index.html?redirect=no”查找。14個(gè)SNP位點(diǎn)不同基因型的測序峰圖見圖2。在第2外顯子發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)SNP1（rs2587569 G＞A），為同義突變；第2內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變位點(diǎn)，分別為SNP2（rs2587721G＞A）, SNP3（rs2587832G＞T）, SNP4（rs2587845 位點(diǎn)A＞C）, SNP5（rs2587849T＞C）。在第3內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNP位點(diǎn),分別為SNP6（rs2555891 G＞A），SNP7（rs2555961 T＞C），SNP8（rs2555967G＞A），SNP9（rs2556041 C＞T），SNP10（rs2556078 T＞C），SNP11（rs2556088A＞C），SNP12（rs2556093T＞C），SNP13（rs2556109 A＞C），SNP14（rs2556178 G＞T）。

表1 金陵花雞公、母雞毛囊密度比較

同列不同小寫字母表示毛囊密度差異顯著(＜0.05)

Different lowercase letters in the same column indicate that the skin feather follicle density is significantly different (＜0.05)

2.3 Wnt3a SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分析

由表2可知，14個(gè)SNP位點(diǎn)中，除了SNP2位點(diǎn)在金陵花雞群體中有2種基因型，其他13個(gè)SNP位點(diǎn)均有3種基因型。每個(gè)SNP位點(diǎn)不同基因型頻率不同。

經(jīng)H-W平衡檢測，SNP1位點(diǎn)（在第2外顯子）和SNP3、SNP4和SNP5（在第2內(nèi)含子）均處于H-W平衡狀態(tài)（＞0.05），SNP6—SNP14（在第3內(nèi)含子）偏離H-W平衡（＜0.05）。SNP1—SNP5這5個(gè)SNP位點(diǎn)遺傳多樣性較低，因?yàn)椋?.50，＜0.25。第3內(nèi)含子的9個(gè)突變位點(diǎn)，除了SNP6、SNP7、SNP9位點(diǎn)＜0.25，其他6個(gè)突變位點(diǎn) 0.25＜＜0.5，為中度多態(tài)。

2.4 單標(biāo)記與皮膚毛囊密度性狀的關(guān)聯(lián)分析

的14個(gè)SNPs位點(diǎn)與背部皮膚毛囊密度的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明，除了SNP2和SNP8，其他12個(gè)SNP位點(diǎn)的毛囊密度無顯著差異。SNP2（rs2587721）位點(diǎn)在公、母雞中均是AG基因型的毛囊密度顯著高于GG基因型（＜0.05）；SNP8（rs2555967）位點(diǎn)在母雞中AA與GG基因型的毛囊密度顯著高于AG基因型（＜0.05），在公雞中3種基因型的毛囊密度差異不顯著。

2.5 連鎖不平衡分析

連鎖不平衡分析結(jié)果見圖3。圖3-A方框中的數(shù)值為D’值乘以100后得到?？梢?，金陵花雞的14個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)建了2個(gè)連鎖不平衡（LD）Block（單倍型區(qū)塊）。Block1由8個(gè)SNP位點(diǎn)（SNP6—SNP13）構(gòu)成，D’值處于0.88—1之間，Block2由3個(gè)SNPs位點(diǎn)（SNP3-SNP5）構(gòu)成，D’值均為1。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)D’值＞0.8 和2＞0.33時(shí)表示SNPs位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡[21-22]，本研究兩個(gè)單倍區(qū)塊型兩兩SNP之間的2值在0.944—1.0之間，表明SNP6—SNP13之間存在強(qiáng)連鎖不平衡，SNP3—SNP5存在強(qiáng)連鎖不平衡。由圖3-B可知，SNP3、SNP4和SNP5的強(qiáng)連鎖產(chǎn)生了2種單倍型，H1（GAT）頻率為0.882和H2（TCC）頻率為0.118；SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、SNP11、SNP12、SNP13、SNP14之間的連鎖產(chǎn)生了5種單倍型，其中H1（ACATTATC）、H2（ACGTCCCA）、H3（ACGTTCCA）、H4（GTGCTATA）、H5（ACGTCCCC）單倍型頻率分別為0.469、0.275、0.123、0.113、0.014。

圖2 Wnt3a 14個(gè)突變位點(diǎn)測序峰圖

表2 Wnt3a的14個(gè)位點(diǎn)遺傳多態(tài)性與哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)

表3 Wnt3a位點(diǎn)與皮膚毛囊密度性狀的關(guān)聯(lián)分析（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

同一位點(diǎn)中同列不同小寫字母表示同一性別不同基因型毛囊密度差異顯著(＜0.05)。下同

Different lowercase letters in the same column in the same site indicate that the skin feather follicle density of different genotypes in the same sex is significantly different (＜0.05). The same as below

A：連鎖圖。方塊顏色由淺至深表示連鎖程度由低到高；數(shù)值代表位點(diǎn)間連鎖不平衡的強(qiáng)弱（數(shù)值=D’值×100）；B：單倍型分析。線越粗表示相鄰單倍型結(jié)合可能性大

2.6 Wnt3a單倍型與毛囊密度性狀關(guān)聯(lián)分析

SNP3、SNP4和SNP5連鎖產(chǎn)生的2 種單倍型組合后產(chǎn)生了3種單倍型，結(jié)果見表4?？梢?，關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)在公、母雞中3種單倍型組合的毛囊密度均差異不顯著；從表5結(jié)果可見，將 SNP6—SNP13處的5種單倍型組合后，個(gè)體數(shù)小于3的單倍型組合不參與統(tǒng)計(jì)與比較，所以公雞有7種單倍型組合，毛孔數(shù)量差異不顯著；母雞有8種單倍型組合，其中H1H1（AACCAATTTTAATTCC）毛囊密度最大，毛孔數(shù)量顯著高于H1H5、H1H4、H2H2和H4H4。由表6結(jié)果可見，SNP2和SNP8位點(diǎn)單倍型組合后，公雞有6種單倍型組合，毛孔數(shù)量差異不顯著，母雞H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）單倍型組合的毛孔數(shù)量顯著高于H2H2（GGAG）和H2H3（GGGG）。

表4 Wnt3a SNP3-SNP5位點(diǎn)單倍型組合與皮膚毛囊密度性狀關(guān)聯(lián)分析（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

表5 Wnt3a SNP6-SNP13位點(diǎn)單倍型組合與皮膚毛囊密度性狀關(guān)聯(lián)分析（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

3 討論

3.1 Wnt3a群體遺傳特征分析

本研究對第2、3外顯子、第2、3內(nèi)含子進(jìn)行測序，分析發(fā)現(xiàn)14個(gè)SNP位點(diǎn)，除了SNP2（rs2587721）位點(diǎn)存在2種基因型GG、AG，其他SNP位點(diǎn)存在3種基因型。H-W平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，4個(gè)SNP位點(diǎn)處 H-W平衡狀態(tài)。試驗(yàn)選擇的金陵花雞是2015年12月20通過的國家畜禽遺傳資源委員會(huì)審定的肉雞配套系[23]，沒有對試驗(yàn)群體進(jìn)行長期的高強(qiáng)度的人工選擇，因而有些位點(diǎn)表現(xiàn)出在基因組上分布均勻，處于H-W平衡狀態(tài)。第3內(nèi)含子的9個(gè)SNP位點(diǎn)偏離H-W平衡（＜0.05），可能是因?yàn)樵囼?yàn)群體是人工選種選配，而非自然交配，組成配套系的3個(gè)專門化品系經(jīng)過較長期的選育，導(dǎo)致部分基因型的個(gè)體數(shù)量偏少所致；另外也可能是試驗(yàn)群體數(shù)目較少造成，下一步將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。群體遺傳多樣性的大小代表著群體遺傳豐富度的高低，多樣性越高，則遺傳豐富度也越高，通常用和用衡量這一指標(biāo)[24-25]。第2外顯子、第2內(nèi)含子的5個(gè)突變位點(diǎn)和均小于0.25，說明這5個(gè)SNP位點(diǎn)遺傳多樣性較低。第3內(nèi)含子的9個(gè)突變位點(diǎn)，除了SNP6、SNP7、SNP9位點(diǎn)＜0.25，其他6個(gè)突變位點(diǎn) 0.25＜＜0.5，為中度多態(tài)?？傮w遺傳變異程度低，這可能是由于參與金陵花雞配套系培育的3個(gè)品系經(jīng)過較長期的人工定向選擇，特別是終端父系的皮膚毛孔密度進(jìn)行了較高強(qiáng)度的選育，所以導(dǎo)致遺傳多態(tài)性較低。

表6 Wnt3a SNP2，SNP8位點(diǎn)單倍型組合與皮膚毛囊密度性狀關(guān)聯(lián)分析（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

3.2 Wnt3a多態(tài)性與毛囊密度的關(guān)聯(lián)性分析

研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路中的多個(gè)SNPs位點(diǎn)與雞屠體性狀相關(guān)，其中與胸肌率顯著相關(guān)[26]。目前，關(guān)于在禽類毛囊生長發(fā)育方面的研究相對較少。作者前期對花山麻雞第2、3外顯子、第2、3內(nèi)含子進(jìn)行測序，只發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP位點(diǎn)，其中第3內(nèi)含子g.2555377 T＞C位點(diǎn)與皮膚毛囊密度顯著相關(guān)[16]。本研究用相同的引物對金陵花雞進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測序，發(fā)現(xiàn)14個(gè)SNP位點(diǎn)，其中2個(gè)SNP位點(diǎn)，SNP2（rs2587721A＞G）和SNP8（rs2555967G＞A）與皮膚毛囊密度顯著相關(guān)。品種不同，SNP位點(diǎn)差異顯著，只在第2外顯子發(fā)現(xiàn)一個(gè)相同的SNP位點(diǎn)（rs2587569 G＞A），其他SNP位點(diǎn)不同；與毛囊密度顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記也不同。同時(shí)，在第二外顯子存在相同突變位點(diǎn)的基因型不同，在金陵花雞中存在3種基因型（GG、AG、AA），而在花山麻雞中只存在2種基因型（GG、AA）。這可能與2個(gè)品種毛囊密度不同有關(guān)，花山麻雞公母雞平均毛囊密度為20左右，公母雞毛囊密度差異不顯著；金陵花雞母雞毛囊密度（15.71）顯著高于公雞（14.25），進(jìn)一步推測是毛囊密度的關(guān)鍵候選基因，下一步將在相同品種和不同品種擴(kuò)大數(shù)量進(jìn)行驗(yàn)證SNP標(biāo)記。

基因組中的突變位點(diǎn)絕大多數(shù)位于內(nèi)含子區(qū)域，而外顯子相對較保守，本研究在雞中發(fā)現(xiàn)的14個(gè)突變位點(diǎn)中就有13個(gè)位于內(nèi)含子，可能是因?yàn)閮?nèi)含子比外顯子選擇壓力較小，更容易積累變異[27]。與毛囊密度顯著相關(guān)的SNP2和SNP8兩個(gè)位點(diǎn)突變雖然均在內(nèi)含子，但也可能影響mRNA翻譯，從而使蛋白質(zhì)的功能發(fā)生變化，進(jìn)而影響到表型變化[28-29]。

表型的變化可能是單個(gè)突變位點(diǎn)引起的，也可能是多個(gè)SNPs間的連鎖作用造成的[30]。對突變位點(diǎn)之間進(jìn)行連鎖不平衡分析能夠鑒別連鎖的位點(diǎn)，連鎖分析后可看出非等位基因間更多位點(diǎn)的相互作用，可更好地綜合分析表型變化原因[31]。本研究連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)：SNP3—SNP5的3個(gè)位點(diǎn)，SNP6—SNP13的8個(gè)SNP位點(diǎn)間均存在強(qiáng)連鎖，而且連鎖水平很高（2值在0.944—1.0）。諸多因素都會(huì)導(dǎo)致群體內(nèi)的SNP位點(diǎn)間出現(xiàn)連鎖不平衡狀態(tài)，如交配模式、群體混合和選擇都將影響群體的連鎖不平衡水平[32]。本研究的試驗(yàn)材料金陵花雞是三系雜交組合的肉雞配套系，是3個(gè)品系的群體混合，3個(gè)品系又經(jīng)過8個(gè)世代以上的選育，這可能是多個(gè)SNP位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖水平的重要原因。

經(jīng)過連鎖產(chǎn)生的單倍型組合與毛囊密度的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn) SNP6—SNP13的強(qiáng)連鎖對雞毛囊密度產(chǎn)生重要影響。 SNP6—SNP13連鎖產(chǎn)生5種單倍型，其中H1單倍型（ACATTATC）頻率最高，為0.469，推斷H1單倍型可能是雞最早出現(xiàn)在祖先中的單倍型[27]。 SNP6—SNP13連鎖產(chǎn)生5種單倍型組合后，對公雞毛囊密度無顯著影響效應(yīng)，對母雞有顯著影響效應(yīng)，其中H1H1單倍型（AACCAATTTTAATTCC）在群體中出現(xiàn)頻率最高。雖然SNP2和SNP8不存在強(qiáng)連鎖關(guān)系，但將2個(gè)位點(diǎn)與雞毛囊密度顯著相關(guān)，SNP2和SNP8位點(diǎn)單倍型組合后，對公雞毛囊密度無顯著影響效應(yīng)，母雞H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）為優(yōu)勢單倍型組合。研究發(fā)現(xiàn)SNP6—SNP13聯(lián)鎖后產(chǎn)生的單倍型以及SNP2和SNP8位點(diǎn)單倍型組合后，對公雞不存在顯著影響效應(yīng)，對母雞皮膚毛囊密度產(chǎn)生顯著的遺傳學(xué)效應(yīng)。表型測定結(jié)果表明，母雞的平均毛囊密度顯著高于公雞毛囊密度。對雞毛囊密度的影響效應(yīng)是否有性別效應(yīng)，需要進(jìn)一步擴(kuò)大群體數(shù)量，在不同品種中進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究對與雞毛囊密度顯著相關(guān)多個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析與單倍型組合分析，除去個(gè)體數(shù)小于3的單倍型組合，共獲得8種組合類型，其中SNP6— SNP13強(qiáng)連鎖后單倍型組合H1H1單倍型樣本量最多，占群體頻率37.33%，毛囊密度最大。SNP2和SNP8單標(biāo)記與毛囊密度顯著相關(guān)，SNP2和SNP8組合單倍型母雞H1H1、H1H2單倍型組合為優(yōu)勢單倍型。鑒于多個(gè)SNP位點(diǎn)和單倍型組合對雞皮膚毛囊密度產(chǎn)生顯著的遺傳效應(yīng)，可以考慮將SNP2和SNP8位點(diǎn)母雞組合單倍型H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）以及SNP6—SNP13處的強(qiáng)連鎖產(chǎn)生的H1H1單倍型組合（AACCAATTTTAATTCC）作為選育毛囊密度的重要分子標(biāo)記，以推動(dòng)屠宰型肉雞的“分子編寫育種”進(jìn)展[33]，為加快分子水平的編寫并定向培養(yǎng)屠宰型肉雞新品種，獲得分子雜種優(yōu)勢，提高育種效率奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在第2外顯子、第2、第3內(nèi)含子共發(fā)現(xiàn)14個(gè)SNPs。第2外顯子的1個(gè)突變位點(diǎn)（SNP1）和第2內(nèi)含子的3個(gè)突變位點(diǎn)（SNP3—SNP5）的3個(gè)位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，第3內(nèi)含子的9個(gè)突變位點(diǎn)（SNP6—SNP14）偏離Hardy-Weinberg平衡。SNP2和SNP8位點(diǎn)與皮膚毛囊密度顯著相關(guān)，母雞組合單倍型H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）為優(yōu)勢單倍型。SNP6—SNP13之間存在強(qiáng)連鎖不平衡，H1（ACATTATC）為優(yōu)勢單倍型，母雞有8種單倍型組合，其中H1H1（AACCAATTTTAATTCC）個(gè)體數(shù)量最多，占群體頻率37.33%，毛囊密度最大。的SNP2和SNP8位點(diǎn)的H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）和SNP6—SNP13連鎖產(chǎn)生的H1H1（AACCAATTTTAATTCC）單倍型組合可以為母雞皮膚毛囊密度“分子編寫育種”提供遺傳信息。

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Screening ofSNPs and Its Association Analysis with Skin Feather Follicle Density Traits in Chicken

TU YunJie1, JI GaiGe1, ZHANG Ming1, LIU YiFan1, JU XiaoJun1, SHAN YanJu1, ZOU JianMin1, LI Hua2, CHEN ZhiWu3, SHU JingTing1

1Key Laboratory of Poultry Genetics and Breeding of Jiangsu Province, Jiangsu Institute of Poultry Sciences, Yangzhou 225125, Jiangsu;2Foshan University, Foshan 528225, Guangdong;3Guangxi Jinling Agriculture and Animal Husbandry Group Co., Ltd., Nanning 530000

【Objective】The Wnt signaling pathway plays an important role in the development of animal skin feather follicles. The results of previous studies indicated that themight be an important candidate gene that had effects on the chicken feather follicle density. In order to further verify the role ofin the growth and development of skin feather follicle density,SNPs were screened and their association with feather follicle density would be analyzed in Jinling Hua chicken. The study could provide a reference for “breeding by molecular writing” of slaughter-type broilers with beautiful carcasses.【Method】The SNPs ofgene were screened by PCR amplification and direct sequencing, and the correlation between a single SNP marker and skin feather follicle density traits was analyzed. Haploview software was used to analyze the degree of linkage disequilibrium (LD) of these SNP loci, and the correlation between different haplotype combinations and feather follicle density traits was also analyzed. 【Result】A total of 14 SNP sites were found, and one SNP site (SNP1) was found in the second exon, which was a synonymous mutation. Four mutation sites (SNP2-SNP5) were found in the second intron, and 9 SNP sites (SNP6-SNP14) were found in the third intron. The chi-square test showed that one mutation site (SNP1) in the second exon and three mutation sites (SNP3-SNP5) in the second intron were all in the Hardy-Weinberg equilibrium (＞0.05), 9 mutation sites (SNP6-SNP14) of the third intron deviated from Hardy-Weinberg equilibrium (＜0.05). The expected heterozygosity () of SNP1-SNP5 was less than 0.50, and the polymorphic information content () was less than 0.25. The genetic polymorphisms of these 5 SNP loci were low. The third intron had 9 mutation sites,of SNP6, SNP7, SNP9 sites was less than 0.25, and the other 6 mutation sites were 0.25＜＜0.5, which were moderately polymorphic. Single-marker association analysis showed that the number of skin feather follicle with SNP2 locus of AG genotype in males and females was significantly higher than that of GG genotype (＜0.05). The number of skin feather follicles with SNP8 locus of AA and GG genotypes in females was significantly higher than that of the AG genotype (＜0.05). The skin feather follicles density in the three genotypes in males was not significantly different. The linkage disequilibrium analysis of 14 SNPs showed that SNP6-SNP13 and SNP3-SNP5 had a strong linkage disequilibrium, respectively. SNP3, SNP4, and SNP5 produced three haplotype combinations after the combination of the two haplotypes linked by SNP3- SNP5. Association analysis found that the skin feather follicle density of the three haplotype combinations in males and females were not significantly different. After the combination of 5 main haplotypes at SNP6-SNP13 locus, the males had 7 haplotype combinations, and the skin feather follicles density was not significant. Females had 8 haplotype combinations, of which H1H1 (AACCAATTTTAATTCC) had the highest skin feather follicles density. SNP2 and SNP8 were significantly correlated with skin feather follicle density, and the haplotype combination H1H1(AGAA) and H1H2 (AGAG) were the dominant haplotypes in hens.【Conclusion】Fourteen SNPs ofwere screened. Among them, individuals with different genotypes at rs2587721 G＞A (SNP2) and rs2555967G＞A (SNP8) locus had significant differences in feather follicle density. Eight SNPs (SNP6-SNP13) loci were in strong linkage disequilibrium, and the combination of H1H1 had the highest feather follicles density in females. The haplotype combination of SNP2 and SNP8 ofH1H (AGAA), H1H2 (AGAG) and SNP6-SNP13 linked to produce the H1H1 (AACCAATTTTAATTCC) haplotype combination were significantly correlated with feather follicle density in females, which provided important genetic information for “breeding by molecular writing” on chicken skin feather follicle density.

chicken;; skin feather follicle; SNP sites; linkage disequilibrium

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.016

2021-09-13；

2022-05-27

江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項(xiàng)目（PZCZ201728）、揚(yáng)州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（YZ2021029）、江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉雞）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（JATS[2020]357）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-41）、江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新基金（CX(21)2011-1）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20210955）、江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項(xiàng)目（JBGS（2021）107）

屠云潔，E-mail：tyj3030@126.com。通信作者束婧婷，E-mail：shujingting@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）