改良縫掛法構(gòu)建小鼠胃原位移植瘤模型及評(píng)估

程 蝶，左彥珍，魯艷杰，張?chǎng)┗?，李祥伶，龐佳昱，李玉紅

胃癌在消化系統(tǒng)腫瘤中致死率位居第3位[1-2]，早期通常無明顯癥狀，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)病情已進(jìn)展到中晚期[3]。盡管胃癌已在多模式治療方面取得進(jìn)展，但復(fù)發(fā)依然常見[4]。目前，胃癌體內(nèi)研究常采用動(dòng)物皮下移植瘤模型，但因胃癌具有特殊的腫瘤微環(huán)境[5]，其內(nèi)多種基質(zhì)細(xì)胞、生長因子相互作用直接或間接地影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6]，因此關(guān)于胃癌的研究不能脫離腫瘤微環(huán)境及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等獨(dú)立進(jìn)行瘤體組織研究。皮下移植瘤模型不能有效模擬胃癌原發(fā)器官的腫瘤微環(huán)境，已不能滿足胃癌研究領(lǐng)域的新需求，胃癌相關(guān)基礎(chǔ)研究的深入挖掘要求構(gòu)建更高效穩(wěn)定、更貼合臨床的動(dòng)物原位腫瘤模型。本實(shí)驗(yàn)首先種植兩種人胃癌細(xì)胞株MGC803和MKN45/luc,構(gòu)建皮下移植瘤，再將皮下瘤組織塊用改良縫掛法構(gòu)建胃原位移植瘤模型，通過手術(shù)解剖和動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)裸鼠胃原位移植瘤的成瘤效果及生長情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c(nu)裸鼠，4～5周齡，體重15～18 g，購自北京市華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2020-0004。2只裸鼠用于兩種胃癌細(xì)胞皮下移植瘤構(gòu)建，15只裸鼠用于改良縫掛法構(gòu)建胃原位移植瘤。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2人胃癌細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞MGC803購自上海吉?jiǎng)P基因公司，人胃癌細(xì)胞MKN45/luc購自寧波明舟生物公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器 PBS緩沖液(購自Biological Industries)、RPMI 1640培養(yǎng)基(購自Biological Industries)、胰蛋白酶(購自Biological Industries)、胎牛血清(購自普諾賽公司)。

1.2 方法

1.2.1胃皮下移植瘤模型的構(gòu)建 構(gòu)建人胃癌細(xì)胞株MGC803以及能夠穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的人胃癌細(xì)胞株MKN45/luc裸鼠皮下移植瘤：體外培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌3次，PBS重懸成濃度為每毫升1×108個(gè)細(xì)胞懸液，將0.2 mL細(xì)胞懸液注射于裸鼠背部皮下，棉簽按壓針孔數(shù)秒，待成瘤。

1.2.2胃癌原位移植瘤模型的建立 約1周后，皮下荷瘤小鼠注射部位可見皮下瘤形成，周圍有血管生成，待瘤體直徑長至1 cm，取出皮下瘤體，制備成體積1 mm3的腫瘤組織塊。5只裸鼠用于構(gòu)建MGC803原位移植瘤模型，10只裸鼠用于構(gòu)建MKN45/luc原位移植瘤模型。改良縫掛法構(gòu)建裸鼠胃原位移植瘤模型。操作如下：術(shù)前禁食禁水6 h，麻醉消毒后使裸鼠仰臥位于操作臺(tái)，于劍突下方約5 mm處沿腹中線左側(cè)1 cm縱向逐層暴露腹腔，種瘤位置選擇胃大彎近幽門毛細(xì)血管豐富部位，手術(shù)縫線于此部位漿膜層行第一針固定，將制備好的1 mm3腫瘤塊掛到手術(shù)線上，使用“8”字縫合法將瘤塊包入漿膜中(圖1)，閉合腹腔待小鼠恢復(fù)自主活動(dòng)后放回飼養(yǎng)籠。

圖1 胃原位移植瘤組織瘤塊種植位置、手法

1.2.3荷瘤小鼠胃原位移植瘤的成瘤效果解剖檢測(cè) MGC803細(xì)胞構(gòu)建的胃原位移植瘤模型建立3周后，手術(shù)解剖小鼠，探查成瘤效果及瘤體大小。

1.2.4熒光成像技術(shù)檢測(cè)荷瘤小鼠胃原位移植瘤的成瘤效果 MKN45/luc細(xì)胞構(gòu)建的胃原位移植瘤模型建立3周后，腹腔注射熒光素酶底物D-熒光素鉀鹽(150 mg/kg)，使用IVIS Lumina XRMS SeriesⅢ動(dòng)物活體成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5荷瘤小鼠胃原位移植瘤組織的病理檢測(cè) 解剖取材，取胃腫瘤組織及瘤旁正常胃組織，經(jīng)10%中性福爾馬林固定，行HE染色及免疫組化染色。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠胃原位移植瘤的成瘤情況及腫瘤大小構(gòu)建裸鼠MGC803細(xì)胞胃原位移植瘤模型后，飼養(yǎng)3周處死，對(duì)成瘤情況及腫瘤大小進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量發(fā)現(xiàn)：用改良縫掛法構(gòu)建的胃原位移植瘤模型全部成瘤，腫瘤生長良好、大小均一(圖2)，5只裸鼠胃原位移植瘤體積(mm3)中位數(shù)為216、四分位距為102、均值為224.4、標(biāo)準(zhǔn)差為108.5、標(biāo)準(zhǔn)誤為48.52，不存在離群值(Median±2IQR)和極端值(Median±3.5IQR)，正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示各數(shù)值在組內(nèi)接近正態(tài)分布(P>0.05)，胃原位移植瘤均一性較好。

ABCD

2.2 裸鼠胃原位移植瘤的動(dòng)物活體成像情況對(duì)10只種植MKN45/luc細(xì)胞的原位移植瘤裸鼠行動(dòng)物活體成像系統(tǒng)拍照，結(jié)果顯示：10只均造模成功(圖3)。樣本中不存在離群值(Median±2IQR)和極端值(Median±3.5IQR)，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示，雌性裸鼠瘤體熒光數(shù)值低于雄性的平均水平，兩組的差值為-1.4E+09，95%CI為-4.0E+09～12E+09，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.263，P>0.05)，正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示各數(shù)值在組內(nèi)接近正態(tài)分布(P>0.05)，提示本方法構(gòu)建的胃原位移植瘤均一性較好。

圖3 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)生物熒光拍照?qǐng)D：A.雄性；B.雌性

2.3 裸鼠胃原位移植瘤組織的HE染色病理結(jié)果正常胃組織切片顯示：胃黏膜固有腺體形態(tài)規(guī)則，壁細(xì)胞和主細(xì)胞排列整齊。胃原位移植瘤組織切片顯示：細(xì)胞大小不等、形態(tài)不一，異型性明顯，核大深染，可見病理性核分裂象，符合胃癌的病理特征(圖4)。

AB

2.4 裸鼠胃原位移植瘤組織中CD45、vimentin和CK19的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示：CD45和vimentin在胃原位移植瘤組織中低表達(dá)或不表達(dá)，CK19在胃原位移植瘤組織中高表達(dá)(圖5)；提示腫瘤為上皮來源，胃原位移植瘤造模成功。

ABC圖5 裸鼠胃原位移植瘤組織免疫組化結(jié)果:A.腫瘤組織中CD45呈陰性,PV6000兩步法;B.腫瘤組織中vimentin呈陰性,PV6000兩步法;C.腫瘤組織中CK19呈陽性,PV6000兩步法

3 討論

在過去十幾年中，胃癌的患病率顯著下降，但每年仍有大量患者死亡[7]。裸鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠，是多種腫瘤模型構(gòu)建常用動(dòng)物[8-10]。目前，胃癌研究常用裸鼠皮下移植瘤[11]和裸鼠原位移植瘤。雖然皮下移植瘤操作方便，但其不容易模擬臨床上胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移，且無法構(gòu)建胃癌特殊的腫瘤微環(huán)境[12]。因此，構(gòu)建穩(wěn)定的動(dòng)物胃原位移植瘤模型是基礎(chǔ)科研亟需解決的難題。

構(gòu)建胃原位移植瘤常用縫掛法、細(xì)胞注射法、胃囊法和OB膠黏合法[13]。傳統(tǒng)縫掛法瘤體易掉落腹腔；細(xì)胞注射法操作時(shí)細(xì)胞懸液易隨針道外漏；胃囊法這類創(chuàng)面較大的縫合易造成梗阻；OB膠黏合法則是將瘤組織塊埋入血管豐富的胃漿肌層后[14]，使用OB膠黏合創(chuàng)口，雖然OB膠具有可吸收性，但其強(qiáng)效的黏合功能對(duì)胃功能運(yùn)動(dòng)和胃組織表面血管也有限制及影響，且易與相鄰器官粘連[15]。綜上，目前常用的構(gòu)建胃原位移植瘤方法均存在不同程度的缺陷，有待改良。

本研究對(duì)傳統(tǒng)縫掛法實(shí)施進(jìn)一步改良，較于其他構(gòu)建方法具有以下優(yōu)越性：(1)不需大量培養(yǎng)細(xì)胞；(2)操作僅在胃漿膜層，刺激小，不易造成梗阻，成活率高；(3)瘤體不易脫落且不影響小鼠胃腸正常功能；(4)種植在毛細(xì)血管分布豐富的胃大彎近幽門處，成瘤率高；(5)均一性好、可重復(fù)性高。此外，本研究結(jié)合動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，用熒光素酶標(biāo)記人胃癌細(xì)胞株構(gòu)建胃原位移植瘤，對(duì)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤生長情況的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)進(jìn)行初步嘗試[16]。改良后的縫掛法構(gòu)建胃原位移植瘤的成功，不僅為胃癌領(lǐng)域基礎(chǔ)研究提供了優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物腫瘤模型，也為胃癌的臨床治療研究奠定了模型基礎(chǔ)。