KAT2A通過Survivin乙?；种芖nt/β-catenin通路調(diào)控食管癌的機制

梁宗英，楊 陽，孫光蕊，鄭競雄，趙寶山，侯繼申

食管癌是全球范圍內(nèi)男性癌癥相關死亡的第六大原因，其高侵襲性及高復發(fā)率致使患者總生存質量差[1]。Survivin在凋亡抑制蛋白家族中抗凋亡能力最強，廣泛表達于多種惡性腫瘤中[2]。Survivin可以通過復雜的機制調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期和凋亡通路，促進腫瘤細胞增殖，加速腫瘤進展，從而導致患者預后不良[3]。KAT2A是GCN5相關乙酰轉移酶家族(GCN5-related nacetyltrans-ferases family, GNAT)的成員，可以與乙酰輔酶A(CoA)結合并將乙酰基轉移到組蛋白上，進而改變蛋白的功能[4]。文獻報道KAT2A在鼻咽癌、急性髓系白血病及胃癌的癌變和進展過程中發(fā)揮關鍵作用[5]。然而，關于KAT2A作為乙酰基轉移酶對食管癌病變中相關蛋白乙?；揎椀臐撛谧饔蒙形匆妶蟮?。因此，本文觀察下調(diào)KAT2A對食管癌細胞內(nèi)Survivin乙?；凹毎δ艿挠绊懀接慘AT2A與Survivin乙?；膬?nèi)在聯(lián)系以及在食管癌增殖及遷移中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織和細胞收集2019年1月～2021年1月承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸外科食管鱗狀細胞癌45例，用癌組織作為實驗組，正常食管黏膜組織(距癌組織邊緣大于8 cm)為對照組?；颊呔鶡o其他腫瘤史，術前未行放、化療。45例患者中，男性41例，女性4例；≥60歲38例，<60歲7例；TNM分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期34例，Ⅲ期6例；分化程度：低分化7例，中分化30例，高分化8例；有淋巴結轉移5例，無淋巴結轉移40例。食管癌EC109細胞和正常食管黏膜上皮HEEC細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院。本實驗經(jīng)承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2 材料培養(yǎng)基、血清、胰蛋白酶消化液、Matrigel基質膠購自上海紀寧公司。凝膠電泳試劑盒及細胞裂解液等購自上海通蔚公司。Alexa Fluor 488-conjugated羊抗兔熒光抗體、ATTO 594-conjugated羊抗鼠熒光抗體購自河北貝博公司。KAT2A、Survivin、Acetylated-Lys抗體、wnt3α、β-catenin和c-myc單克隆抗體、A/G瓊脂糖珠購自Abcam公司。RNA干擾序列由上海生物工程公司設計合成。

1.3 方法

1.3.1免疫組化法 組織脫蠟、破膜、修復抗原；血清室溫封閉；清洗后加入一抗；次日加二抗。采用免疫組化SP法染色，DBA顯色，蘇木精復染。免疫組化判斷標準：根據(jù)細胞膜、胞質染色程度和陽性細胞百分率進行評分，每張切片高倍鏡下隨機觀察10個視野。(1)根據(jù)細胞染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)根據(jù)陽性細胞百分率評分：陽性細胞<10%為1分，10%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項得分相加作為最終評分：0～2分為陰性，3～7分為陽性。

1.3.2生物信息學分析和預測 生物信息學軟件乙?；患ㄜ浖?Acetylation Set Enrichment Based, ASEB)預測可以將Survivin蛋白作為底物催化其發(fā)生乙?；囊阴；D移酶[6]。ASEB不僅可以預測目的蛋白的乙?；癄顟B(tài)，還可以預測催化目的蛋白發(fā)生乙?；揎椀囊阴；D移酶及可能發(fā)生乙酰化的賴氨酸位點。

1.3.3免疫熒光法 組織切片經(jīng)二甲苯及乙醇脫蠟，PBS清洗后抗原修復；5%血清室溫封閉；加一抗(Survivin抗體1 ∶1 000，KAT2A抗體1 ∶1 000)，4 ℃過夜，37 ℃復溫45 min，PBS洗3次；加熒光標記的二抗；DAPI染色10 min，PBS洗3次；抗熒光淬滅封片劑封固，拍照。

1.3.4細胞培養(yǎng)、分組及轉染 以轉染siRNA KAT2A細胞為實驗組(si-K)，轉染無siRNA細胞為陰性對照組(si-N)，正常細胞為空白對照組(NC)。食管癌細胞懸液計數(shù)，接種到6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。用30 μL 1×riboFECT CP Buffer(V1)稀釋1.25 μL 20 μmol/L siRNA儲存液(V2)，輕輕混勻，室溫孵育5 min；加入3 μL riboFECT CP Reagent(V3)，混勻后孵育；將riboFECT CP混合液加入到465.75 μL細胞培養(yǎng)基(V4)中，使總體積達500 μL，混勻；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后以熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效果。

1.3.5RT-qPCR實驗 提取RNA，反轉錄試劑盒反轉錄。熒光定量試劑盒檢測mRNA的表達；PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45s，合計30個循環(huán)。溶解曲線參照儀器自動程序。

1.3.6Western blot實驗 蛋白測定濃度，制備電泳蛋白上樣液，行凝膠電泳。電泳后，轉膜。加一抗4 ℃過夜。次日孵育二抗，重復洗膜后顯影。

1.3.7免疫共沉淀實驗 蛋白測定濃度，加入5 μL目的蛋白純抗體和5 mL A/G瓊脂糖珠，混勻后2×裂解緩沖液補充至總體積450 μL，離心后，取400 μL上清液置入離心管，4 ℃、15 r/min共沉淀12 h。4 ℃離心，棄上清液。1×裂解緩沖液500 μL洗滌A/G瓊脂糖珠。離心3 min，棄上清液。重復洗滌3次；最后一次洗滌完畢后，棄去上清液。1×裂解緩沖液35 μL和等體積的2×SDS上樣緩沖液混合，煮沸后離心；下一步行Western blot實驗。

1.3.8細胞功能學實驗 (1)MTT實驗：細胞計數(shù)后接種于96孔板。常規(guī)培養(yǎng)后轉染。分別于12、24、48、72 h時間點各拿出一塊板，加入MTT液30 μL，繼續(xù)常規(guī)孵育4 h。加入二甲基亞砜，80 r/min搖勻5～10 min，待結晶消失后用酶標儀測定570 nm處的細胞吸光度值(OD值)。(2)劃痕修復實驗：細胞接種于96孔板。無菌移液槍頭劃痕，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于劃痕后24、48、72 h觀察細胞生長狀態(tài)，并在倒置顯微鏡下測量劃痕寬度。(3)Transwell小室侵襲實驗：Matrigel稀釋液包濾膜，過夜聚合成膠。小室滅菌后抽去殘余的膠液，培養(yǎng)液濕化1 h。備轉染后單細胞懸液。Transwell小室放入24孔板，取出小室，室外加培養(yǎng)基600 μL。小室內(nèi)加200 μL細胞懸液，每組細胞重復6個樣本。培養(yǎng)48 h后取出小室，PBS淋洗，擦去微孔膜內(nèi)層細胞。多聚甲醛固定后結晶紫染色。顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

2 結果

2.1 食管癌和正常食管黏膜組織中Survivin乙?；桨┙M織中Survivin蛋白乙酰化率為(66.48±3.14)%，高于正常食管黏膜組織的(17.31±2.42)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 食管癌和正常食管黏膜組織中Survivin蛋白乙酰化水平

2.2 食管癌和正常食管黏膜組織中Survivin和KAT2A蛋白表達量免疫組化檢測顯示：癌組織和正常食管黏膜組織中Survivin蛋白陽性率分別為71.11%(32/45)和28.89%(13/45)，KAT2A蛋白陽性率分別為75.56%(34/45)和24.44%(11/45)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。Western blot結果顯示：Survivin在癌組織中表達為(74.35±3.43)%，高于正常食管黏膜組織(22.62±2.48)%；KAT2A在癌組織中表達為(70.68±3.15)%，高于正常食管黏膜組織的(23.87±2.67)%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

癌組織正常組織SurvivinKAT2A

2.3 乙酰基轉移酶KAT2A以Survivin為底物催化其發(fā)生乙?；念A測生物信息學軟件ASEB預測結果顯示：乙酰基轉移酶KAT2A可以將Survivin作為底物催化其發(fā)生乙?；?，其可能發(fā)生乙酰化的賴氨酸(K)為121和349號位點(P<0.05，表1)。

圖3 Western blot法檢測食管癌及正常食管黏膜組織中Survivin和KAT2A蛋白表達

表1 乙?；D移酶KAT2A以Survivin為底物發(fā)生乙?；念A測

P值越小，其位點發(fā)生乙?；膸茁试酱?/p>

2.4 免疫熒光檢測食管癌組織中Survivin和KAT2A蛋白表達免疫熒光結果顯示：Survivin和KAT2A蛋白在食管癌組織中同時呈高表達，兩者主要表達于細胞質中，部分表達于細胞核中(圖4)。

2.5 食管癌組織中Survivin乙?；蚄AT2A的相關性相關性分析顯示：食管癌組織中Survivin乙?；蚄AT2A表達呈正相關性(r=0.326，P=0.025，表2)。

表2 食管癌組織中Survivin乙?；cKAT2A的相關性

2.6 食管癌EC109和正常食管黏膜上皮HEEC細胞中KAT2A和Survivin乙酰化蛋白表達KAT2A在EC109細胞中陽性率為(87.36±4.24)%，高于HEEC細胞中的(17.45±2.78)%。EC109細胞內(nèi)Survivin蛋白乙?；綖?87.79±4.12)%，高于HEEC細胞的(21.28±3.78)%(圖5)。

圖4 免疫熒光檢測Survivin和KAT2A在食管癌組織中表達：Survivin綠色熒光，KAT2A紅色熒光，DAPI細胞核染色，MERGE為三圖融合圖像

圖5 人食管癌EC109和正常食管黏膜上皮HEEC細胞系中KAT2A表達和Survivin乙?；剑篈.Western blot和免疫共沉淀法測定KAT2A表達和Survivin乙?；籅.定量檢測KAT2A蛋白表達；C.定量檢測Survivin乙?；鞍妆磉_；**P<0.01

2.7 下調(diào)KAT2A對Survivin mRNA和蛋白表達及Survivin蛋白乙酰化水平的影響合成的KAT2A-siRNA含有cy3紅色熒光標簽，轉染EC109細胞成功后可見細胞內(nèi)有紅色熒光表達(圖6)。qRT-PCR檢測三組細胞內(nèi)KAT2A mRNA和蛋白表達量結果顯示：si-K組mRNA和蛋白表達量明顯低于si-N組及NC組(P<0.05，圖7)，說明設計合成下調(diào)KAT2A的RNA干擾序列有效。si-K組Survivin mRNA和蛋白表達量與si-N和NC組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖8)，說明RNA干擾下調(diào)KAT2A后對Survivin mRNA和蛋白表達無影響。RNA干擾下調(diào)KAT2A后，si-K組Survivin蛋白乙?；斤@著下降，而si-N組和NC組Survivin蛋白乙酰化水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖9)。

明視野熒光視野疊加圖

圖7 RNA干擾KAT2A后KAT2A mRNA和蛋白表達量變化：A. KAT2A蛋白表達量；B.KAT2A mRNA相對表達量；與si-K相比，*P<0.05

2.8 下調(diào)KAT2A對wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表達的影響Western blot結果顯示：與si-N組和NC組相比，si-K組中wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表達量顯著下降(P<0.05)。si-N組和NC組相比，wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表達無變化(圖10)。

圖8 RNA干擾KAT2A對Survivin mRNA和蛋白表達量的影響：A. Survivin蛋白表達量；B. Survivin mRNA相對表達量

圖9 RNA干擾下調(diào)KAT2A對Survivin蛋白乙?；降挠绊?/p>

圖10 下調(diào)KAT2A對wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表達水平的影響

2.9 下調(diào)KAT2A對EC109細胞存活、遷移和侵襲能力的影響MTT實驗結果顯示：與si-N組和NC組相比，si-K組中EC109細胞的吸光度值顯著降低，細胞存活能力下降(圖11)。劃痕愈合實驗結果顯示：si-K組中EC109細胞劃痕愈合緩慢，遷移能力下降(圖12)。Transwell小室侵襲實驗結果顯示：si-K組中EC109細胞穿膜數(shù)量顯著減少，侵襲能力下降(圖13)。

圖11 下調(diào)KAT2A對食管癌EC109細胞存活能力的影響：與si-K相比，*P<0.05

圖12 下調(diào)KAT2A對食管癌EC109細胞遷移能力的影響

si-Ksi-NNC

3 討論

食管癌的發(fā)病較隱匿，部分患者發(fā)現(xiàn)時已發(fā)生遠處轉移，總體預后不佳[7]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學對基因的深入研究，靶向治療為食管癌患者提供了更好的選擇。因此，篩查食管癌發(fā)病相關因子為臨床提供診療靶點成為目前醫(yī)學領域研究的新熱點。蛋白乙?；揎梾⑴c多種生命活動，在調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡和侵襲機制過程中具有十分重要的作用[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)非組蛋白也可以發(fā)生乙?；?，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[9]。Survivin蛋白是一種凋亡抑制基因產(chǎn)物，在多種腫瘤中呈高表達，并與細胞的增殖和凋亡密切相關[10-11]。本課題組前期研究表明，Survivin蛋白與食管癌TNM分期、組織分化和淋巴結轉移密切相關[12]。本實驗證實，Survivin蛋白在食管癌組織中呈高表達并發(fā)生乙?；野┙M織中乙?；曙@著高于正常組織。進一步通過免疫共沉淀證實：在食管癌組織和EC109細胞中Survivin蛋白作為一種非組蛋白發(fā)生乙?；?，其結果與課題組在食管癌組織中的研究結果一致。然而，Survivin蛋白乙?；瘏⑴c食管癌發(fā)生、發(fā)展的深入機制仍不明確。

KAT2A屬于組蛋白乙酰轉移酶GNAT超家族的成員之一，可以催化多種蛋白底物發(fā)生乙?；?，并參與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[13-14]。本實驗結果證實KAT2A在癌組織中表達升高，但在食管癌中KAT2A作為乙?；D移酶能否催化Survivin的乙酰化修飾進而調(diào)控食管癌的發(fā)生發(fā)展尚需進一步驗證。進一步通過生物信息學預測結果顯示，乙?；D移酶KAT2A可以將Survivin作為底物催化其發(fā)生乙?；?，其可能發(fā)生乙酰化的賴氨酸(K)為121和349號位點。免疫熒光實驗證實，Survivin和KAT2A共同表達于食管癌細胞質，且兩者同時呈高表達狀態(tài)，且KAT2A表達與Survivin乙?；收嚓P；提示在食管癌中KAT2A可以與Survivin相互作用，KAT2A作為乙?；D移酶可能參與Survivin蛋白的乙?；揎?。

在沉默乙酰基轉移酶促進相關蛋白發(fā)生去乙?；饔脵C制中，下調(diào)KAT2A有可能發(fā)揮更高的去乙酰化作用。故本實驗設計合成KAT2A的siRNA干擾序列并轉染食管癌EC109細胞，結果顯示：KAT2A基因下調(diào)后食管癌細胞內(nèi)Survivin蛋白乙?；浇档?，提示Survivin的乙酰化修飾受乙?；D移酶KAT2A的調(diào)控，KAT2A是Survivin蛋白發(fā)生乙?；纳嫌畏肿?。細胞功能實驗結果顯示：下調(diào)KAT2A后，EC109細胞的存活能力下降，細胞的愈合遷移距離縮短，穿過濾膜的細胞數(shù)量明顯減少，提示下調(diào)KAT2A降低Survivin乙?；胶?，抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

上皮-間質轉變在惡性腫瘤的侵襲及轉移過程中具有重要作用[15]。腫瘤的上皮-間質轉化與Wnt/β-catenin信號通路的異常表達密切相關[16-17]。當Wnt/β-catenin信號通路異常激活時，多種因子可與β-catenin相互作用，使β-catenin由胞質轉移至核內(nèi)，Wnt/β-catenin信號通路相關因子發(fā)生改變，從而誘導細胞癌變[18-19]。本組檢測Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達結果證實：下調(diào)KAT2A可降低wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表達量，提示下調(diào)KAT2A降低Survivin乙?；胶?，可阻止Wnt/β-catenin通路的信號傳導，進而影響食管癌細胞的存活、遷移及侵襲能力。

綜上，食管癌中乙?；D移酶KAT2A與Survivin乙?；揎椕芮邢嚓P。外源性RNA干擾下調(diào)KAT2A表達能夠降低Survivin乙?；?，并抑制Wnt/β-catenin信號傳導通路，進而抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。KAT2A作為乙?；D移酶可能是調(diào)控Survivin發(fā)生乙酰化的重要上游分子學事件，為食管癌的臨床治療提供新的分子靶點。