線粒體途徑參與LASS2/TMSG1基因誘導(dǎo)人肺癌95C細(xì)胞凋亡的機(jī)制

李艷偉，劉水仙，劉崢璐，徐曉艷

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，根據(jù)2022年美國癌癥協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示肺癌男女性的病死率皆位居首位[1]。肺癌早期癥狀不明顯，往往確診時(shí)已為晚期。因此，尋找與肺癌診斷和治療相關(guān)的靶基因至關(guān)重要。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因TMSG1基因又稱作LASS2基因，包含有同源域(homeodomain)(又稱HOX域)和TLC(TRAM-LAG1-CLN8)域。文獻(xiàn)報(bào)道HOX域?qū)?xì)胞生長起一定的作用，其可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程實(shí)現(xiàn)的[2]。此外，HOX域可能通過與液泡型ATP酶(Vacuolar H+-ATPase, V-ATPase)V0區(qū)域的C亞基結(jié)合，對(duì)腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移起抑制作用，促進(jìn)其凋亡[3]。在調(diào)控細(xì)胞凋亡的多種轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中以線粒體通路最為經(jīng)典[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，LASS2/TMSG1蛋白的HOX域通過與V-ATPase C亞基結(jié)合，降低V-ATPase運(yùn)輸H+的能力，細(xì)胞內(nèi)呈酸性環(huán)境，進(jìn)而使線粒體發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與腫瘤細(xì)胞的凋亡，但具體機(jī)制尚不明確。本文初步探討LASS2/TMSG1基因是否通過V-ATPase調(diào)控人肺癌95C細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料人肺巨細(xì)胞癌低轉(zhuǎn)移亞系95C細(xì)胞株，購自上海康朗生物公司；人肺巨細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移亞系95D細(xì)胞株，購自上海復(fù)祥生物公司。LASS2/TMSG1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉?jiǎng)P基因公司；LASS2(C-11)：sc-390745抗體購自美國SANTA CRUZ公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒，購自索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞慢病毒感染及抗性基因篩選穩(wěn)定株 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，1×105個(gè)/孔接種到6孔板中培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染慢病毒48 h后更換成加有嘌呤霉素的完全RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后提取總RNA和蛋白進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分為三組：人肺癌95C細(xì)胞(正常組)、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組(陰性對(duì)照組)、LASS2/TMSG1基因沉默組。

1.2.2RT-PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá) 收集細(xì)胞沉淀，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。LASS2/TMSG1的PCR引物：正向引物為5′-GCATGGCCCACAAGTTCA-3′，反向引物為5′-CTGGGGATAGGCTGGTTA-3′，于PCR儀中擴(kuò)增完成。

1.2.3Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 用SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至NC膜上，按照β-actin(1 ∶1 000)、LASS2/TMSG1(1 ∶300)、P-Akt3(1 ∶200)、Akt3(1 ∶200)、Bax(1 ∶200)、BCL-2(1 ∶200)配制一抗、二抗(羊單克隆抗兔，1 ∶1 500)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1×105個(gè)/瓶接種于T25培養(yǎng)瓶，細(xì)胞融合度達(dá)70%后收集細(xì)胞；高速離心機(jī)中4 ℃、500g離心5 min，收集沉淀；按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5MTT比色法 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1 000個(gè)/孔接種到95孔板中，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，每隔24 h加入MTT溶液，培養(yǎng)箱孵育4 h后加入DMSO溶液，檢測(cè)490 nm處的OD值，連續(xù)記錄5天，獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及電鏡觀察細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu) (1)將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化后制成懸液，以1×105個(gè)/孔接種到6孔板中孵育24 h，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)并拍照。(2)將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞處理后取沉淀，2.5%戊二醛4 ℃固定1 h，PBS漂洗10 min×3次，鋨酸固定后，超純水再次漂洗，洗好的細(xì)胞團(tuán)塊梯度乙醇冰上脫水，放入丙酮與Epon812樹脂配置的液體中室溫浸透、包埋，電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.2.7JC-1染色觀察細(xì)胞線粒體膜電位的變化 將95C細(xì)胞種入6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，次日每孔加入1 mL新培養(yǎng)基和1 mL JC-1工作液。細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育結(jié)束后JC-1染色緩沖液(1×)清洗2次。更換新培養(yǎng)基后熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR及Western blot檢測(cè)肺癌95C與95D細(xì)胞LASS2/TMSG1 mRNA及蛋白的表達(dá)95C細(xì)胞中LASS2/TMSG1 mRNA表達(dá)以及蛋白表達(dá)明顯高于95D細(xì)胞(t=16.85，P=0.004；t=15.26，P=0.004，圖1)，選擇95C細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 RT-PCR及Western blot檢測(cè)肺癌95C、95D細(xì)胞系中LASS2/TMSG1 mRNA(A)及蛋白(B)的表達(dá)水平：**P<0.01

2.2 LASS2/TMSG1基因沉默后肺癌細(xì)胞LASS2/TMSG1 mRNA及蛋白的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：與正常組(4.116±0.300)和陰性對(duì)照組(3.984±0.038)相比，LASS2/TMSG1沉默組(1.032±0.276) LASS2/TMSG1 mRNA表達(dá)水平明顯降低(F=164.053，P<0.001)。Westren blot檢測(cè)結(jié)果：與正常組(0.898±0.044)和陰性對(duì)照組(0.926±0.207)相比，LASS2/TMSG1沉默組(0.356±0.764)LASS2/TMSG1蛋白水平顯著降低(F=18.293，P=0.003，圖2)，證明轉(zhuǎn)染成功。

圖2 RT-PCR及Western blot檢測(cè)沉默LASS2/TMSG1各組細(xì)胞中LASS2/TMSG1 mRNA(A)及蛋白(B)的表達(dá)：與正常組相比，**P<0.01，***P<0.001；與陰性對(duì)照組相比，##P<0.01，###P<0.001；1.正常組；2.陰性對(duì)照組；3.LASS2/TMSG1沉默組

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)LASS2/TMSG1基因沉默后肺癌細(xì)胞凋亡情況與正常組(14.85±2.33)%和陰性對(duì)照組(15.51±1.09)%相比，LASS2/TMSG1沉默組早期凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(8.48±1.12)%明顯降低(F=17.340，P=0.003)，而晚期凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 LASS2/TMSG1基因沉默后三組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況：與正常組相比，**P<0.01；與陰性對(duì)照組相比，##P<0.01

2.4 LASS2/TMSG1基因沉默對(duì)肺癌細(xì)胞體外增殖能力的影響MTT檢測(cè)接種細(xì)胞1、2、3、4、5天后的OD值，LASS2/TMSG1沉默組從第4天(F=66.318，P<0.001)、第5天(F=224.582，P<0.001)開始，細(xì)胞增殖能力明顯升高(圖4)。

圖4 LASS2/TMSG1基因沉默對(duì)肺癌細(xì)胞體外增殖能力的影響：與正常組相比，***P<0.001;與陰性對(duì)照組相比，###P<0.001

2.5 LASS2/TMSG1基因沉默后各組肺癌細(xì)胞的形態(tài)變化正常組：95C細(xì)胞大部分區(qū)域呈多邊形貼壁生長，細(xì)胞輪廓較清晰，部分區(qū)域細(xì)胞逐漸皺縮變圓，部分細(xì)胞有脫壁，細(xì)胞分布不均勻，數(shù)量較少；陰性對(duì)照組：大部分細(xì)胞呈多邊形貼壁生長，部分區(qū)域有變圓脫壁的細(xì)胞，細(xì)胞密度不高，分布較散，可見細(xì)胞成堆生長；LASS2/TMSG1沉默組：細(xì)胞呈多邊形貼壁生長，細(xì)胞數(shù)量較多，分布均勻，細(xì)胞輪廓清晰，生長狀態(tài)良好(圖5)。

2.6 LASS2/TMSG1基因沉默后肺癌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化陰性對(duì)照組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)基本完整，呈圓形、棒狀或橢圓形，膜基本完整，線粒體嵴疏松，部分有斷裂，排列不規(guī)則，尚未見明顯的凋亡小體；LASS2/TMSG1沉默組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)完整，呈棒狀，線粒體外膜完整，較清晰，線粒體內(nèi)嵴正常清晰，分布較密集，未見凋亡小體(圖6)。

正常組陰性對(duì)照組LASS2/TMSG1沉默組

陰性對(duì)照組LASS2/TMSG1沉默組

2.7 LASS2/TMSG1基因沉默后肺癌細(xì)胞線粒體膜電位的變化JC-1存在單體和多聚體兩種狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)較好時(shí)，JC-1在線粒體呈現(xiàn)多聚體狀態(tài)，顯示紅色熒光；當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，JC-1以單體形式呈現(xiàn)，顯示綠色熒光，紅/綠熒光強(qiáng)度的比值反應(yīng)ΔΨm水平，熒光顯微鏡觀察染色細(xì)胞并拍照，對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。與正常組(0.398±0.068)和陰性對(duì)照組(0.476±0.073)相比，LASS2/TMSG1沉默組(0.713±0.080)紅色熒光強(qiáng)度相當(dāng)，綠色熒光相對(duì)低，紅/綠熒光比值下降(F=14.687，P=0.005，圖7)。

正常組陰性對(duì)照組LASS2/TMSG1沉默組

2.8 LASS2/TMSG1基因沉默肺癌細(xì)胞中P-Akt3、Akt3、BCL-2、Bax蛋白表達(dá)與正常組(0.327±0.028)及陰性對(duì)照組(0.341±0.026)相比，LASS2/TMSG1沉默組P-Akt3蛋白表達(dá)量(0.553±0.060)明顯增高(F=28.628，P<0.001)，Akt3蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P-Akt3/Akt3顯著提高；Bax表達(dá)量無影響；與正常組(0.839±0.172)和陰性對(duì)照組(0.860±0.122)相比，LASS2/TMSG1沉默組(1.162±0.061)BCL-2蛋白的表達(dá)量升高(F=6.049，P=0.036)，BCL-2/Bax升高(圖8)。

3 討論

肺癌作為全球病死率最高的腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。尋找有效的治療靶點(diǎn)是當(dāng)務(wù)之急。既往研究顯示，LASS2/TMSG1通過其HOX功能域，提高細(xì)胞內(nèi)H+含量[8]，使線粒體產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)探索LASS2/TMSG1基因的表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以及能否通過線粒體凋亡途徑發(fā)揮作用。徐曉艷[9]利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法沉默人前列腺癌PC-3M-2B4(低轉(zhuǎn)移潛能)細(xì)胞中LASS2/TMSG1基因后，對(duì)PC-3M-2B4細(xì)胞的惡性進(jìn)程起促進(jìn)作用。LASS2/TMSG1在肺癌[7]、肝癌[10]、乳腺癌[11]、鼻咽癌[12]等癌癥轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的負(fù)調(diào)控作用也被證實(shí)，但在凋亡方面的研究較少。

本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，LASS2/TMSG1能夠抑制95C細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，能夠使95C細(xì)胞內(nèi)H+濃度升高。有文獻(xiàn)表明[13]，細(xì)胞內(nèi)酸性環(huán)境可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此推測(cè)LASS2/TMSG1高表達(dá)可能造成95C細(xì)胞凋亡率升高。構(gòu)建LASS2/TMSG1基因低表達(dá)人肺癌95C細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合AV-PI雙染，LASS2/TMSG1沉默組的細(xì)胞凋亡率明顯低于另外兩組(P<0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：從第4天開始，LASS2/TMSG1沉默組細(xì)胞增殖能力明顯增加，可能是LASS2/TMSG1基因沉默后，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。細(xì)胞受到啟動(dòng)凋亡通路的各種信號(hào)刺激，線粒體內(nèi)外膜之間的線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(mPTP)會(huì)不可逆的過度開放，使線粒體跨膜電位ΔΨm崩解，ΔΨm下降，呼吸鏈解偶聯(lián)，線粒體基質(zhì)滲透壓升高，線粒體內(nèi)膜腫脹，釋放膜間促凋亡蛋白(Cyt-c、Bax等)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14-15]。在凋亡過程中，線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變往往早于核及染色體的改變，揭示在凋亡進(jìn)程中線粒體可能起到了一定的樞紐作用。前期研究表明：LASS2/TMSG1通過使線粒體產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。因此，線粒體結(jié)構(gòu)常用來間接反映凋亡狀態(tài)。線粒體功能障礙時(shí)，常表現(xiàn)為小泡狀膜結(jié)構(gòu)，電鏡下不同截面的線粒體會(huì)增多，線粒體會(huì)發(fā)生腫脹、嵴消失等變化[17]。本實(shí)驗(yàn)用電鏡對(duì)細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察：陰性對(duì)照組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)顯示出早期凋亡的特征；而LASS2/TMSG1沉默組未見明顯凋亡形態(tài)。推測(cè)LASS2/TMSG1基因沉默后，對(duì)95C細(xì)胞的線粒體超微結(jié)構(gòu)起到一定的保護(hù)作用，抑制了腫瘤細(xì)胞的早期凋亡過程。提示線粒體參與腫瘤細(xì)胞凋亡的過程。JC-1染色發(fā)現(xiàn)：LASS2/TMSG1沉默組的紅/綠熒光強(qiáng)度比值較正常組和陰性對(duì)照組高，推測(cè)LASS2/TMSG1基因能夠使95C細(xì)胞的線粒體膜電位下降，線粒體內(nèi)膜腫脹，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在線粒體參與細(xì)胞凋亡的途徑中，多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮重要作用，PI3K/AKT信號(hào)通路與腫瘤進(jìn)展較為密切，在細(xì)胞的增殖、存活和凋亡[18-19]過程中有一定的調(diào)控意義。BCL-2家族是線粒體凋亡途徑中的主要調(diào)控者，通過激活一系列下游基因調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[20-21]，同時(shí)作為PI3K/AKT信號(hào)通路重要靶點(diǎn)，通過BCL-2/Bax的比例影響細(xì)胞凋亡。AKT激活可促進(jìn)BCL-2的生成，抑制Bax等促凋亡蛋白的形成，導(dǎo)致BCL-2/Bax比例上調(diào)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LASS2/TMSG1基因沉默后，P-Akt3/Akt3及BCL-2/Bax升高，細(xì)胞凋亡受到抑制，與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致。提示LASS2/TMSG1基因沉默后抑制95C細(xì)胞凋亡，可能與激活PI3K/AKT聯(lián)合線粒體參與的信號(hào)通路有關(guān)。

圖8 LASS2/TMSG1基因沉默后肺癌細(xì)胞P-Akt3、Akt3、BCL-2、Bax蛋白表達(dá)：與正常組相比，*P<0.05，***P<0.001；與陰性對(duì)照組相比，#P<0.05，###P<0.001

綜上，沉默人肺癌95C細(xì)胞LASS2/TMSG1基因，其可以通過HOX域與ATP6L亞基結(jié)合使胞內(nèi)H+濃度升高，進(jìn)而使線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，ΔΨm降低，線粒體凋亡通路中的相關(guān)蛋白釋放，促進(jìn)95C細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。目前，LASS2/TMSG1基因是否影響線粒體凋亡通路中其它蛋白的表達(dá)及TLC參與的神經(jīng)酰胺合成等，還需進(jìn)一步分析。