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    LYRM2表達(dá)通過調(diào)控糖酵解代謝影響結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖、侵襲

    2022-02-01 03:39:28吳婧婧王年飛
    關(guān)鍵詞:糖酵解結(jié)腸癌直腸癌

    黃 琦,吳婧婧,彭 瑤,李 娜,王年飛

    結(jié)直腸癌是胃腸道常見的腫瘤之一。近年,全球結(jié)直腸癌發(fā)病率、病死率顯著提升。2020年全球結(jié)直腸癌總發(fā)病率上升至第3位,病死率上升至全球癌癥死亡原因的第2位[1]。因此,發(fā)現(xiàn)新的介導(dǎo)結(jié)直腸癌惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)控分子有望為控制結(jié)直腸癌的發(fā)展提供靶點(diǎn),對提高結(jié)直腸癌患者的生存具有重要的臨床價(jià)值,也是亟待解決的問題。有研究顯示,腫瘤代謝過程的干預(yù)是實(shí)現(xiàn)腫瘤防治的新手段,具有較好的抑制效果[2-3]。本組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸癌中高表達(dá)的LYRM2分子可通過Akt-LYRM2-Comlplex Ⅰ代謝軸在結(jié)直腸癌細(xì)胞氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)代謝中發(fā)揮重要作用[4]。因此,本文著重探討LYRM2對結(jié)腸癌糖酵解代謝的調(diào)控機(jī)制,為LYRM2作為結(jié)腸癌的潛在治療靶點(diǎn)提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞與主要試劑人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所,培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中。LYRM2過表達(dá)載體L2HA(對照為CHA載體)和LYRM2干擾載體SH1KD(對照為GPH載體)及相應(yīng)的慢病毒顆粒購自上海英為信公司(因LYRM2抗體效果不佳,構(gòu)建L2HA、CHA載體中加入HA標(biāo)簽便于蛋白水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功,CHA為帶有HA標(biāo)簽的對照空載體,GPH為對照空載體);RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清等購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒購自上海李記公司;Transwell試劑盒購自北京康寧公司;Seahorse XF糖酵解壓力測試試劑盒購自美國Agilent公司;細(xì)胞乳酸含量檢測試劑盒、代謝酶活性檢測試劑盒,均購自北京索萊寶公司。

    1.2 腫瘤細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h,將對數(shù)生長期的RKO細(xì)胞以2×105個/孔鋪至24孔板中,細(xì)胞匯合度約50%。按病毒轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作。SH1KD ShRNA序列:5′-TGATGATTACT CAAGGCAATA-3′。

    1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖按2 000個/孔的細(xì)胞量重復(fù)接種至6塊96孔板中,更換10 μL CCK-8+100 μL新鮮培養(yǎng)基的混合液(避免產(chǎn)生氣泡),680型酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光值。每24 h檢測1塊96孔板,連續(xù)檢測6天。

    1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力劃痕實(shí)驗(yàn):將5×106個/孔細(xì)胞接種至6孔板中,待匯合度達(dá)80%~90%時(shí),移除培養(yǎng)基,超凈臺中用200 μL的移液槍頭劃3條直線,分別于0 h和培養(yǎng)48 h后拍照。Transwell實(shí)驗(yàn):基質(zhì)膠和無血清培養(yǎng)基按1 ∶5稀釋、混勻(冰浴上操作),取100 μL于上室,37 ℃孵育4~5 h至凝固。取100 μL密度為1×104/mL重懸于無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞鋪于上室,下室加入含15%FBS的培養(yǎng)基,37 ℃孵育24 h。經(jīng)10%中性福爾馬林固定,0.1%結(jié)晶紫染色15 min,PBS沖洗2次,棉棒輕柔擦除小室上表面細(xì)胞。顯微鏡觀察小室下層穿過的細(xì)胞數(shù),隨機(jī)計(jì)數(shù)5個視野。

    1.5 海馬(Seahorse)細(xì)胞能量檢測按(1.0~1.5)×104個/孔細(xì)胞種植于海馬細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔約80 μL,于培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。每孔加入200 μL校正液到Sensor Cartridge中,于無CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中水化過夜。更換培養(yǎng)基,加入基礎(chǔ)測試液潤洗細(xì)胞3次,最終維持每孔175 μL,于無CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。配制檢測過程中需加入的藥物:10 mmol/L 葡萄糖、1 μmol/L寡霉素、50 mmol/L 2-DG。將矯正后的Cartridge板每個加藥孔中加入相應(yīng)藥物25 μL。機(jī)器中矯正平衡30 min后運(yùn)行檢測。完成后計(jì)數(shù)各孔細(xì)胞,標(biāo)準(zhǔn)化最終檢測結(jié)果,得到各組細(xì)胞糖酵解代謝水平。進(jìn)一步基于Wave軟件轉(zhuǎn)化、計(jì)算得出各組細(xì)胞ATP含量(單位定義為每分鐘104個細(xì)胞產(chǎn)生的ATP含量)。

    1.6 細(xì)胞乳酸含量檢測按試劑盒說明書溶解、配制各試劑。按50×104個細(xì)胞:1 mL提取液混勻細(xì)胞,冰浴超聲波破碎細(xì)胞,4 ℃、12 000g離心10 min后取上清。按試劑盒說明書順序加樣各試劑后,于分光光度計(jì)檢測、計(jì)算細(xì)胞乳酸含量,具體溶劑配制,計(jì)算公式參考說明書,單位定義為104個細(xì)胞的產(chǎn)生乳酸量。

    1.7 細(xì)胞代謝酶活性檢測HK2、PK、PHK、LDH按試劑盒說明書溶解、配制各試劑。收集細(xì)胞至離心管中,按50×104細(xì)胞:1 mL提取液混勻細(xì)胞,冰浴超聲波破碎細(xì)胞,4 ℃、8 000g離心10 min后取上清。按說明書順序加樣各試劑后于分光光度計(jì)檢測、計(jì)算各代謝酶活性。具體溶劑配制、計(jì)算公式參考試劑盒說明書。單位U定義:每1×104個細(xì)胞每分鐘生成1 nmoL NADPH定義為1個酶活力單位。

    2 結(jié)果

    2.1 LYRM2過表達(dá)、敲低結(jié)腸癌細(xì)胞系的構(gòu)建及驗(yàn)證利用LYRM2過表達(dá)載體L2HA和干擾載體SH1KD構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)LYRM2過表達(dá)及敲低結(jié)腸癌細(xì)胞系。mRNA表達(dá)驗(yàn)證:轉(zhuǎn)染L2HA的RKO細(xì)胞LYRM2的mRNA表達(dá)(167.10±3.73)顯著高于對照CHA細(xì)胞(8.79±0.17),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);轉(zhuǎn)染SH1KD的RKO細(xì)胞LYRM2的mRNA表達(dá)(1.13±0.11)顯著低于對照GPH細(xì)胞(11.51±0.82),敲低率達(dá)90%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖1A)。利用HA標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),結(jié)果證實(shí)LYRM2蛋白在RKO細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染,穩(wěn)定表達(dá)(圖1B)。

    圖1 LYRM2過表達(dá)及敲低細(xì)胞系mRNA及蛋白水平驗(yàn)證:A. mRNA表達(dá);B.蛋白表達(dá);***P<0.001

    2.2 LYRM2差異表達(dá)對RKO細(xì)胞增殖的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示:LYRM2過表達(dá)L2HA細(xì)胞的增殖比對照CHA細(xì)胞顯著加快,尤其在第6天,LYRM2過表達(dá)L2HA細(xì)胞的吸光度是對照CHA細(xì)胞的1.53倍[OD450 nm:(1.83±0.08)vs(1.20±0.09),P<0.001];第6天LYRM2敲低SH1KD細(xì)胞的增殖速率比對照GPH細(xì)胞顯著降低[OD450 nm:(0.82±0.07)vs(1.35±0.09),P<0.01,圖2]。

    圖2 LYRM2差異表達(dá)對RKO細(xì)胞增殖的影響:***P<0.001

    2.3 LYRM2差異表達(dá)對RKO細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示:LYRM2過表達(dá)L2HA細(xì)胞隨時(shí)間延長遷移速度顯著高于對照CHA細(xì)胞,在48 h遷移距離分別為(46.67±0.33) μm和(28.33±0.33) μm;LYRM2敲低的SH1KD細(xì)胞在48 h遷移距離僅約(3.67±0.33) μm,顯著低于對照GPH細(xì)胞(27.67±0.33) μm,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖3)。

    圖3 LYRM2差異表達(dá)對RKO細(xì)胞遷移能力的影響

    2.4 LYRM2差異表達(dá)對RKO細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)顯示:LYRM2過表達(dá)的L2HA細(xì)胞侵襲數(shù)目(941.70±39.55)比對照CHA細(xì)胞(469.30±21.53)明顯增多;LYRM2敲低的SH1KD細(xì)胞侵襲數(shù)目(87.00±9.29)比對照GPH細(xì)胞(504.30±3.48)明顯減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖4)。

    圖4 LYRM2差異表達(dá)對RKO細(xì)胞侵襲能力的影響

    2.5 LYRM2差異表達(dá)對RKO細(xì)胞糖酵解代謝的影響Seahorse實(shí)驗(yàn)檢測不同LYRM2表達(dá)RKO細(xì)胞的糖酵解代謝水平;通過細(xì)胞外酸化率(extra-cellular acidification rate,ECAR)檢測細(xì)胞的胞外產(chǎn)酸能力,間接顯示糖酵解能力。在不同時(shí)間點(diǎn)分別加入高濃度葡萄糖、寡霉素(ATP合酶抑制劑)和2-DG(糖酵解抑制劑)檢測在不含葡萄糖或丙酮酸的糖酵解壓力測試培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的糖酵解水平。結(jié)果顯示:LYRM2過表達(dá)的L2HA細(xì)胞糖酵解代謝水平顯著高于對照CHA細(xì)胞,LYRM2敲低SH1KD細(xì)胞糖酵解水平明顯低于對照GPH細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖5)。計(jì)算細(xì)胞ATP含量與細(xì)胞糖酵解結(jié)果一致,表現(xiàn)為LYRM2過表達(dá)L2HA細(xì)胞ATP含量高(5.68±0.39) pmoL,LYRM2敲低SH1KD細(xì)胞ATP含量低(1.71±0.09) pmoL,分別與對照CHA、GPH細(xì)胞相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。各組細(xì)胞內(nèi)乳酸生成量:LYRM2過表達(dá)L2HA細(xì)胞內(nèi)乳酸含量(66.70±0.87) nmoL比對照CHA細(xì)胞(10.08±0.12) nmoL明顯增加(P<0.001),LYRM2敲低SH1KD細(xì)胞內(nèi)乳酸含量(6.02±0.10) nmoL比對照GPH細(xì)胞(9.65±0.20) nmoL明顯減少(P<0.01,圖6)。

    2.6 LYRM2差異表達(dá)對RKO細(xì)胞代謝酶活性的影響腫瘤組織糖酵解關(guān)鍵代謝酶包括HK、PFK異構(gòu)體和PK。檢測不同LYRM2表達(dá)的RKO細(xì)胞內(nèi)各糖酵解關(guān)鍵代謝酶活性:LYRM2高表達(dá)L2HA細(xì)胞內(nèi)HK2活性為(0.126±0.002) U,顯著高于對照CHA細(xì)胞HK2活性(0.098±0.002) U;LYRM2低表達(dá)SH1KD細(xì)胞內(nèi)HK2活性為(0.076±0.002) U,顯著低于對照GPH細(xì)胞HK2活性(0.099±0.002) U,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。各LYRM2差異表達(dá)的RKO細(xì)胞中,PFK和PK酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7)。

    圖5 LYRM2對RKO細(xì)胞糖酵解代謝的影響:ECAR.細(xì)胞外酸化率

    圖6 LYRM2表達(dá)對RKO細(xì)胞內(nèi)ATP及乳酸生成的影響:A. ATP;B.乳酸;**P<0.01,***P<0.001

    3 討論

    LYRM2位于6號染色體,編碼約10.4×103大小的蛋白質(zhì)。目前,有關(guān)LYRM2的研究有限。本組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LYRM2蛋白主要定位于線粒體,在結(jié)直腸癌中可通過與Complex Ⅰ結(jié)合參與Complex Ⅰ活性的調(diào)控,對結(jié)直腸癌細(xì)胞OXPHOS代謝有顯著調(diào)節(jié)作用[4]。

    腫瘤細(xì)胞為維持不受控的迅速增殖,需要大量的能量及營養(yǎng)物質(zhì)。糖酵解因其產(chǎn)能速率明顯快于線粒體OXPHOS而被腫瘤細(xì)胞主要利用。當(dāng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解代謝被抑制時(shí),OXPHOS會代償性增加以維持腫瘤細(xì)胞的存活及增殖,這種腫瘤細(xì)胞適應(yīng)性的調(diào)整其代謝途徑的行為稱為腫瘤細(xì)胞的可塑性[5-6]。在氧氣充足的條件下,腫瘤細(xì)胞依賴有氧糖酵解和OXPHOS雙重代謝供能,不同腫瘤細(xì)胞的差異在于糖酵解和OXPHOS產(chǎn)能比例不同,一些腫瘤細(xì)胞中OXPHOS產(chǎn)能普遍超過40%,在某些特殊細(xì)胞中如MCF-7,這一比例可高達(dá)80%[7]。越來越多的證據(jù)表明,代謝的改變與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[8]。目前,腫瘤的特征在經(jīng)歷Hanahan等[9]的三代更新后,“細(xì)胞能量代謝的異常調(diào)控”仍作為腫瘤的十四大特征之一,其始終作為腫瘤進(jìn)展中的核心問題。研究提示腫瘤代謝過程的干預(yù)是實(shí)現(xiàn)腫瘤治療新的手段之一,如果能夠同時(shí)性阻斷腫瘤細(xì)胞糖酵解代謝和OXPHOS代謝可能成為治療腫瘤的新策略。本組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí),LYRM2對結(jié)直腸癌細(xì)胞的OXPHOS代謝具有重要的調(diào)控作用;本組發(fā)現(xiàn)LYRM2表達(dá)對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞糖酵解代謝也具有顯著影響:LYRM2高表達(dá)促進(jìn)RKO細(xì)胞糖酵解代謝,LYRM2低表達(dá)抑制RKO細(xì)胞糖酵解代謝。對糖酵解代謝過程限速酶活性分析發(fā)現(xiàn):LYRM2高表達(dá)增強(qiáng)RKO細(xì)胞內(nèi)HK2活性,LYRM2低表達(dá)抑制RKO細(xì)胞內(nèi)HK2活性。由此,作者推測LYRM2可能通過調(diào)控結(jié)腸癌RKO細(xì)胞糖酵解過程限速酶HK2的活性參與糖酵解代謝調(diào)節(jié),進(jìn)一步影響RKO細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲表型。

    基于LYRM2定位于線粒體,參與線粒體Complex Ⅰ活性調(diào)節(jié),作者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),Complex Ⅰ對于誘導(dǎo)糖酵解,維持細(xì)胞的增殖存活至關(guān)重要[10-13]。功能正常的Complex Ⅰ可以誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)表達(dá),繼而激活細(xì)胞糖酵解,并激活相關(guān)致瘤通路。當(dāng)Complex Ⅰ功能失調(diào),線粒體內(nèi)多種參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶包括α-酮戊二酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶復(fù)合體等受到影響,線粒體內(nèi)α-酮戊二酸的累積促使HIF-1α的降解,即使在無氧條件下也不能誘導(dǎo)糖酵解的發(fā)生[10-11]。這可能是LYRM2表達(dá)誘導(dǎo)糖酵解代謝改變的間接機(jī)制。本組通過酶活實(shí)驗(yàn)證實(shí),LYRM2表達(dá)對糖酵解代謝限速酶HK2的活性產(chǎn)生影響,這可能是LYRM2誘發(fā)糖酵解代謝改變的直接通路,但需進(jìn)一步探索及驗(yàn)證。

    圖7 LYRM2表達(dá)對RKO細(xì)胞內(nèi)代謝酶活性的調(diào)節(jié):A.HK2;B.PFK;C.PK;***P<0.001,ns.差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

    研究顯示結(jié)直腸癌中HK2蛋白水平上調(diào),與腫瘤大小、侵犯深度、肝臟轉(zhuǎn)移及腫瘤分期等顯著相關(guān),且HK2高表達(dá)與患者復(fù)發(fā)及總病死率增加密切相關(guān),HK2高表達(dá)是結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素[14-15]。靶向HK2的治療已提示具有較好的抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展的效果[16-18]。結(jié)直腸癌細(xì)胞HK2敲低后,細(xì)胞的乳酸生成量、增殖速率及遷移能力均明顯下降,同時(shí)對5-氟尿嘧啶化療敏感性增加[19]。即便如此,糖酵解調(diào)控酶活性受腫瘤微環(huán)境變化的影響,單一靶點(diǎn)抑制不足以抑制腫瘤增殖,多靶點(diǎn)聯(lián)合治療可能為更好的選擇??傊?,LYRM2作為同時(shí)參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞OXPHOS和糖酵解代謝分子,可能為結(jié)腸癌的治療提供新靶點(diǎn)。

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