好氧生物預(yù)處理時(shí)間對(duì)玉米秸稈水解酸化的影響

李希越, 王洪波, 趙玉曉, 華棟梁, 王 寧

(1.山東建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250101； 2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)能源研究所,山東 濟(jì)南 250014)

據(jù)《第二次全國(guó)污染源普查公報(bào)》公布數(shù)據(jù)，2017年我國(guó)秸稈產(chǎn)生量為8.05億噸，其中可收集資源量6.74億噸[1]。秸稈如未得到有效處理，不僅會(huì)造成極大的資源浪費(fèi)，還會(huì)帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。以能源化、資源化為目的的厭氧發(fā)酵不僅可以解決秸稈造成的環(huán)境污染問題，還可以制取脂肪酸、乳酸、甲烷等重要化學(xué)品及能源產(chǎn)品，是秸稈處理的重要技術(shù)之一[2-5]。水解酸化階段是秸稈厭氧發(fā)酵主要的限速步驟。秸稈中木質(zhì)素與纖維素和半纖維素的三維空間交聯(lián)結(jié)構(gòu)，對(duì)生物降解形成了屏蔽作用，同時(shí)半纖維素對(duì)纖維素的包裹作用以及纖維素本身的結(jié)晶結(jié)構(gòu)使得秸稈水解酸化緩慢，嚴(yán)重限制了秸稈厭氧發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用。好氧生物預(yù)處理是秸稈厭氧發(fā)酵重要的預(yù)處理方法之一，具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。Zhao等[6]利用白腐菌對(duì)玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理后用于固體厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷，將甲烷產(chǎn)量提高了29.2%。黃開明等[7]利用復(fù)合菌系對(duì)玉米秸稈進(jìn)行處理后用于高效厭氧消化產(chǎn)甲烷，有效促進(jìn)了沼氣產(chǎn)率。但在以能源化、資源化為目的的秸稈厭氧發(fā)酵過程中，好氧生物預(yù)處理通常借鑒以減量化、資源化為目的的堆肥或漚肥，采用兼性木質(zhì)素降解微生物對(duì)秸稈進(jìn)行處理，存在促進(jìn)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣效果不明顯等問題。López等[8]利用黃曲霉菌預(yù)處理農(nóng)業(yè)廢棄物，木質(zhì)素降解率為5%～20%，其生物降解性有所提高。Mustafa等[9]利用平菇和里氏木霉預(yù)處理玉米秸稈，研究發(fā)現(xiàn)將處理時(shí)間由20天延長(zhǎng)到30天，木質(zhì)素降解率提高了10%左右，但在隨后的厭氧發(fā)酵中累計(jì)產(chǎn)氣量降低了50%。白曉鳳等[10]研究發(fā)現(xiàn)好氧生物處理秸稈時(shí)間超過4天，累計(jì)產(chǎn)氣量反而低于未處理組。針對(duì)以能源化利用為目的的厭氧發(fā)酵工藝中，好氧生物預(yù)處理存在的促進(jìn)厭氧發(fā)酵效果不明顯、產(chǎn)酸產(chǎn)氣量降低等問題，本研究考察了復(fù)合菌系好氧預(yù)處理對(duì)玉米秸稈厭氧發(fā)酵水解酸化的影響，分析了好氧生物預(yù)處理中玉米秸稈纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的變化規(guī)律以及微生物群落結(jié)構(gòu)變化，以期為好氧生物預(yù)處理強(qiáng)化秸稈厭氧發(fā)酵的工程運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

玉米秸稈，2020年取自山東省濟(jì)南市章丘區(qū)農(nóng)田，經(jīng)自然風(fēng)干后備用，使用前破碎為寬1～2 cm，長(zhǎng)2 cm的碎片，玉米秸稈含纖維素37.69%，半纖維素38.16%，木質(zhì)素9.93%。

復(fù)合菌系，商業(yè)液體有機(jī)肥發(fā)酵劑(貝佳有機(jī)肥發(fā)酵劑)，主要微生物包括小囊菌(Microascales)、放線菌(Actinomycetes)、煤炱目(Capnodiales)、散囊菌(Eurotiales)、芽孢桿菌(Bacillus)、糞殼菌(Sordariales)、曲霉菌(Aspergillus)、酵母菌(Saccharomyces)，有效活菌數(shù)≥1×109個(gè)/mL。

玉米秸稈厭氧發(fā)酵所用厭氧污泥取自山東省德州市樂陵勝利新能源有限責(zé)任公司秸稈沼氣厭氧發(fā)酵罐，含水率92.19%，含揮發(fā)性固體72.25%，主要微生物菌群包括纖維素分解菌、產(chǎn)酸菌和產(chǎn)甲烷古菌等，如厚壁菌(Firmicutes)、擬桿菌(Bacteroidetes)、變形菌(Proteobacteria)和古菌(Euryarchaeota)等。使用前加熱到102 ℃，保持30 min，以去除產(chǎn)甲烷菌影響。所用酶活試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

HWS-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱、ZQPL-200振蕩培養(yǎng)箱，天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；ANKOM A200i型纖維分析儀，美國(guó)ANKOM；蔡司SUPRATM55熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡；賽默飛Nicolet iS 10傅里葉紅外變換光譜儀；島津XRD- 6100型X射線衍射儀；安捷倫7890A氣相色譜儀。

1.2 秸稈的厭氧發(fā)酵

1.2.1秸稈好氧生物預(yù)處理 取20 g(絕干質(zhì)量)玉米秸稈置于500 mL的錐形瓶中，加入5 mL復(fù)合菌系(已優(yōu)化的)，加入去離子水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系含水率65%，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行好氧生物處理，溫度(35±1)℃，濕度65%。設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)組，分別為好氧處理1～5 d，以未預(yù)處理的玉米秸稈為對(duì)照組。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行。好氧生物預(yù)處理結(jié)束后將各實(shí)驗(yàn)組瓶?jī)?nèi)原料平均分成兩份，一份進(jìn)行木質(zhì)纖維素成分、傅里葉紅外光譜(FT-IR)、X射線衍射(XRD)、酶活性、微生物群落結(jié)構(gòu)等指標(biāo)測(cè)定，一份進(jìn)行后續(xù)厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.2.2秸稈水解酸化 將1.2.1節(jié)預(yù)處理后的玉米秸稈移入500 mL厭氧發(fā)酵瓶中，接種厭氧污泥并補(bǔ)充去離子水，使最終厭氧發(fā)酵體積為500 mL，污泥質(zhì)量濃度3 500 mg/L，用4 mol/L HCl或4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)瓶?jī)?nèi)初始pH值為6，用氮?dú)馀懦齾捬醢l(fā)酵瓶中氧氣后，迅速密封發(fā)酵瓶，置于振蕩培養(yǎng)箱中振蕩發(fā)酵15 d，振蕩速度130 r/min，溫度(35±1)℃，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，前5天每天測(cè)定乙醇、揮發(fā)性脂肪酸等，5天后每2天測(cè)定一次。

1.3 分析方法

1.3.1玉米秸稈中成分的測(cè)定 將干燥后的玉米秸稈粉碎至粒徑0.6～0.85 mm，稱取1 g，測(cè)定纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量[11]。

1.3.2掃描電子顯微鏡觀察 對(duì)觀察樣品連續(xù)冷凍干燥16 h，噴金制樣，使用掃描電子顯微鏡掃描觀察樣品表面物理形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。

1.3.3FT-IR和XRD分析 用傅里葉紅外變換光譜儀研究玉米秸稈好氧生物預(yù)處理過程中官能團(tuán)變換。各取少量粉碎的玉米秸稈樣品，加入100倍的溴化鉀粉末于瑪瑙研缽中磨細(xì)，壓片，掃描波數(shù)4000～500 cm-1，共掃描16次[12]。

用X射線衍射儀分析玉米秸稈好氧生物預(yù)處理過程中結(jié)晶度變化，衍射儀掃描速率為12 (°)/min，掃描范圍5～50°，發(fā)生器工作電壓30 kV，電流30 mA。結(jié)晶度指數(shù)(ICr)計(jì)算公式如下[13]：

式中：ICr—結(jié)晶度指數(shù)；I002—色譜圖中結(jié)晶區(qū)002衍射晶面峰(2θ=22°)強(qiáng)度；I001—色譜圖中非結(jié)晶區(qū)的散射峰(2θ=16°)強(qiáng)度。

1.3.4酶活性測(cè)定 按照文獻(xiàn)[14]所述方法提取粗酶液，取1.2.1節(jié)預(yù)處理后的樣品12 g浸入60 mL蒸餾水中，4 ℃靜置24 h，紗布過濾，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液，置于冰上待用。采用Bradford法[15]測(cè)定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)試劑盒中說明書，測(cè)定粗酶液中纖維素酶、木聚糖酶、漆酶、錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶濃度，酶活性按蛋白濃度計(jì)算[16]。

1.3.5微生物群落結(jié)構(gòu)分析 使用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，每次提取時(shí)重復(fù)3個(gè)平行樣品試驗(yàn)，將試驗(yàn)取得DNA進(jìn)行混合獲得最終代表性樣品，分別對(duì)細(xì)菌和真菌進(jìn)行16S rDNA與ITS擴(kuò)增，高通量測(cè)序。

1.3.6乙醇及揮發(fā)性脂肪酸測(cè)定 乙醇及揮發(fā)性脂肪酸利用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定前取發(fā)酵液于6 000 r/min下離心10 min，上清液通過0.45 μm的水系濾膜過濾，然后用5%磷酸溶液酸化。

氣相色譜分析條件：色譜柱型號(hào)Agilent 19091F-105(240 ℃；50 m×200 μm×0.3 μm)，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)；汽化室溫度200 ℃，F(xiàn)ID溫度250 ℃，載氣(N2)流速25 mL/min，分流比10 ∶1。采用程序升溫，起始柱箱溫度60 ℃，以10 ℃/min的速率升溫到110 ℃，再以5 ℃/min的速率升溫至210 ℃。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

微生物數(shù)據(jù)圖形繪制均在I-Sanger云平臺(tái)上完成。其余所得數(shù)據(jù)采用Origin 2018軟件進(jìn)行處理與圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 好氧生物預(yù)處理時(shí)間對(duì)玉米秸稈降解的影響

好氧生物預(yù)處理過程中玉米秸稈中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量變化見表1。由表1可知，隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，玉米秸稈的降解率持續(xù)增加，預(yù)處理5天后質(zhì)量減少3 432 mg，總降解率為17.16%。玉米秸稈中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素質(zhì)量均呈下降趨勢(shì)，但降解程度有所不同。處理前 3天 玉米秸稈中纖維素降解較慢，預(yù)處理3 d的降解率為4.88%；隨后降解速度有所增加，處理5 d后，總降解率為8.47%，低于半纖維素與木質(zhì)素降解率。半纖維素降解情況與纖維素類似，前3天降解較慢，預(yù)處理3 d的降解率為7.51%，預(yù)處理5 d后半纖維素質(zhì)量降為5 908 mg，總降解率為22.59%。而木質(zhì)素在前3天的處理過程降解迅速，預(yù)處理3 d的木質(zhì)素降解率達(dá)到了19.35%，3 d后木質(zhì)素降解開始變慢，處理5 d后，總降解率為21.85%，低于半纖維素降解率。

表1 好氧生物處理過程中玉米秸稈木質(zhì)纖維素成分變化Table 1 Changes of lignocellulosic components in corn straw during aerobic biological pretreatment

目前在秸稈等木質(zhì)纖維類原料厭氧發(fā)酵工程中用于好氧生物預(yù)處理的微生物大多為兼性木質(zhì)素降解微生物，在降解木質(zhì)素的同時(shí)還能降解纖維素和半纖維素。本研究所用復(fù)合菌系主要含芽孢桿菌、放線菌、酵母菌、曲霉菌，可同時(shí)利用纖維素、半纖維素和木質(zhì)素作為底物，因此處理1～2 d時(shí)，纖維素、半纖維素降解率變化不大，但木質(zhì)素降解率增加明顯，說明1～2 d主要是微生物降解木質(zhì)素過程。處理3～5 d，木質(zhì)素降解率變化較小，半纖維素、纖維素含量急劇減少，說明3～5 d主要是微生物降解半纖維素、纖維素過程。

兼性木質(zhì)素降解微生物可同時(shí)降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，木質(zhì)素最先被迅速降解，隨后依次為半纖維素和纖維素，這可能與玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素結(jié)構(gòu)有關(guān)。兼性微生物首先利用外圍木質(zhì)素，隨后利用木質(zhì)素降解暴露出來的半纖維素和纖維素。而半纖維素主要由糖類物質(zhì)組成，屬于易降解物質(zhì)，所以預(yù)處理過程中保持較高的降解率，這與夏禹周等[18]構(gòu)建的復(fù)合菌劑處理效果相似。生物預(yù)處理過程中，除了將一些不利于發(fā)酵的有害物質(zhì)降解外，碳源的減少也會(huì)直接影響到厭氧酸化的產(chǎn)量。因此，在利用兼性木質(zhì)素降解微生物好氧預(yù)處理秸稈等木質(zhì)纖維原料時(shí)應(yīng)合理控制處理時(shí)間，同時(shí)減少纖維素和半纖維素的損失至關(guān)重要。

2.2 好氧生物預(yù)處理過程降解關(guān)鍵酶的活性分析

好氧生物預(yù)處理過程中關(guān)鍵酶酶活的變化情況見圖1。由圖可知，隨著處理時(shí)間的增加，纖維素酶酶活呈上升趨勢(shì)，預(yù)處理4 d時(shí)達(dá)到最高為0.025 7 U/mg。木聚糖酶酶活隨處理時(shí)間的增加呈先下降后上升趨勢(shì)，第2天略有下降，從第3天開始迅速上升，第5天增加到0.879 U/mg。木質(zhì)素酶包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶。由圖可知，漆酶和錳過氧化物酶的酶活趨勢(shì)前4天基本一致，第5天錳過氧化物酶酶活變化不大，漆酶酶活開始增加。木質(zhì)素過氧化物酶酶活前2天變化不大，2 d后呈下降趨勢(shì)，在第2天達(dá)到最大值，第3天開始下降，由第2天的0.048 3 U/mg下降到第5天的0.012 6 U/mg。玉米秸稈中纖維素降解率逐漸增加與纖維素酶酶活有關(guān)，隨著纖維素酶的增加纖維素降解速率逐漸增加，第2天開始纖維素酶酶活呈逐漸上升趨勢(shì)，第4天達(dá)到最高值，之后略有下降纖維素降解速率增加。木聚糖酶酶活趨勢(shì)與半纖維素降解趨勢(shì)基本一致，木聚糖酶酶活隨好氧生物處理時(shí)間逐漸增加，半纖維素降解率逐漸增加。處理2 d后木質(zhì)素過氧化物酶酶活隨時(shí)間增加而降低，導(dǎo)致木質(zhì)素在處理前2天迅速降解，第2天后降解相對(duì)緩慢。而漆酶酶活在第5天有所增加，這會(huì)增加木質(zhì)素的降解。

圖1 好氧生物預(yù)處理玉米秸稈過程中的產(chǎn)酶情況Fig.1 Enzyme production during aerobic biological pretreatment of corn straw

2.3 好氧生物預(yù)處理過程微生物群落結(jié)構(gòu)變化分析

在秸稈類木質(zhì)纖維原料好氧生物處理過程中，主要的木質(zhì)纖維素降解微生物群落包括細(xì)菌中的放線菌門和厚壁菌門，真菌中的子囊菌門和半知菌門。這些微生物群落通過產(chǎn)生大量的胞外纖維素酶對(duì)纖維素進(jìn)行利用，這些纖維素酶通常在纖維素水解中展示強(qiáng)大的協(xié)同作用能力。

本研究分析了玉米秸稈好氧生物預(yù)處理過程中的微生物群落變化情況，結(jié)果見圖2。

a.細(xì)菌門水平phylum level of bacteria； b.真菌門水平phylum level of fungi； c.細(xì)菌屬水平genus level of bacteria；d.真菌屬水平genus level of fungi圖2 微生物門、屬水平相對(duì)豐度Fig.2 Species richness at the level of phylum and genera

由圖2(a)可知，在玉米秸稈好氧預(yù)處理過程的細(xì)菌群落中，變形菌門、厚壁菌門和放線菌門都是主導(dǎo)菌門。前2天中變形菌門是處理過程中最占數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)的菌門，比例分別為44.72%和58.74%。變形菌門和放線菌門在1～4天比例最高，第4天的比例分別為31.02%和50.41%。厚壁菌門在處理過程中的比例逐漸增加，并在第5天成為主導(dǎo)菌門，其比例為84.72%。放線菌門前3天的比例較為穩(wěn)定，在25%～30%左右，第4天上升到50.41%，第5天突然下降到8.71%。這可能與厚壁菌門的增加有關(guān)。而擬桿菌門在處理過程中比例逐漸減少，由第1天的18.74%減少到第5天的1.60%。這與文獻(xiàn)報(bào)道的木質(zhì)纖維素堆肥的研究一致，在玉米秸稈堆肥研究中，放線菌門和厚壁菌門一直被認(rèn)為是堆肥中的主導(dǎo)木質(zhì)纖維素降解菌[19-20]。在細(xì)菌屬層面上看，如圖2(c)所示，得到的結(jié)果與門層面基本一致。好氧生物處理5天后，群落數(shù)量以芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)屬，比例為83.88%，其主要胞外酶為木聚糖酶，以分解半纖維素為主。

由圖2(b)可知，在玉米秸稈好氧生物預(yù)處理過程的真菌群落中，主要為擔(dān)子菌門和子囊菌門。在之前的研究中子囊菌門是木質(zhì)纖維素堆肥真菌群落的主導(dǎo)菌門[21]。在好氧生物處理5 d子囊菌門的比例為99.72%。在屬層面，曲霉屬、未分類的角擔(dān)菌和毛殼菌屬相對(duì)豐度較高(圖2(d))。

微生物群落中芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢屬(Cladosporium)、毛殼屬(Chaetomium)、Glutamicibacter屬都具有纖維素水解酶酶類或木質(zhì)纖維素降解能力，在好氧生物處理過程中對(duì)木質(zhì)纖維素降解起主要作用。

2.4 好氧生物預(yù)處理對(duì)玉米秸稈表觀結(jié)構(gòu)的影響

好氧生物預(yù)處理對(duì)玉米秸稈表觀結(jié)構(gòu)的影響見圖3。由圖可知，玉米秸稈經(jīng)過好氧生物預(yù)處理后，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)會(huì)被降解，導(dǎo)致秸稈表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[22]。這些微生物可以分泌各種酶來降解多糖、蛋白質(zhì)、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。放線菌和真菌的菌絲體可以穿透致密的木質(zhì)纖維素的表面，深入內(nèi)部，降解秸稈，同時(shí)對(duì)其結(jié)構(gòu)造成破壞[12]。

a.未處理組untreated； 好氧預(yù)處理aerobic pretreatment：b.1 d，c.2 d，d.3 d，e.4 d，f.5 d圖3 不同預(yù)處理時(shí)間下的玉米秸稈表面結(jié)構(gòu)(×1 000)Fig.3 Corn straw surface structure under different pretreatment times

由圖3(a)可知，未處理的玉米秸稈表面光滑、堅(jiān)硬，這種緊密的光滑表面以及木質(zhì)纖維素獨(dú)特的三維連接方式會(huì)使厭氧發(fā)酵能力大大降低。好氧生物預(yù)處理破壞了玉米秸稈的致密結(jié)構(gòu)，使其出現(xiàn)許多孔洞、裂縫及褶皺。好氧生物預(yù)處理1天的玉米秸稈(圖3(b))表面變得粗糙，并出現(xiàn)一些褶皺，有分層的趨勢(shì)。預(yù)處理2天后(圖3(c))，表面開始出現(xiàn)許多深淺不一的孔洞。預(yù)處理3天(圖3(d))的孔洞數(shù)量明顯增加，出現(xiàn)分層并伴有不同程度的開裂。預(yù)處理4天后，孔洞變得密集，結(jié)構(gòu)明顯遭到破壞。預(yù)處理5天后(圖3(f))，結(jié)構(gòu)遭到完全破壞。該研究結(jié)果與Shah等[23]的結(jié)果一致。隨著預(yù)處理時(shí)間的增加，秸稈晶形結(jié)構(gòu)的破壞程度越來越大，對(duì)木質(zhì)纖維素成分進(jìn)行了有效的降解，溶出了更多的纖維素和半纖維素，增加了生物的可及性。

2.5 好氧生物預(yù)處理對(duì)玉米秸稈主要組成物質(zhì)的影響

好氧生物預(yù)處理中玉米秸稈結(jié)晶度的XRD圖譜見圖4(b)。有研究[26]表明晶態(tài)纖維素比無定形纖維素更難被纖維素酶分解，因此秸稈的生物降解量和結(jié)晶纖維素含量關(guān)系呈反比。不同好氧生物預(yù)處理時(shí)間的秸稈XRD曲線與未處理秸稈的基本一致，分別在22°左右出現(xiàn)一個(gè)主要峰，這是002晶面衍射強(qiáng)度峰[27]。在16°和38°出現(xiàn)次要峰，這是無定形區(qū)域的衍射強(qiáng)度峰和背景鋁板的衍射強(qiáng)度峰。

圖4 好氧生物預(yù)處理玉米秸稈的FT-IR(a)和XRD(b)圖Fig.4 FT-IR spectra(a) and XRD pattern(b) of aerobic biological pretreatment of corn straw

由圖4(b)可見，經(jīng)好氧生物預(yù)處理后，玉米秸稈仍保持著結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)共存的狀態(tài)，表明纖維素晶體結(jié)構(gòu)未發(fā)生較大變化。計(jì)算秸稈結(jié)晶度得到未處理秸稈和好氧生物處理1～5 d的玉米秸稈結(jié)晶度分別為0.436 4、 0.401 3、 0.396 6、 0.346 8、 0.366 5、 0.377 5，由數(shù)據(jù)可知好氧生物預(yù)處理后秸稈結(jié)晶度均有所下降，可能是纖維素結(jié)晶區(qū)域被降解，隨著預(yù)處理時(shí)間的增加，結(jié)晶度變化呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樵诤醚跎镱A(yù)處理初期部分晶型纖維素被破壞，隨著半纖維素降解速度的增加，使得半纖維素所屬的無定形區(qū)物質(zhì)降解速率大于結(jié)晶區(qū)物質(zhì)，結(jié)晶度呈現(xiàn)先下降后升高趨勢(shì)，與Baramee等[28]得到的結(jié)論一致。

2.6 好氧生物預(yù)處理對(duì)玉米秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

厭氧發(fā)酵液中的COD濃度和揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)濃度是表征厭氧酸化程度的重要指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，水解酸化是秸稈厭氧發(fā)酵的關(guān)鍵限速步驟，水解酸化階段VFAs產(chǎn)量與厭氧發(fā)酵期間的甲烷產(chǎn)量呈正相關(guān)[29]，因此水解酸化水平的提高可提高系統(tǒng)的產(chǎn)氣性能。厭氧發(fā)酵過程中乙醇和VFAs產(chǎn)量變化見圖5。由圖可知，隨著厭氧酸化時(shí)間的增加，各試驗(yàn)組單位酸化產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)。好氧生物預(yù)處理1 d的玉米秸稈在厭氧發(fā)酵1 d時(shí)乙醇和VFAs產(chǎn)量為85.9 mg/g，厭氧發(fā)酵11 d后達(dá)到最大值222.6 mg/g。好氧生物預(yù)處理2 d的玉米秸稈在厭氧發(fā)酵1d時(shí)乙醇和VFAs產(chǎn)量為60.3 mg/g，厭氧發(fā)酵11 d后達(dá)到最大值249.3 mg/g。好氧生物預(yù)處理1～2 d的玉米秸稈在厭氧發(fā)酵11 d后乙醇和VFAs產(chǎn)量略有下降并趨于平緩。好氧生物預(yù)處理3～4 d的玉米秸稈乙醇和VFAs產(chǎn)量趨勢(shì)相差不大，兩者交替上升，在厭氧發(fā)酵15 d分別達(dá)到最大值183.7和179 mg/g。好氧生物預(yù)處理5 d的玉米秸稈乙醇和VFAs產(chǎn)量隨厭氧發(fā)酵時(shí)間增加逐漸上升，厭氧發(fā)酵11 d后趨勢(shì)逐漸減緩，慢慢穩(wěn)定在138 mg/g左右。未處理的玉米秸稈在厭氧發(fā)酵3 d時(shí)乙醇和VFAs產(chǎn)量有過一次小峰值，之后存在1天的停滯，在厭氧發(fā)酵13 d達(dá)到峰值169.9 mg/g，主要原因是前3天的厭氧發(fā)酵過程中，秸稈表面容易利用的有機(jī)物以及破碎游離在外部的纖維素、半纖維素被水解完之后，面對(duì)秸稈復(fù)雜的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，厭氧微生物需要對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行水解，打破木質(zhì)纖維素降解屏障，以便釋放更多的纖維素和半纖維素用于水解酸化。

圖5 秸稈厭氧酸化過程中乙醇和揮發(fā)酸(VFAs)總產(chǎn)量變化Fig.5 Change in ethanol and volatile fatty acids products during anaerobic acidification of straw圖6 秸稈厭氧酸化過程中乙醇和VFAs質(zhì)量濃度的變化Fig.6 Changes in the content of ethanol and VFAs products during anaerobic acidification of straw

在發(fā)酵液中檢出的VFAs主要有乙酸、丙酸、丁酸及少量的戊酸。圖6為好氧預(yù)處理2 d后玉米秸稈發(fā)酵液中乙醇和VFAs質(zhì)量濃度變化，其中乙酸質(zhì)量濃度最高，乙酸和丁酸約占總VFAs的88.7%～90%，為水解酸化的主要產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)中得到好氧生物預(yù)處理2 d的玉米秸稈乙酸質(zhì)量濃度最高，在厭氧發(fā)酵11 d時(shí)達(dá)到峰值3 241.25 mg/L，比未處理組(2 933.10 mg/L)提高10.5%。由于3個(gè)以上碳的VFAs容易被生物降解形成乙酸，因此積累的丙酸和戊酸并不多，而且乙酸和丁酸更容易被產(chǎn)甲烷菌利用，對(duì)厭氧酸化進(jìn)程影響不大[30]。

上述研究發(fā)現(xiàn)，好氧生物預(yù)處理1～2 d的秸稈厭氧酸化效果顯著增強(qiáng)，在厭氧發(fā)酵11 d達(dá)到峰值，相較于未處理的秸稈，乙醇和VFAs產(chǎn)量分別增加31.02%和46.73%。這表明：在厭氧微生物的水解作用下，纖維素和半纖維素等組分在前期被水解為可溶性小分子物質(zhì)，并在酸化菌群的作用下這些可溶性小分子物質(zhì)被轉(zhuǎn)化為乙醇和揮發(fā)性脂肪酸。而之前研究發(fā)現(xiàn)，好氧生物預(yù)處理1～2 d的玉米秸稈中纖維素和半纖維素含量上升，木質(zhì)素含量下降，這意味著更多的纖維素和半纖維素在厭氧發(fā)酵階段溶出，為厭氧酸化提供更多的原料。然而單純木質(zhì)素的降解也不會(huì)大幅度提高水解酸化效率。好氧生物預(yù)處理3～4 d的秸稈乙醇和VFAs產(chǎn)量相較于未處理組略有上升，但增加不明顯。在好氧生物預(yù)處理過程中，隨著微生物的繁殖和纖維素、半纖維素降解酶酶活的提高，玉米秸稈中纖維素、半纖維素和其他成分在預(yù)處理過程中被降解，從而減少了水解酸化過程中的可利用成分[31]。而好氧生物預(yù)處理5 d的秸稈，其乙醇和VFAs產(chǎn)量比未處理組低18.66%，這可能是由于過長(zhǎng)的好氧生物預(yù)處理時(shí)間使水解階段釋放的纖維素和半纖維素等組分被大量消耗，使得后續(xù)厭氧酸化VFAs產(chǎn)量大大降低。當(dāng)采用兼性木質(zhì)素降解微生物預(yù)處理秸稈用于資源化目的的秸稈厭氧發(fā)酵時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制好氧生物處理時(shí)間。

3 結(jié) 論

3.1對(duì)復(fù)合菌劑好氧生物預(yù)處理玉米秸稈進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：隨著好氧生物預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，秸稈降解率逐漸增加，纖維素結(jié)晶度均低于未處理，玉米秸稈經(jīng)好氧預(yù)處理2 d，三大組分木質(zhì)素，半纖維素和纖維素分別降解了1.56%、 5.0%和10.44%，好氧預(yù)處理5 d三大組分降解率由大到小排列為半纖維素>木質(zhì)素>纖維素。

3.2隨著好氧生物預(yù)處理時(shí)間的增加，纖維素、半纖維素降解相關(guān)酶酶活總體呈上升趨勢(shì)，好氧預(yù)處理第5天木聚糖酶達(dá)0.879 U/mg。木質(zhì)素的降解酶主要為木質(zhì)素過氧化物酶，酶活隨好氧生物預(yù)處理時(shí)間增加逐漸降低。微生物菌落分析表明：玉米秸稈好氧預(yù)處理過程中，放線菌、芽孢桿菌和曲霉菌為優(yōu)勢(shì)種群。

3.3好氧生物預(yù)處理能有效提高玉米秸稈水解酸化效果，好氧生物預(yù)處理2 d后的玉米秸稈能產(chǎn)生最大的揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量，主要發(fā)酵類型為混合型發(fā)酵，在厭氧發(fā)酵11 d時(shí)，乙醇和揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量為249.3 mg /g，較未處理組增加46.73%。