基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的多西他賽治療絨毛膜癌的作用機制研究

金雪寧, 林 飛, 馮心怡, 李 岑, 崔樹娜

(1. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚州, 225000; 2. 揚州大學(xué)附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 江蘇 揚州, 225009)

絨毛膜癌(CC)簡稱絨癌，屬于高度惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤，有50%的妊娠CC發(fā)生在葡萄胎之后，其余的發(fā)生在自然流產(chǎn)和人工流產(chǎn)、正常足月妊娠或早產(chǎn)以及異位妊娠之后[1-2]。目前常用的化療藥物有甲氨蝶呤、環(huán)磷酞胺等，但這些化療藥物毒副作用大。多西他賽與紫杉醇都屬于紫杉醇類藥物，但多西他賽抗腫瘤活性更高，抗癌譜更廣，其機制是加強微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，導(dǎo)致形成穩(wěn)定的非功能性微管束，因而破壞腫瘤細胞的有絲分裂[3], 在臨床中被廣泛應(yīng)用于治療難治性卵巢癌等[4-7]。作者的前期體外實驗[8]證實多西他賽能抑制CC細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡并明顯抑制其侵襲能力。研究[9]報道多西他賽能降低對常規(guī)化療藥物不敏感的CC患者血清人絨毛膜促性腺激素(HCG)水平，但多西他賽治療CC的作用機制還缺乏深入研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)和計算機信息學(xué)等多門學(xué)科，建立“藥物-成分-基因-靶點-通路-疾病”的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，探索天然藥物與復(fù)雜疾病的相互關(guān)系[10-11]。本研究基于前期實驗研究和臨床文獻結(jié)果，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段探索多西他賽治療CC的潛在作用機制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 多西他賽、CC的靶點收集

在Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中分別以“Docetaxol” “choriocarcinoma”為關(guān)鍵詞檢索靶點，并將其導(dǎo)入Excel表格中進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，進行統(tǒng)計分析。

1.2 關(guān)鍵靶點篩選

將多西他賽所對應(yīng)的靶點基因和CC相關(guān)的靶點基因進行映射，獲得兩者的共同基因，即多西他賽治療CC的作用靶點。

1.3 蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的基因輸入String 11.0數(shù)據(jù)庫，將蛋白種類設(shè)置為人類(homo sapiens), “minimum required interaction score”參數(shù)設(shè)置為“highest confidence(0.900)”, 其余參數(shù)保持初始默認設(shè)置，導(dǎo)出PPI數(shù)據(jù)文件，建立蛋白與蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，對結(jié)果進行可視化。

1.4 Hub基因篩選

通過Cytoscape軟件的Cytohubba插件中的MCC算法，計算并篩選排名前10位的多西他賽治療CC的Hub基因。

1.5 基因本體論(GO)富集和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集

將共同基因輸入DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(http://david.ncifcrf.gov/)進行GO富集分析和KEGG通路分析，研究多西他賽治療CC的關(guān)鍵靶點的生物功能以及參與的信號通路，以P<0.05和錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05作為篩選條件，篩選具有顯著差異的生物過程和靶點通路。

2 結(jié) 果

2.1 靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在Genecards數(shù)據(jù)庫分別以“Docetaxol”和“choriocarcinoma”為關(guān)鍵詞檢索靶點，分別獲得953和1 137個靶點，將1 137個疾病靶點與953個藥物靶點輸入Venny2.1 軟件繪制韋恩圖，篩選出294個共同靶點，見圖1。將共同靶點在String 11.0 平臺分析的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型。以Combined_score>0.9為篩選條件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，其中節(jié)點為靶點蛋白，邊為各蛋白間互作關(guān)系，節(jié)點連接邊數(shù)越多代表其在網(wǎng)絡(luò)中作用越重要，見圖2。通過Cytoscape 軟件插件Cytohubba計算排名前10位的Hub基因，其中TP53、AKT1、CASP8、STAT3等是多西他賽治療CC的關(guān)鍵基因。見圖3。

圖1 藥物和疾病靶點韋恩圖

圖2 交集靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

圖3 通過MCC算法計算排名前10位的多西他賽治療CC的hub基因

2.2 GO功能和KEGG富集分析

將294個預(yù)測靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中進行GO富集分析和KEGG通路分析。GO富集分析中，參與的生物過程有409個，主要包括調(diào)控細胞增殖(細胞增殖調(diào)節(jié))、細胞凋亡(細胞凋亡負調(diào)控、細胞死亡的調(diào)控、程序性細胞死亡的調(diào)控)、信號傳導(dǎo)(信號傳導(dǎo)的正調(diào)控)、調(diào)節(jié)分子代謝(大分子代謝及合成過程的正調(diào)控、有機物質(zhì)的反應(yīng)等)。KEGG通路富集分析確定了28條相關(guān)信號通路，主要涉及癌癥通路、細胞凋亡通路、Focal Adhesion通路和p53、ErbB、MAPK等信號通路。見圖4、圖5。

圖4 多西他賽潛在靶點的富集分析(生物過程)

原點由小到大代表分值逐漸升高,靶點富集數(shù)目多,通路顯著性逐漸增強; 顏色由藍變紅代表P值逐漸減小。圖5 多西他賽潛在靶點的KEGG通路注釋圖

3 討 論

CC屬于惡性滋養(yǎng)細胞癌，是由滋養(yǎng)層滋養(yǎng)細胞增殖引起的惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致這種轉(zhuǎn)化的分子機制尚未確定。CC可繼發(fā)于葡萄胎妊娠，也可繼發(fā)于非葡萄胎妊娠，病情發(fā)展迅速，病死率高，主要通過血行播散，轉(zhuǎn)移早且易擴散，肺是CC最易轉(zhuǎn)移的部位，其次為陰道、盆腔等，轉(zhuǎn)移部位皆有局部出血灶[1, 12]。

多西他賽也稱多西紫杉醇，是紫杉醇類化學(xué)藥物的衍生物，臨床應(yīng)用廣泛，常被用于治療難治性卵巢癌等，但其應(yīng)用于CC方面的研究較少[4-6]。作者前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，多西他賽可以抑制CC細胞增殖的能力，并能誘導(dǎo)CC細胞凋亡，其作用濃度與時間呈正相關(guān)，并能明顯抑制CC細胞體外侵襲的能力[8]。對高度化療耐藥的CC細胞，每周使用單劑多西他賽可快速降低HCG水平(超過95%), 且對人體毒性最小，但其作用機制有待進一步深入研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多西他賽可靶向P53、AKT1、STAT3、VEGFA等294個基因，參與細胞凋亡與增殖的調(diào)控、分子合成與代謝的調(diào)控等主要生物過程。抑癌基因TP53編碼p53腫瘤蛋白，其能調(diào)節(jié)細胞周期和避免細胞癌變發(fā)生。任何導(dǎo)致TP53失活的突變都會引起其抑癌功能的喪失而導(dǎo)致癌癥發(fā)生[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)女性TP53突變攜帶者罹患CC的風(fēng)險更高，且易產(chǎn)生化療耐藥，因此靶向調(diào)控p53對于多西他賽治療CC具有重要的臨床價值。蛋白激酶B1(AKT1)是AKT的一個亞型，是生存信號通路PI3K/AKT的關(guān)鍵分子，與腫瘤細胞的生長、增殖、促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移以及促進血管形成密切相關(guān)。研究[15]發(fā)現(xiàn)，在CC細胞系中，逆轉(zhuǎn)AKT1表達可能通過抑制PI3K/AKT信號通路及靶向負調(diào)控VEGFA表達，最終抑制CC細胞增殖、遷移和侵襲。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是一類具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能的蛋白質(zhì)家族，激活后與DNA分子結(jié)合發(fā)揮作用[16]。多項研究[17-18]證實STAT3是參與惡性細胞轉(zhuǎn)化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì), IL-6/STAT3通路與CC細胞增殖密切相關(guān)，阻斷 STAT3信號通路能夠抑制CC細胞的增殖，并誘導(dǎo)CC細胞凋亡。

研究[19-20]表明, p53信號通路與腫瘤發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，其可以激活多條信號通路，阻礙細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡，促進細胞衰老以及DNA修復(fù)過程，最終抑制腫瘤生長。研究[21]發(fā)現(xiàn)p53和p21CIP1是p53信號通路中重要的靶基因，在CC JEG-3細胞中，細胞周期蛋白依懶性激酶抑制劑p21CIPI表達被激活后，使G2細胞周期蛋白依賴性激酶CDK1表達顯著降低，同時p53絲氨酸磷酸化水平增加, p53信號通路激活后使細胞周期阻滯在G2/M期，進而激活DNA損傷反應(yīng)通路，抑制細胞增殖。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對多西他賽和CC進行靶標(biāo)挖掘和通路分析，得到294個共同靶向基因和CC多條信號通路，包括TP53、AKT1、STAT3、VEGAF等基因以及細胞凋亡通路、p53通路等信號通路，證明了多西他賽可能通過調(diào)節(jié)多個靶基因、調(diào)控蛋白表達和信號傳導(dǎo)通路而發(fā)揮對CC的治療作用，初步揭示了多西他賽治療CC的作用機制，為后續(xù)臨床研究提供了新思路。