基于AMPK信號(hào)通路研究LPS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞脂代謝的調(diào)控機(jī)理

李林，李建嫄，趙梅，唐偉斌

(1. 邢臺(tái)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 邢臺(tái) 054001；2. 河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)人民醫(yī)院病理科，河北 邢臺(tái) 054001)

隨著人們生活水平的提高，乳加工產(chǎn)品越來(lái)越受到人們的重視，奶業(yè)也因此迎來(lái)了發(fā)展的黃金期。但是由于我國(guó)目前缺乏大面積的優(yōu)質(zhì)牧場(chǎng)，因此反芻動(dòng)物在泌乳高峰期間，商家為了滿足其對(duì)高能量的需要通常向日糧中增加精料比例[1-2]。當(dāng)日糧中的精料比例大于60%時(shí)，就稱為高精料飼喂。在高精料日糧中，由于有效纖維含量有限，所以反芻動(dòng)物在咀嚼的時(shí)候唾液分泌量就會(huì)大大減少，導(dǎo)致瘤胃中的胃酸不能及時(shí)被稀釋?zhuān)又呔蠘O易導(dǎo)致瘤胃發(fā)酵異常，因此，高精料飼喂往往會(huì)造成機(jī)體的亞急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis，SARA)[3]。SARA的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致瘤胃中代謝異常產(chǎn)物脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等的大量釋放，嚴(yán)重還會(huì)導(dǎo)致乳腺炎、蹄葉炎甚至死亡等現(xiàn)象發(fā)生[4-6]。

反芻動(dòng)物乳腺感染外源或內(nèi)源性的LPS，通常是由于環(huán)境或飲食所造成的，LPS的產(chǎn)生可以觸發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[7-9]。Chang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，高精料誘導(dǎo)的奶牛機(jī)體出現(xiàn)的SARA癥狀及血液LPS升高，會(huì)造成乳腺脂肪酸合成受阻，而脂肪酸是乳脂的重要組成部分。腺苷酸活化激酶(AMPK)作為一個(gè)“傳感器”可“調(diào)節(jié)”細(xì)胞中的能量。AMPK信號(hào)通路在脂質(zhì)代謝中起著重要作用，激活A(yù)MPK可以抑制脂質(zhì)合成。

目前，該方面的研究多集中在奶牛的體內(nèi)試驗(yàn)，而在體外的乳腺細(xì)胞及具體機(jī)理方面的研究相對(duì)較少。因此，本試驗(yàn)利用奶牛乳腺上皮細(xì)胞作為模型，通過(guò)向細(xì)胞中添加不同濃度的LPS，觀察細(xì)胞的存活力、炎癥因子及探討調(diào)控乳脂合成的具體信號(hào)機(jī)制，旨在為養(yǎng)殖實(shí)踐中奶牛乳腺炎的防治及乳品質(zhì)的提高提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞系

奶牛乳腺上皮細(xì)胞系MAC-T由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張?jiān)词缃淌陴佡?zèng)。

1.2 MAC-T細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代

MAC-T細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，內(nèi)含10%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素/鏈霉素和4.5 g/L葡萄糖，置于含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，每隔2～3 d將細(xì)胞重新傳代1次。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用貼壁細(xì)胞用消化液(含0.25%胰酶、0.02% EDTA)進(jìn)行消化處理，1 500 r/min離心5 min，小心棄掉上清，分別將細(xì)胞接種于6孔板、12孔板以及96孔板中，分別加入新鮮培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 LPS誘導(dǎo)MAC-T細(xì)胞損傷模型的建立

1.3.1 LPS誘導(dǎo)細(xì)胞損傷試驗(yàn)

接種于96孔板內(nèi)的MAC-T細(xì)胞，融合度達(dá)到70%～80%時(shí)棄去培養(yǎng)液。PBS洗滌后，分別加入含有不同濃度LPS的無(wú)血清培養(yǎng)基(LPS濃度分別為0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL、10 000 ng/mL)；在5% CO2恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)中分別培養(yǎng)1、3、6、9、12 h。每組設(shè)置10個(gè)平行孔。

1.3.2 乳腺上皮細(xì)胞MTT試驗(yàn)

當(dāng)各組細(xì)胞按上述處理完成后，96孔板內(nèi)更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液，并在每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液(購(gòu)自上海碧興天生物技術(shù)有限公司)，在5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將上清棄去，每孔分別加入150 μL DMSO溶液，微量振蕩器振蕩，于RT-6000半自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)各孔490 nm處的吸光度值。

1.4 MAC-T細(xì)胞炎癥因子檢測(cè)

將12孔板中的MAC-T細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液。PBS洗滌后，分別加入含有不同濃度的LPS(0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL、10 000 ng/mL)無(wú)血清培養(yǎng)基；在5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)9 h，每組設(shè)置6個(gè)平行孔。收集細(xì)胞用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，4 °C，2 500 r/min離心10 min，取上清。分別檢測(cè)不同組細(xì)胞腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)的含量，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5 MAC-T細(xì)胞甘油三酯(TG)含量檢測(cè)

MAC-T細(xì)胞與不同濃度的LPS孵育，9 h后收集MAC-T細(xì)胞，超聲波處理器進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，4 ℃，2 500 r/min離心10 min，取上清。用甘油三酯檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)測(cè)定甘油三酯含量。

1.6 Western blot分析MAC-T細(xì)胞AMPK通路蛋白

將細(xì)胞用含1% AMPK蛋白酶抑制劑(購(gòu)自上海藍(lán)木化工有限公司)的裂解緩沖液處理5 min。然后將勻漿液以12 000 r/min速度離心，4 ℃條件下離心10 min。用蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)。然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后將一抗AMPK-兔和p-AMPK-兔(購(gòu)自艾博抗上海貿(mào)易有限公司)1∶5 000 稀釋。4 ℃，雜交過(guò)夜，與相應(yīng)的二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(H+L)(購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，共同孵育1 h，用ECL發(fā)光液進(jìn)行Western blot圖像處理。用Image Lab 6.0分析條帶灰度值。

1.7 MAC-T細(xì)胞脂代謝相關(guān)關(guān)鍵酶的表達(dá)

MAC-T細(xì)胞與不同濃度的LPS孵育9 h后收集MAC-T細(xì)胞，將收集的細(xì)胞采用TRIzol法直接提取總RNA，利用BioPhotometer測(cè)定樣品總RNA濃度，分析OD260/OD280值，判斷提取總RNA的純度，OD260/OD280需要在1.8～2.0范圍之內(nèi)。取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，詳細(xì)操作步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

根據(jù)GenBank上牛的乙酰CoA羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(SCD-1)、脂肪酸移位酶(CD36)及β-actin內(nèi)參基因引物，參照GenBank序列，用Primer Premier 5軟件自行設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)完成后交由上海Sangon公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 目的基因及β-Actin引物序列

1.8 AMPK抑制劑對(duì)MAC-T細(xì)胞TG含量的影響

當(dāng)MAC-T細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液。試驗(yàn)分為3組，分別為對(duì)照組、LPS處理組(1 000 ng/mL)、AMPK抑制劑組(10 μmol/L BML-275+1 000 ng/mL LPS)，在5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)9 h后，收集MAC-T細(xì)胞，超聲波處理器進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，4 ℃，2 500 r/min離心10 min，取上清。用甘油三酯檢測(cè)試劑盒測(cè)定甘油三酯含量。

1.9 AMPK抑制劑對(duì)MAC-T細(xì)胞脂代謝相關(guān)關(guān)鍵基因的影響

將上述3組細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)9 h后，收集MAC-T細(xì)胞，將收集的細(xì)胞采用TRIzol法直接提取總RNA，然后通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，詳細(xì)操作步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.10 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，MTT法通過(guò)采用SPSS 19.0(SPSS，USA)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，其他試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用LSD法進(jìn)行多重比較，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞相對(duì)活力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，從6 h開(kāi)始經(jīng)不同濃度的LPS處理后MAC-T細(xì)胞的相對(duì)活力開(kāi)始下降，其中在1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS的處理下細(xì)胞的相對(duì)活力顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；從9 h開(kāi)始，1 000 ng/mL和10 000 ng /mL LPS的處理下，細(xì)胞相對(duì)活力極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(圖1)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，確定LPS誘導(dǎo)MAC-T細(xì)胞炎性損傷最佳刺激時(shí)間為9 h。

與對(duì)照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)圖1 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞相對(duì)活力的影響(n=10)

2.2 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞炎癥因子的影響

如表2所示，用1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，與對(duì)照組相比，MAC-T細(xì)胞中TNF-α和IL-8含量顯著上升(P<0.05)；而用10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)的IL-6含量顯著上升(P<0.05)。

表2 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞炎癥因子指標(biāo)的影響 μg/L

2.3 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞TG的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，用100 ng/mL、1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著下降(P<0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同圖2 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞TG含量的影響

2.4 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞AMPK信號(hào)通路的影響

檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的AMPK蛋白水平，結(jié)果如圖3所示。用1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，細(xì)胞內(nèi)P-AMPK水平與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)。

圖3 P-AMPK蛋白含量的檢測(cè)

2.5 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞脂代謝相關(guān)酶mRNA表達(dá)的影響

通過(guò)對(duì)MAC-T細(xì)胞脂肪酸激活、轉(zhuǎn)運(yùn)、合成關(guān)鍵酶mRNA水平的檢測(cè)。結(jié)果由圖4所示，與對(duì)照組相比，用100 ng/mL、1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，與ACC、SCD-1的相關(guān)基因顯著降低(P<0.05)；在1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，F(xiàn)AS基因也顯著降低(P<0.05)。提示：LPS會(huì)影響MAC-T細(xì)胞脂肪酸的從頭合成及TG含量，進(jìn)而影響乳脂的生成。

A. ACC；B. SCD-1；C. FAS；D. CD36圖4 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因的影響

2.6 AMPK抑制劑對(duì)MAC-T細(xì)胞TG含量的影響

向細(xì)胞中添加AMPK抑制劑BML-275后，各組MAC-T細(xì)胞TG含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。LPS處理組中TG含量顯著下降(P<0.05)，而AMPK抑制劑組中TG含量與LPS處理組有上升的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。

圖5 AMPK抑制劑對(duì)MAC-T細(xì)胞TG含量的影響

2.7 AMPK抑制劑對(duì)MAC-T細(xì)胞脂代謝相關(guān)酶mRNA表達(dá)的影響

向MAC-T細(xì)胞添加AMPK抑制劑BML-275后，MAC-T細(xì)胞脂代謝的相關(guān)酶mRNA表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。用1 000 ng/mL LPS刺激9 h后，與對(duì)照組相比，ACC(圖6A)、FAS(圖6B)、SCD-1(圖6C)的相關(guān)基因顯著降低(P<0.05)；而向細(xì)胞中加入BML-275后，與LPS處理組相比，上述基因顯著上升(P<0.05)。經(jīng)過(guò)LPS處理后CD36基因表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，圖6D。

A. ACC; B. FAS; C. SCD-1; D. CD36圖6 AMPK抑制劑對(duì)MAC-T細(xì)胞脂代謝的影響

3 討論

3.1 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞活性及炎癥指標(biāo)的影響

泌乳期的高產(chǎn)奶牛，養(yǎng)殖戶為了彌補(bǔ)其能量不足，往往就會(huì)逐漸增加飼料中的精料比。然而，大量飼喂高精料日糧會(huì)導(dǎo)致瘤胃快速發(fā)酵，瘤胃中的揮發(fā)性脂肪酸和乳酸水平升高就會(huì)導(dǎo)致氫離子增加，從而導(dǎo)致pH值降低。pH值的降低改變了瘤胃微生物群，殺死了革蘭陰性菌，導(dǎo)致大量LPS從死亡細(xì)胞表面釋放出來(lái)進(jìn)入血液[12-13]。

LPS經(jīng)過(guò)血液的體循環(huán)后引發(fā)機(jī)體的炎癥，同時(shí)也會(huì)進(jìn)入乳腺引發(fā)泌乳功能出現(xiàn)障礙。Guo等[14]通過(guò)高精料飼喂泌乳期奶牛1個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)瘤胃及血液中LPS含量顯著升高，并且造成了機(jī)體的SARA。Chang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高精料飼喂不僅導(dǎo)致了奶牛機(jī)體的SARA，同時(shí)瘤胃所產(chǎn)生的大量LPS進(jìn)入血液后通過(guò)乳動(dòng)脈流入乳腺，造成了奶牛的乳腺炎、影響了乳蛋白的合成。Memon等[16]研究發(fā)現(xiàn)，精粗比為6∶4的日糧會(huì)造成奶牛機(jī)體SARA的產(chǎn)生，并且在乳腺組織中會(huì)激活與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)證明，高精料飼喂泌乳奶牛，會(huì)通過(guò)NF-κB信號(hào)通路激活核苷酸結(jié)合寡聚體結(jié)構(gòu)域蛋白1進(jìn)而引發(fā)乳腺的炎癥反應(yīng)，使乳腺中炎癥因子上升[17]。白介素和腫瘤壞死因子是參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、造血和炎癥反應(yīng)的典型的多功能細(xì)胞因子，它們的功能廣泛重疊，但各有其獨(dú)特的特性。其中，IL‐6具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的功能[18]；TNF-α是細(xì)胞凋亡、炎癥和免疫的主要中介因子，它與疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括敗血癥、糖尿病、癌癥[19-20]。本試驗(yàn)通過(guò)體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的LPS分別刺激MAC-T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，1 000 ng /mL LPS和10 000 ng/mL LPS的處理下細(xì)胞相對(duì)存活率從6 h開(kāi)始顯著下降，在9 h和12 h的時(shí)候下降極顯著。提示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和LPS濃度的升高，會(huì)造成MAC-T細(xì)胞存活率下降。進(jìn)一步檢測(cè)與細(xì)胞氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T細(xì)胞中IL-8和TNF-α含量顯著上升；而用10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，細(xì)胞內(nèi)的IL-6含量顯著上升。提示，LPS不僅造成了細(xì)胞的炎癥狀態(tài)，同時(shí)也使更多的細(xì)胞發(fā)生了非正常凋亡。

3.2 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞脂合成代謝及相關(guān)通路的影響

乳脂肪主要是由TG(含量為97%)、膽固醇等營(yíng)養(yǎng)成分組成[11]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乳腺處于炎癥狀態(tài)時(shí)，用于合成乳脂肪的前體物就會(huì)減少，進(jìn)而導(dǎo)致乳中乳脂肪含量降低[21]。TG中的脂肪酸組成與飼糧中脂肪酸、飼糧碳水化合物/脂質(zhì)比和種屬都有關(guān)。乳中的TG通常有3種來(lái)源:乳腺?gòu)念^合成、膳食脂類(lèi)和內(nèi)源性脂肪儲(chǔ)存(脂肪或肝脂類(lèi))。在反芻動(dòng)物中，乳腺乳脂肪的從頭合成途徑對(duì)TG合成具有重要作用，乳腺的從頭合成途徑是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程。該過(guò)程需要一系列相關(guān)酶類(lèi)的調(diào)節(jié)。其中ACC在大多數(shù)生物體內(nèi)的脂肪酸代謝中起著關(guān)鍵的作用，它通過(guò)生物素羧化酶和羧基轉(zhuǎn)移酶兩種催化活性，催化乙酰輔酶A的羧化生成丙二酰單酰輔酶A[22-24]。SCD是調(diào)節(jié)飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的主要酶，也是調(diào)節(jié)肥胖基因代謝途徑的主要成分[25]。研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物在泌乳期間，乳腺上皮細(xì)胞中與脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，ACC等都會(huì)顯著上調(diào)[26]。AMPK是真核生物細(xì)胞和機(jī)體代謝的中樞調(diào)節(jié)因子之一，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生減少時(shí)，AMPK就會(huì)被激活。AMPK在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和機(jī)體代謝方面起著關(guān)鍵作用[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，AMPK的磷酸化會(huì)增加組織中葡萄糖攝取、脂肪酸氧化。本試驗(yàn)中，用100 ng/mL、1 000 ng/mL和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T細(xì)胞中脂肪總含量及TG含量顯著下降。進(jìn)一步通過(guò)分析與脂代謝相關(guān)的關(guān)鍵通路蛋白及關(guān)鍵酶，發(fā)現(xiàn)1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T細(xì)胞中P-AMPK蛋白表達(dá)量顯著上升；100 ng/mL、1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激9 h后，MAC-T細(xì)胞中ACC、SCD-1含量顯著下降，并且1 000 ng/mL 和10 000 ng/mL LPS刺激后，其FAS含量也出現(xiàn)顯著下調(diào)。此外，通過(guò)向細(xì)胞中添加AMPK抑制劑(BML-275)，發(fā)現(xiàn)LPS組TG含量與對(duì)照組相比顯著下降，而AMPK抑制劑組TG含量有上升趨勢(shì)，但差異不顯著。通過(guò)對(duì)與脂代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，ACC、FAS、SCD-1的相關(guān)基因顯著降低；而向細(xì)胞中加入BML-275后，AMPK抑制劑組與LPS處理組相比，ACC、FAS、SCD-1相關(guān)基因顯著上升。提示：LPS造成了MAC-T細(xì)胞TG含量的下降，并且影響了脂代謝合成途徑，導(dǎo)致TG含量下降，影響了乳脂肪的合成。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)向MAC-T細(xì)胞中添加LPS，不僅造成了細(xì)胞的活性下降，還導(dǎo)致了細(xì)胞炎癥；LPS通過(guò)AMPK信號(hào)通路造成了MAC-T細(xì)胞脂合成代謝關(guān)鍵基因活性下降，TG的合成能力下降。分析其原因，可能是由于在炎癥狀態(tài)下，MAC-T細(xì)胞首先將胞內(nèi)物質(zhì)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后用于抵抗細(xì)胞的應(yīng)激狀態(tài)，而消耗了大量的乳脂前體物用于機(jī)體供能，進(jìn)而通過(guò)AMPK信號(hào)通路影響乳脂合成。