殘留恩諾沙星對(duì)雞糞厭氧消化特性影響研究

＊王涵 于佳瀅 劉晨熙 鄭凱兮 宋佳楠 馮磊*

（1.沈陽(yáng)航空航天 大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院 遼寧 110136 2.沈陽(yáng)航空航天大學(xué) 民用航空學(xué)院 遼寧 110136）

引言

中國(guó)是全球農(nóng)業(yè)大國(guó)之一，農(nóng)業(yè)廢棄物更是廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。近年來(lái)農(nóng)業(yè)廢棄物的年產(chǎn)量成指數(shù)型增長(zhǎng)，每年秸稈的產(chǎn)量高達(dá)3億噸，而雞糞的產(chǎn)值更是高達(dá)4億噸，這些廢棄物的產(chǎn)量是工業(yè)固體廢物的1.29倍。如果這些廢棄物沒(méi)有被有效處理將會(huì)導(dǎo)致病原體釋放、污染大氣、土壤污染、溫室氣體排放等環(huán)境問(wèn)題，面對(duì)大量的農(nóng)業(yè)廢棄物，存儲(chǔ)后集中利用、堆肥處理和厭氧消化處理這三種方式被廣泛使用[1-2]。厭氧消化是一種成熟的技術(shù)，是利用沼氣厭氧發(fā)酵處理畜禽糞便最常用的技術(shù)。如果活性抗生素的濃度超過(guò)臨界水平，厭氧消化過(guò)程及其在糞便處理和沼氣生產(chǎn)中的應(yīng)用可能會(huì)因?yàn)楫a(chǎn)甲烷聯(lián)合體的抑制而受到抑制。因此，應(yīng)該清楚地了解抗生素對(duì)厭氧消化工藝性能的影響，目前全球不僅面臨著大量糞污合理處置問(wèn)題，還要兼顧抗生素誘導(dǎo)的抗生素抗性基因進(jìn)入食物鏈的生態(tài)安全問(wèn)題，它是一種將廢棄物轉(zhuǎn)化為沼氣和可利用資源的處理方案。

在中國(guó)，東北地區(qū)的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地最為集中，抗生素是抑制或殺死其他微生物的代謝產(chǎn)物，獸用抗生素作為防治畜禽疾病的藥物尤為重要。獸用抗生素可以作為畜牧業(yè)的添加劑飼料，動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)最常用的抗生素是四環(huán)素（45.2%），四環(huán)素是一種廣譜抗菌劑，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌均有抗菌活性，因此被廣泛用作人和動(dòng)物感染的治療劑。四環(huán)素也用于亞治療，用于預(yù)防和促進(jìn)生長(zhǎng)。當(dāng)四環(huán)素被細(xì)菌細(xì)胞吸收時(shí)，它通過(guò)阻止氨酰tRNA與核糖體的相互作用來(lái)抑制蛋白質(zhì)的合成。鑒于微生物在厭氧消化中的重要作用，研究在抗生素存在下厭氧微生物群落的特征對(duì)于確定對(duì)甲烷和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）生產(chǎn)的潛在影響至關(guān)重要。各類(lèi)的研究報(bào)告表明，當(dāng)厭氧反應(yīng)器暴露在抗生素中時(shí)，沼氣量普遍減少，主要是甲烷的減少[3-4]。其中豬糞中四環(huán)素類(lèi)藥物殘留率和殘留水平較高。眾所周知，磺胺類(lèi)化合物是一類(lèi)人工合成的抗生素，在細(xì)菌酶促合成二氫葉酸過(guò)程中可以作為對(duì)氨基苯甲酸的拮抗劑。獸醫(yī)也經(jīng)常使用磺胺類(lèi)化合物作為動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑。而氟喹諾酮類(lèi)fluoroquinolones（FQs）藥物在雞糞中頻繁檢出，其中恩諾沙星殘留濃度高達(dá)15.43mg/kg·TS。Enrofloxacin（ENR）是第一個(gè)動(dòng)物專(zhuān)用的喹諾酮類(lèi)藥物，屬于廣譜抗生素，主要對(duì)革蘭氏陰性菌有殺滅作用，通過(guò)抑制細(xì)菌的DNA螺旋酶活性，干擾DNA復(fù)制，從而阻斷增殖。氟喹諾酮類(lèi)藥物在單胃物種口服后易被吸收，對(duì)于反芻動(dòng)物的吸收效率則較低，較難達(dá)到治療水平。恩諾沙星在成年反芻動(dòng)物中的口服生物利用度只有10%，而在單胃動(dòng)物的口服生物利用度超過(guò)80%，吳等人對(duì)國(guó)內(nèi)采集的畜禽糞便樣品進(jìn)行分析，檢測(cè)到環(huán)丙沙星和恩諾沙星抗生素在豬糞中的含量分別高達(dá)33.98mg/kg和33.26mg/kg，經(jīng)過(guò)厭氧消化處理后抗生素的去除率分別為60.3%～70.4%和48.4%～77.1%[5]，這解釋了喹諾酮類(lèi)藥物頻繁用于治療禽類(lèi)疾病的原因，抗生素作為生物抑菌劑對(duì)厭氧體系微生物的活性會(huì)有所削弱，不同濃度和種類(lèi)的抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的毒性效應(yīng)已有報(bào)道。

中國(guó)每年生產(chǎn)抗生素原料大約21萬(wàn)噸，其中9.7萬(wàn)噸應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中[6]。目前四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)牛糞、豬糞便厭氧消化的影響研究較為廣泛，但缺乏喹諾酮類(lèi)抗生素在對(duì)雞糞厭氧消化糞的影響以及降解規(guī)律的研究?；谝陨峡紤]，根據(jù)中國(guó)東北地區(qū)雞糞中恩諾沙星殘留水平，探究恩諾沙星對(duì)雞糞厭氧消化系統(tǒng)的影響，重點(diǎn)分析微生物群落結(jié)構(gòu)變化，與此同時(shí)，分析了恩諾沙星在雞糞厭氧消化體系中降解特性，為日后的畜禽糞便管理提供數(shù)據(jù)支持。

1.實(shí)驗(yàn)材料與方法

(1)實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用雞糞取自遼寧省北票市某肉雞養(yǎng)殖基地，經(jīng)檢測(cè)雞糞中恩諾沙星濃度低于檢出限，可以確定雞糞未受污染。將雞糞中蛋殼、羽毛、石子等難降解的物質(zhì)剔除，置于4℃下冰箱保存待用；恩諾沙星購(gòu)自上海阿拉丁公司，化學(xué)式為C19H22FN3O3，相對(duì)分子質(zhì)量為359.39，純度≥98%，使用前置于4℃冰箱保存；接種污泥取自沈陽(yáng)市某污水處理廠濃縮池，加入雞糞37℃馴化2周后使用。雞糞與接種污泥特性如表1所示。

表1 雞糞、秸稈和接種物的性質(zhì)

(2)實(shí)驗(yàn)方法

本次實(shí)驗(yàn)以新鮮雞糞與喹諾酮類(lèi)抗生素恩諾沙星為研究對(duì)象，取雞糞120g，接種污泥300ml，設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)M1-M4，其中M1-M4恩諾沙星含量（以雞糞VS計(jì)）分別為0mg·kg-1、10mg·kg-1、20mg·kg-1、40mg·kg-1，將物料添加進(jìn)序批式反應(yīng)器后用去離子水定容至1L進(jìn)行厭氧消化實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)器置于的恒溫水浴鍋中，水浴加熱溫度通過(guò)溫度傳感器顯示并通過(guò)溫控箱進(jìn)行溫度調(diào)控，溫度設(shè)置為37±0.2℃，實(shí)驗(yàn)周期為50天。期間分析研究日產(chǎn)氣量、累計(jì)產(chǎn)氣量、pH、主要酶（纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）的活性等參數(shù)的變化規(guī)律。具體分析檢測(cè)方法如表2所示。

表2 各實(shí)驗(yàn)參數(shù)分析檢測(cè)方法

2.結(jié)果與討論

厭氧消化的效率可以通過(guò)甲烷產(chǎn)量的高低進(jìn)行評(píng)判，其余的工藝參數(shù)均可以用于評(píng)估厭氧消化的穩(wěn)定性[7]。不同含量恩諾沙星與雞糞聯(lián)合厭氧消化累積甲烷產(chǎn)量變化分析如下，M1-M4累積甲烷產(chǎn)量變化趨勢(shì)大致相同，甲烷前期產(chǎn)量不高，均存在較為平緩的趨勢(shì)，隨著反應(yīng)的不斷進(jìn)行，甲烷產(chǎn)量呈現(xiàn)出先增加后趨于穩(wěn)定的發(fā)展趨勢(shì)，從四組實(shí)驗(yàn)的甲烷產(chǎn)氣量對(duì)比可以得出結(jié)論，不同含量恩諾沙星與雞糞聯(lián)合厭氧消化各組實(shí)驗(yàn)甲烷累積產(chǎn)量由大到小順序?yàn)椋篗1＞M2＞M3＞M4，最終甲烷的累積產(chǎn)量（以VS計(jì)）分別為240.56mL·gVS-1、190.49mL·gVS-1、181.06mL·gVS-1、139.27mL·gVS-1。同時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中測(cè)得的甲烷濃度也是評(píng)估厭氧消化反應(yīng)過(guò)程穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，M1-M4實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生的甲烷濃度平均值分別為61.12%、60.63%、57.22%、53.58%。為單一組分抗生素的實(shí)際沼氣工程提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

由于粗纖維、淀粉、粗蛋白是雞糞的主要成分，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)了纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、脲酶四種水解酶以及脫氫酶。脫氫酶活性的強(qiáng)弱通常作為衡量活性污泥性能的指標(biāo)，一定程度上反映了菌群的活性狀態(tài)[8]。實(shí)驗(yàn)初期中高濃度ENR脫氫酶活性更高，而中后期脫氫酶活性有較大差別。脲酶活性明顯隨ENR濃度的增加而升高，說(shuō)明高濃度ENR對(duì)以含氮有機(jī)物為底物的水解菌活性更有益。但根據(jù)產(chǎn)氣結(jié)果，M1、M2較高的酶活性并未促進(jìn)整個(gè)厭氧反應(yīng)的進(jìn)行，20mg/kg·TS，40mg/kg·TS ENR對(duì)產(chǎn)甲烷反應(yīng)有一定的消極作用。纖維素酶可以將纖維素降解為寡糖或單糖[9]，主要分泌菌群有：Megasphaera、Bacteroides、unidentified_Spirochaetaceae和Candidatus_Cloacimonas等，通過(guò)對(duì)比可以看出纖維素酶相對(duì)于淀粉酶和蛋白酶活性較高，其中M1組纖維素酶活性要高于M2、M3和M4組，且M1在40d左右達(dá)到峰值為270.57U·mL-1，M2、M3和M4組在第30d左右達(dá)到峰值分別為242.67U·mL-1、240.46U·mL-1和220.15U·mL-1，這一結(jié)果表明，未添加抗生素的空白組提高厭氧消化過(guò)程中纖維素酶活性，提高了對(duì)原料的利用率。蛋白酶主要水解原料中粗蛋白分子間的肽鏈而形成氨基酸，淀粉酶負(fù)責(zé)葡萄糖的釋放和多糖的水解[10]，脂肪酶主要催化甘油三酯轉(zhuǎn)變?yōu)楦视秃椭舅?，其在水解酸化過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群主要有：Candidatus_Cloacimonas、Lactobacillus、Ruminiclostridium和Bacteroides，對(duì)比M1-M4四組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，M1組蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、活性均高于M2、M3和M4組，M1組各水解酶峰值為：133.82IU·L-1（蛋白酶）、335.47IU·L-1（淀粉酶）、470.76U·L-1（脂肪酶），M2組各水解酶峰值為：107.69IU·L-1（蛋白酶）、318.73IU·L-1（淀粉酶）、404.81U·L-1（脂肪酶）。而M3組蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均在40天左右達(dá)到峰值，峰值為：106.81IU·L-1（蛋白酶）、277.00IU·L-1（淀粉酶）、431.12U·L-1（脂肪酶）。根據(jù)這一結(jié)果我們同樣可以認(rèn)為，由于抗生素的添加會(huì)導(dǎo)致厭氧消化酶活性的降低，沒(méi)有添加抗生素的空白組水解酶的活性和原料的利用率均高于添加抗生素組。

厭氧消化過(guò)程本質(zhì)是由多種微生物共同作用形成的，這是一個(gè)十分復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程。厭氧消化系統(tǒng)中包含多種厭氧微生物，其中產(chǎn)甲烷古菌和水解酸化細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)微生物菌群，水解酸化細(xì)菌為產(chǎn)甲烷古菌提供生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的氧化還原電位，產(chǎn)甲烷古菌為水解酸化細(xì)菌解除由于氫和VFAs累積而產(chǎn)生的反饋抑制，因此厭氧消化過(guò)程依靠多種微生物共同作用完成，并且微生物相互關(guān)聯(lián)又相互制約。完整的微生物動(dòng)力學(xué)特征可以通過(guò)表示了菌群群落的豐富度、多樣性和均勻性的α多樣性來(lái)表示。通過(guò)16SrRNA技術(shù)對(duì)細(xì)菌、古菌共40個(gè)樣本測(cè)序，得到序列后以97%的序列相似性聚類(lèi)到OUTs中。通過(guò)Alpha多樣性分析，對(duì)各處理的微生物群落的豐富度和多樣性進(jìn)行估計(jì)，厭氧消化過(guò)程中各組實(shí)驗(yàn)細(xì)菌和古菌的α多樣性，從OTU、豐富度、均勻度和多樣性等指標(biāo)可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落價(jià)值要高于古菌群落，這與之前的研究結(jié)果一致，在不同采樣時(shí)期對(duì)α多樣性進(jìn)行進(jìn)一步比較顯示，隨著厭氧消化的性能下降，所有指標(biāo)均表現(xiàn)出不同規(guī)則的波動(dòng)，這正如其他研究所提到的，生物系統(tǒng)的多樣性可以表示厭氧微生物群落的發(fā)展歷程。均勻度指數(shù)（Chao1值）和ACE能夠反映群落豐富程度，指數(shù)越高，微生物群落豐富程度越高。Shannon指數(shù)可反映厭氧微生物相對(duì)豐度，該指數(shù)越大表明優(yōu)勢(shì)菌群生物量占總生物量比重越小。Simpson指數(shù)是指在樣本數(shù)據(jù)中隨機(jī)抽取的兩個(gè)OTU是不同物種的概率。可以得出概率越大樣本中的物種多樣性越高，概率越小樣本中的物種豐富度越低。Simpson指數(shù)可以評(píng)估優(yōu)勢(shì)物種在群落中的地位和作用。細(xì)菌的OTU數(shù)量要比古菌的OTU數(shù)量大很多，并且細(xì)菌的Shannon、Simpson、Chao1、ACE指數(shù)均大于古菌，說(shuō)明在整個(gè)厭氧消化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)菌物種的豐富度和均勻度高于古菌。比較四組實(shí)驗(yàn)可以看出M2（雞糞VS:秸稈VS=9:1）物種豐富度和均勻度更高，因此可以看出添加適當(dāng)比例的秸稈對(duì)厭氧消化過(guò)程有促進(jìn)作用，能提高對(duì)原料的利用率。

3.結(jié)論

（1）在厭氧發(fā)酵第6～13d和23～29d，恩諾沙星對(duì)甲烷日產(chǎn)氣速率有顯著的抑制作用，在30d后對(duì)甲烷產(chǎn)氣速率影響不大；在整個(gè)厭氧發(fā)酵過(guò)程中，恩諾沙星降低了厭氧發(fā)酵沼氣總產(chǎn)氣量，且會(huì)隨著濃度的增加而影響加劇，恩諾沙星影響下厭氧發(fā)酵水解酶活性與沼氣產(chǎn)氣量呈正相關(guān)。

（2）M1組的各水解酶活性均高于M2、M3和M4，抗生素的添加抑制了厭氧消化過(guò)程中微生物活性，抑制了厭氧消化系統(tǒng)中微生物降解有機(jī)質(zhì)的水解速率和產(chǎn)甲烷速率，且一定程度上降低了酶的活性。

（3）實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌的Shannon、Simpson、Chao1、ACE指數(shù)均大于古菌，即細(xì)菌物種的豐富度和均勻度高于古菌，M2（雞糞VS:秸稈VS=9:1）物種豐富度和均勻度最高，添加適當(dāng)比例的秸稈對(duì)厭氧消化過(guò)程有促進(jìn)作用，能提高對(duì)原料的利用率。