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    TEAD4與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌增殖和侵襲的關(guān)系及分子機(jī)制探討

    2022-01-27 03:29:40姚華娟張雨婷王紅梅熊秀娟宋恩霖
    關(guān)鍵詞:子宮頸鱗狀鱗癌

    姚華娟,張雨婷,王紅梅,熊秀娟,宋恩霖*

    (1.南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院,江西 撫州 344000;2.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,江西 南昌 330006)

    子宮頸癌是影響女性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一,且近年其發(fā)病有年青化趨勢(shì),許多年青患者早期即出現(xiàn)不良的生物學(xué)行為,如局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致預(yù)后不良。故鑒定出與子宮頸癌不良生物學(xué)行為有關(guān)的分子靶標(biāo),對(duì)子宮頸癌的治療和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。高危型人乳頭瘤病毒(HPV16/18)感染是引起子宮頸癌最主要的原因,目前有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,在HPV16誘導(dǎo)下的角質(zhì)細(xì)胞中存在TEAD4的高水平表達(dá)[1],說(shuō)明TEAD4很可能參與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程,然而它對(duì)子宮頸鱗癌的具體調(diào)節(jié)功能尚不清楚。

    TEAD4(transcriptional enhancer associate domain family member 4)屬于TEAD轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員之一[2],TEAD4分子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域能與YAP(Hippo信號(hào)通路中主要的共激活因子)相結(jié)合,形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體,調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前已發(fā)現(xiàn),TEAD4與胃癌[3]、口腔鱗癌[4]等多種惡性腫瘤的不良生物學(xué)行為有關(guān),但關(guān)于TEAD4與子宮頸癌的關(guān)系目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)檢測(cè)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中TEAD4蛋白的表達(dá)情況,分析TEAD4的表達(dá)與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌不良生物學(xué)行為之間的關(guān)系,在細(xì)胞學(xué)水平觀察高水平TEAD4的條件下,子宮頸鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的變化,并進(jìn)一步觀察此條件下癌細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)蛋白的表達(dá)變化情況,從而研究TEAD4與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌增殖和侵襲的關(guān)系及其分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 組織標(biāo)本

    收集南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院確診的浸潤(rùn)性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌癌石蠟包埋標(biāo)本50例,患者平均年齡44歲。所有患者術(shù)前均未行放、化療。另取20例正常宮頸上皮組織標(biāo)本作為對(duì)照組。

    1.2 免疫組化

    采用MaxVision法,石蠟標(biāo)本3~5 μm厚切片,65 ℃烘箱烤片2 h,常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,自來(lái)水沖洗,檸檬酸鈉抗原熱修復(fù),3%H2O2處理,PBS漂洗。取目標(biāo)蛋白一抗(兔抗人TEAD4多克隆抗體,504151,成都正能生物技術(shù)有限公司;兔抗人MMP9多克隆抗體,27306-1-AP,美國(guó)Proteintech公司))工作液50 μL孵育,4 ℃過(guò)夜,PBS洗滌后,每片滴加MaxVision二抗工作液(KIT-5010,福州邁新生物公司)50 μL,室溫下孵育30 min,充分洗滌后DAB顯色,蘇木精復(fù)染,中性樹(shù)膠封固。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。測(cè)量平均光密度(mean optic density,MOD)進(jìn)行蛋白表達(dá)半定量結(jié)果判定。在光鏡下選取腫瘤組織中陽(yáng)性最強(qiáng)的3個(gè)高倍視野(×400),數(shù)碼拍照,圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0準(zhǔn)確分割陽(yáng)性區(qū)域,測(cè)量MOD值。相同條件下,每張圖片測(cè)量3次,每張切片選取3張視野測(cè)量,以9次測(cè)量的MOD均值作為該視野中蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

    1.3 子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞TEAD4基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

    子宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa(TCHu113,中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))用含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。3×105/mL的細(xì)胞濃度接種2 mL細(xì)胞懸液于6孔板,24 h后更換為無(wú)血清無(wú)雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為3組:control組、vector組(空載質(zhì)粒)、pCMV3-TEAD4組,分別用無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM 500 μL稀釋6 μg的pCMV3-TEAD4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司)、6 μg的pCMV3空載質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司)和2只10 μL脂質(zhì)體Sinofection(STFO2,北京義翹神州生物公司),室溫孵育5 min,各自將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物,室溫孵育20~25 min,加入對(duì)應(yīng)孔板中。control組加入正常培養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6 h,更換培養(yǎng)基為新鮮含10%血清不含雙抗的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,通過(guò)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果及相關(guān)蛋白變化,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.4 Western blot

    Ripa裂解液中加入蛋白酶抑制劑和磷酸酯酶抑制劑,配成細(xì)胞裂解液。利用該細(xì)胞裂解液裂解目的細(xì)胞從而提取總蛋白,用以檢測(cè)TEAD4、p-ERK(兔抗人多克隆抗體,AF1015,購(gòu)自美國(guó)Affinity公司)、total-ERK(兔抗人多克隆抗體,16443-1-AP,美國(guó)Proteintech公司)和MMP9蛋白表達(dá);蛋白濃度測(cè)定后,按每孔20 μL上樣量用Loading Buffer和Ripa液配平,沸水加熱(5min)后冷卻離心上樣,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉,加入一抗4 ℃過(guò)夜;TBST洗滌后加入二抗(1:5 000)常溫?fù)u床孵育;洗滌膜后,利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒孵育發(fā)光,顯影。利用Image Pro Plus軟件測(cè)量目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶的灰度值,以目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。每組目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

    將正常SiHa細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,按每孔100 μL含2 000個(gè)細(xì)胞的濃度接種于96孔板,分為control組、vector組、pCMV3-TEAD4組,每組5個(gè)復(fù)孔,孔板中為無(wú)血清無(wú)雙抗的培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后分別對(duì)vector組和pCMV3-TEAD4組的癌細(xì)胞分別進(jìn)行空質(zhì)粒和pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基為新鮮含10%血清不含雙抗的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,加入10%的CCK-8工作液(CCK-8試劑盒,CK04,北京沃比森科技公司),在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h,于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)OD值,計(jì)算各組細(xì)胞增殖活力值。

    1.6 Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

    將pCMV3空載質(zhì)粒(vector組)和pCMV3-TEAD4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pCMV3-TEAD4組)分別轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞48 h后,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL,將含有基膜提取物涂層并包被有聚碳酸酯膜的Coring Transwell小室置于24孔板,于小室的上室脂膜上鋪一層薄層Matrigel基質(zhì)膠(約100 μL),待基質(zhì)膠自然干燥后再于上室接種100 μL上述細(xì)胞懸液(含5000個(gè)細(xì)胞),通過(guò)上室的測(cè)孔于下室中加入含有15%FBS的DMEM培養(yǎng)基500 μL,并使得上室底部與下室培養(yǎng)基剛好接觸,37 ℃培養(yǎng)24 h后,各上室加入適量的蘇木精染色5 min,PBS洗滌,環(huán)形切割上室底部微孔膜,粘貼于載玻片,中性樹(shù)膠固封,顯微鏡下(×200)隨機(jī)觀察5個(gè)代表性視野,計(jì)數(shù)每個(gè)視野中細(xì)胞數(shù),取均數(shù)代表各組細(xì)胞的侵襲能力,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”,組間比較采用t檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spear相關(guān)分析法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 子宮頸鱗癌組織中TEAD4的表達(dá)

    TEAD4在正常子宮頸上皮中的表達(dá)呈弱陽(yáng)性甚至陰性(圖1A);而在子宮頸癌組織中的表達(dá)呈明顯強(qiáng)陽(yáng)性,其主要表達(dá)于子宮頸鱗癌細(xì)胞的胞質(zhì)和(或)胞核(圖1B)。光密度檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),TEAD4在宮頸鱗癌組織的平均表達(dá)水平(0.186±0.355)顯著高于其在正常子宮頸上皮中的表達(dá)水平(0.0494±0.0105,P<0.001,圖1C)。

    圖1 (A)TEAD4在正常宮頸上皮組織中呈微弱表達(dá)(Maxvision染色,×400,箭頭:微弱表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞)、(B)TEAD4在宮頸鱗癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),表達(dá)于癌細(xì)胞的胞質(zhì)和/或胞核(Maxvision染色,×400,箭頭:強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞)、(C)TEAD4在宮頸鱗癌(50例)中表達(dá)水平顯著高于正常宮頸上皮組織(20例),*,P<0.001。

    2.2 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中TEAD4的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

    TEAD4的表達(dá)與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)、脈管浸潤(rùn)(P<0.05)和宮旁浸潤(rùn)(P<0.05)有關(guān),與腫瘤大小、分化程度以及患者的年齡無(wú)關(guān)(表1)。

    表1 TEAD4的表達(dá)與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌病理參數(shù)之間的關(guān)系

    2.3 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中TEAD4的表達(dá)與MMP9表達(dá)的相關(guān)性

    MMP9在正常宮頸上皮組織中呈弱表達(dá)(圖2A),在子宮頸癌組織中呈明顯陽(yáng)性表達(dá),胞質(zhì)呈棕黃色顆粒(圖2B),且MMP9的表達(dá)與TEAD4的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.394,P<0.01,圖2C)。

    子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中TEAD4表達(dá)水平

    2.4 TEAD4過(guò)表達(dá)對(duì)子宮頸鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響

    pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞中TEAD4的表達(dá)水平(0.84±0.037)顯著高于control組(0.43±0.061,P<0.01)和vector組(0.47±0.045,P<0.01),而control組和vector組癌細(xì)胞中TEAD4的表達(dá)水平無(wú)明顯差異,說(shuō)明基因轉(zhuǎn)染成功(圖3A-B)。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3C),pCMV3-TEAD4組癌細(xì)胞增殖活力(1.18±0.067)分別顯著高于control組和vector組癌細(xì)胞(0.94±0.033,P<0.01;0.93±0.037,P<0.01)。

    圖3 (A)宮頸鱗癌細(xì)胞TEAD4基因轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組中TEAD4蛋白的表達(dá),con,空白對(duì)照組;vec,空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照組;pCMV3-TEAD4,TEAD4基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、(B)TEAD4在TEAD4基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(n=3)的表達(dá)水平分別顯著高于空白對(duì)照組(n=3,P<0.001)和陰性對(duì)照組(n=3,P<0.001)、(C)TEAD4基因轉(zhuǎn)染組宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖能力分別顯著高于空白對(duì)照組(n=5,P<0.001)和陰性對(duì)照組(n=5,P<0.001)。

    2.5 TEAD4過(guò)表達(dá)對(duì)子宮頸鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響

    Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4A),pCMV3-TEAD4組癌細(xì)胞侵襲能力(81.3±7.23)分別顯著高于control組和vector組癌細(xì)胞(55.3±8.50,P<0.05;59.0±8.54,P<0.05)(圖4B)。

    圖4 (A)Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)比較TEAD4基因轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組的宮頸鱗癌細(xì)胞侵襲能力;con,空白對(duì)照組,vec,陰性對(duì)照組,pCMV3-TEAD4,TEAD4基因轉(zhuǎn)染組(n=3,蘇木素染色,×200)、(B)TEAD4基因轉(zhuǎn)染組(n=3)癌細(xì)胞侵襲能力分別顯著高于空白對(duì)照組(n=3,P<0.05)和陰性對(duì)照組(n=3,P<0.05)。

    2.6 TEAD4高表達(dá)對(duì)子宮頸鱗癌細(xì)胞中ERK磷酸化與MMP9蛋白表達(dá)的影響

    pCMV3-TEAD4組癌細(xì)胞中MMP9的表達(dá)水平為(0.93±0.046)顯著高于未轉(zhuǎn)染組(0.51±0.040,P<0.05)組(圖5),而且pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞中p-ERK的表達(dá)水平(0.57±0.056)顯著高于control組(0.34±0.021,P<0.05),提示TEAD4高表達(dá)可上調(diào)子宮頸鱗癌細(xì)胞MMP9的表達(dá)水平(圖5)。

    2.7 ERK活化對(duì)TEAD4上調(diào)MMP9表達(dá)的影響

    利用ERK抑制劑U0126預(yù)處理癌細(xì)胞后再進(jìn)行pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,此聯(lián)合處理組的癌細(xì)胞中p-ERK的表達(dá)水平(0.277±0.060)顯著低于上述pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P<0.01),且此時(shí)聯(lián)合處理組癌細(xì)胞中MMP9的表達(dá)水平(0.46±0.046)也顯著低于pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(0.93±0.046,P<0.01),而聯(lián)合處理組和pCMV3-TEAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組之間的TEAD4的表達(dá)水平無(wú)顯著差異性(P>0.05)(圖5)。圖5結(jié)果顯示,高表達(dá)TEAD4能增強(qiáng)或提高癌細(xì)胞中p-ERK水平和MMP9的表達(dá),且p-ERK能提高M(jìn)MP9的表達(dá),表明TEAD4能提高癌細(xì)胞中MMP9的表達(dá)是通過(guò)增加p-ERK水平實(shí)現(xiàn)的。

    圖5 (A)MMP9和P-ERK在正常對(duì)照組癌細(xì)胞、TEAD4基因轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞和ERK抑制劑與TEAD4基因轉(zhuǎn)染的聯(lián)合處理組癌細(xì)胞中的表達(dá),con,正常對(duì)照組(n=3),TEAD4+,TEAD4基因轉(zhuǎn)染組(n=3),U0126+TEAD4+,ERK抑制劑U0126與TEAD4基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合處理組(n=3)、(B)MMP9和P-ERK在TEAD4基因轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞中的表達(dá)水平分別顯著高于對(duì)照組(P<0.05,P<0.05),而MMP9和P-ERK在ERK抑制劑與TEAD4基因轉(zhuǎn)染的聯(lián)合處理組癌細(xì)胞中的表達(dá)水平分別顯著低于TEAD4基因轉(zhuǎn)染組(P<0.01,P<0.01)。

    3 討論

    作為T(mén)EAD轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白之一,TEAD4分子結(jié)構(gòu)N-末端含有能與基因啟動(dòng)子區(qū)MACT模序結(jié)合的TEA(transcription enchance activation)結(jié)構(gòu)域[5],C-末端具有與轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域[2]。TEAD4的分子結(jié)構(gòu)特征決定了它能與Hippo信號(hào)通路中的核心轉(zhuǎn)錄共激活子YAP(Yes-associated protein)相結(jié)合,形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物,從而介導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄或偶聯(lián)其他信號(hào)通路的激活。Hippo在調(diào)控器官大小與組織穩(wěn)態(tài)方面起著非常重要的作用[6],Hippo信號(hào)通路失調(diào)會(huì)導(dǎo)致器官過(guò)度生長(zhǎng)乃至腫瘤的發(fā)生,因此TEAD4對(duì)YAP轉(zhuǎn)錄功能的活化作用,決定了TEAD4具有類似原癌基因的功能。TEAD4-YAP作用可通過(guò)介導(dǎo)多種下游靶基因的表達(dá),調(diào)節(jié)腫瘤的代謝[7]、生長(zhǎng)[8]、浸潤(rùn)[9]和轉(zhuǎn)移[10]等生物學(xué)行為,從而影響惡性腫瘤的進(jìn)展。有研究報(bào)道,TEAD4的高表達(dá)與頭頸鱗癌[11]、膀胱癌[12]和膠質(zhì)瘤[13]等多種腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。至于TEAD4與宮頸癌之間的關(guān)系,目前鮮有報(bào)道,然而卻有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,HPV16可誘導(dǎo)角質(zhì)上皮細(xì)胞中TEAD4的高表達(dá)[1]。HPV16感染是宮頸鱗狀細(xì)胞癌的主要病因之一,HPV16能誘導(dǎo)TEAD4表達(dá)上調(diào),這一實(shí)驗(yàn)證據(jù)提示TEAD4很可能參與調(diào)節(jié)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。鑒于前人已研究證實(shí)TEAD4對(duì)多種惡性腫瘤進(jìn)展具有調(diào)節(jié)作用,出于興趣,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)兩個(gè)水平,研究TEAD4對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)能力的影響,并初步探討其可能的分子機(jī)制。

    本實(shí)驗(yàn)組織學(xué)結(jié)果顯示,子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中TEAD4的表達(dá)水平顯著高于正常子宮頸上皮組織,提示子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中存在TEAD4的高表達(dá)。進(jìn)一步的臨床病理參數(shù)分析結(jié)果顯示,TEAD4的表達(dá)與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)和宮旁浸潤(rùn)有關(guān),提示TEAD4可能調(diào)節(jié)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)、局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力等不良生物學(xué)行為,從而促進(jìn)子宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展。Zhang[11]等研究證實(shí),TEAD4高表達(dá)于頭頸鱗癌組織,且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等不良生物學(xué)行為有關(guān),我們的組織學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Zhang等的研究報(bào)道基本相符。為初步揭示TEAD4促進(jìn)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌侵襲進(jìn)展的可能機(jī)制,我們檢測(cè)了與癌生長(zhǎng)侵襲有關(guān)的最常見(jiàn)指標(biāo)MMP9的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP9的表達(dá)與TEAD4的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系,這一結(jié)果暗示,TEAD4可能是通過(guò)介導(dǎo)MMP9的表達(dá)上調(diào)從而調(diào)節(jié)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。

    為進(jìn)一步驗(yàn)證上述組織學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本課題通過(guò)基因轉(zhuǎn)染的手段改變子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞中TEAD4的表達(dá)水平,從而觀察高水平的TEAD4對(duì)子宮頸鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的影響。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TEAD4基因轉(zhuǎn)染后的癌細(xì)胞增殖活力顯著高于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組,說(shuō)明TEAD4能提高子宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖能力。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染和陰性對(duì)照的癌細(xì)胞相比,TEAD4基因轉(zhuǎn)染后的癌細(xì)胞表現(xiàn)出顯著升高的侵襲能力,說(shuō)明TEAD4能提高子宮頸鱗癌細(xì)胞的侵襲能力。為進(jìn)一步探明TEAD4提高子宮頸鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲能力是否與MMP9有關(guān),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blotting進(jìn)一步檢測(cè)在上述條件下子宮頸鱗癌細(xì)胞中MMP9的蛋白水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在TEAD4基因轉(zhuǎn)染后的癌細(xì)胞中,MMP9的表達(dá)水平也高于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組。該結(jié)果說(shuō)明,TEAD4能介導(dǎo)子宮頸鱗癌細(xì)胞MMP9的表達(dá)上調(diào)。MMP9是一個(gè)經(jīng)典的調(diào)節(jié)因子,在不同組織起源的癌細(xì)胞中能通過(guò)不同的信號(hào)機(jī)制提高癌細(xì)胞生長(zhǎng)和浸潤(rùn)能力[14-16],我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示,TEAD4可能通過(guò)上調(diào)MMP9的表達(dá)而促進(jìn)子宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。誠(chéng)然,TEAD4能介導(dǎo)多種下游效應(yīng)分子的表達(dá),例如有研究報(bào)道,TEAD4-YAP能通過(guò)介導(dǎo)CTGF(結(jié)締組織生長(zhǎng)因子)轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增長(zhǎng)和浸潤(rùn)能力[17],且可通過(guò)介導(dǎo)Jagged1的表達(dá)上調(diào)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖能力[18]。除了MMP9之外,TEAD4是否還能通過(guò)介導(dǎo)其他的下游靶基因轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)子宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)能力,尚須進(jìn)一步研究。

    為深入研究TEAD4調(diào)節(jié)子宮頸鱗癌增殖和浸潤(rùn)能力的分子機(jī)制,本課題檢測(cè)了在不同的TEAD4表達(dá)水平條件下癌細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)分子的活化水平情況。在TEAD4基因轉(zhuǎn)染后的癌細(xì)胞中,ERK的活化形式P-ERK的水平顯著高于未轉(zhuǎn)染組,說(shuō)明TEAD4能活化子宮頸鱗癌細(xì)胞中ERK信號(hào)。為進(jìn)一步明確TEAD4介導(dǎo)MMP9的表達(dá)上調(diào)是否與ERK信號(hào)的活化有關(guān),本實(shí)驗(yàn)利用ERK活化抑制劑U0126預(yù)處理子宮頸鱗癌細(xì)胞,然后再進(jìn)行TEAD4基因轉(zhuǎn)染,結(jié)果驚奇的發(fā)現(xiàn),與正常轉(zhuǎn)染組的癌細(xì)胞相比,在ERK活化受抑制的條件下,癌細(xì)胞中MMP9的表達(dá)水平顯著低于正常轉(zhuǎn)染組,這一結(jié)果說(shuō)明TEAD4是通過(guò)激活子宮頸鱗癌細(xì)胞ERK信號(hào)這一途徑來(lái)上調(diào)下游靶基因MMP9的表達(dá)。Chang等研究證實(shí)[19],TEAD4能通過(guò)活化ERK信號(hào)通路而促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)展,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Chang的研究結(jié)果相符。作為經(jīng)典的Hippo信號(hào)共激活子,TEAD4通常與YAP結(jié)合形成復(fù)合物介導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄或者偶聯(lián)其他信號(hào)通路的活化,但最新有學(xué)者通過(guò)與YAP結(jié)合缺陷的突變體TEAD4Y429進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí),TEAD4能通過(guò)不依賴與YAP結(jié)合的方式調(diào)控結(jié)腸癌中Vimentin的表達(dá),從而促進(jìn)結(jié)腸癌EMT的發(fā)生[20],這可能與TEAD4分子結(jié)構(gòu)中的DNA結(jié)合域的功能有關(guān)??梢?jiàn),TEAD4可通過(guò)YAP依賴和YAP非依賴的方式介導(dǎo)下游靶分子的活化或轉(zhuǎn)錄,那么在子宮頸鱗癌細(xì)胞中,TEAD4介導(dǎo)ERK信號(hào)的活化是否具有YAP依賴性,尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。此外,本課題組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn),TEAD4表達(dá)于子宮頸鱗癌細(xì)胞的胞質(zhì)和/或胞核,TEAD4促進(jìn)子宮頸鱗癌生長(zhǎng)浸潤(rùn)能力是否與它在癌細(xì)胞中的表達(dá)定位有關(guān),也值得我們深入研究。

    綜上所述,本研究證實(shí)子宮頸鱗癌中存在TEAD4的高表達(dá),TEAD4能提高子宮頸鱗癌的生長(zhǎng)浸潤(rùn)能力,其分子機(jī)制與TEAD4活化ERK信號(hào)從而上調(diào)癌細(xì)胞MMP9的表達(dá)有關(guān)。

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