miR-25-3p表達(dá)水平與急慢性肝衰竭預(yù)后的關(guān)系探討

黃明，彭彬，辛大平，房仲平

(廣安市人民醫(yī)院 肝膽外科，四川 廣安 638001)

急慢性肝衰竭在慢性肝病患者中較常見，臨床癥狀包括腹水、凝血障礙、黃疸等，在肝衰竭中占比高達(dá)60%，我國慢性乙肝(chronic hepatitis B，CHB)患病率較高，導(dǎo)致與之相關(guān)的急慢性肝衰竭發(fā)生率也較高[1-2]。目前，由于肝衰竭缺乏特效藥物進(jìn)行干預(yù)，主要通過積極對(duì)癥處理控制病情，盡早診療是預(yù)防并發(fā)癥、降低死亡率的關(guān)鍵，早期診療對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸而言至關(guān)重要。既往臨床通過癥狀表現(xiàn)、肝功能檢查等對(duì)急慢性肝衰竭進(jìn)行輔助評(píng)估，雖然有一定價(jià)值，但對(duì)預(yù)后評(píng)價(jià)的效果欠佳[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)對(duì)可編碼蛋白基因有調(diào)控作用，能通過與某些編碼基因結(jié)合，在肝病中發(fā)揮作用[4]。有學(xué)者指出微小核糖核酸-25-3p(miR-25-3p)表達(dá)可能與機(jī)體重要臟器功能(如肝、肺、心等)受損有關(guān)，但具體機(jī)制不詳[5]?？紤]到慢性肝衰竭患者伴有明顯的肝損害，本研究擬分析miR-25-3p表達(dá)水平與急慢性肝衰竭預(yù)后的關(guān)系，尋求與該病相關(guān)的新預(yù)測(cè)標(biāo)志物以及干預(yù)靶點(diǎn)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入我院2018年9月至2020年9月收治的急慢性肝衰竭患者84例作為肝衰竭組，選取同期收治的CHB患者77例作為CHB組，選取同期于我院體檢的健康志愿者60例作為對(duì)照組。研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，3組基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組基線資料的比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)肝衰竭組：滿足《肝衰竭診治指南(2018年版)》[6]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)者；年齡≥18歲者；就診時(shí)行肝功能檢查、血清miR-25-3p檢測(cè)者；對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意者。(2)CHB組：滿足《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[7]中關(guān)于CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)者；未見CHB相關(guān)的并發(fā)癥者；年齡≥18歲者；乙型肝炎表面抗原陽性持續(xù)時(shí)間超過6個(gè)月者；能配合完成相關(guān)檢查者；知情同意者。(3)對(duì)照組：同期體檢的健康志愿者，肝功能正常；年齡≥18歲者；可配合檢查者；簽署同意書者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 因酒精、藥物所致肝損傷者；患有惡性腫瘤者；患脂肪肝、自身免疫性肝炎者；心、腦等臟器功能不全者；入院前1個(gè)月內(nèi)有抗病毒治療史者。

1.3 方法

3組受試者均采集5 ml空腹肘靜脈血，分裝于兩管，一管用于檢測(cè)肝功能指標(biāo)，另一管用于檢測(cè)乙肝病毒基因(Hepatitis B virus-DNA，HBV-DNA)及miR-25-3p。采血后離心10 min，轉(zhuǎn)速3 000 r·min-1，離心半徑8cm，分離血清，存放于-70 ℃待測(cè)。

1.3.1 肝功能指標(biāo)檢測(cè) 采用海力孚HF-240全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、白蛋白(albumin，ALB)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)水平，吸取約20 μl血樣上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 HBV-DNA檢測(cè) 采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法檢測(cè)，儀器為杭州博日科技FQD-48A PCR檢測(cè)儀，HBV-DNA試劑由東北制藥集團(tuán)股份有限公司提供，利用濃縮裂解法對(duì)HBV-DNA進(jìn)行提取，擴(kuò)增條件為93 ℃預(yù)變性2 min，93 ℃變性5 s，57 ℃退火、延伸45 s，40個(gè)循環(huán)，待反應(yīng)完畢經(jīng)電腦軟件分析定量結(jié)果。

1.3.3 血清miR-25-3p檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR(quantitative real-time reverse transcription PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)，主要試劑為氯仿、異丙醇、蒸餾水，由Invitrogen公司配制，Trizol及miRNA試劑購自賽默飛世爾科技公司。主要儀器為TGL-16M型離心機(jī)(山東博科生物有限公司)、FQD-48A型PCR檢測(cè)儀(杭州博日科技有限公司)、F3系列微量移液器(賽默飛世爾科技公司)。具體方法如下：(1)提取與檢測(cè)總RNA。將存放于低溫環(huán)境內(nèi)的血清取出，在室溫下復(fù)溫，取血清400 μl置于EP管內(nèi)，取Total RNA 提取試劑1 ml加入，經(jīng)移液槍吹打，在常溫下反應(yīng)25 min；在4 ℃下離心10 min(12 000 r·min-1)；留取上清液放置于新EP管內(nèi)，取氯仿200 μl加入，封蓋，振蕩混勻，室溫下反應(yīng)15 min；在4 ℃下離心10 min(12 000 r·min-1)，此時(shí)樣本出現(xiàn)3層，分別為水樣層(上層)、中間層以及苯酚-氯仿層(下層)，RNA在上層水樣中；取異丙醇500 μl加入新EP管內(nèi)，將上層水樣加入，在4 ℃下反應(yīng)10 min，離心處理20 min(12 000 r·min-1)；將上清液移去，取75%乙醇1 ml加入，混合充分，在4 ℃下離心20 min(700 r·min-1)；將上清液去除，在室溫下靜置15 min，取去離子水25 μl加入，使RNA溶解；取總RNA 2 μl，測(cè)定RNA濃度、純度，如果A260/A280在1.8～2.0之間，則提示純度合格。(2)針對(duì)總RNA行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA液，待反應(yīng)完畢取出cDNA產(chǎn)物，迅速將其冷卻，行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；92 ℃變性2 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，50個(gè)循環(huán)。引物序列如下：miR-25-3p上、下游序列分別為5′-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3′、5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；以U6為內(nèi)參引物，上、下游序列分別為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′、5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′。待循環(huán)結(jié)束觀察溶解曲線的變化，檢測(cè)溫度、升溫速度以及恒溫時(shí)間分別為70～95 ℃、0.5 ℃·次-1、5 s·次-1，以2-ΔΔCT表示miR-25-3p表達(dá)水平。

1.3.4 隨訪分析 從患者住院開始觀察，直至觀察3個(gè)月結(jié)束，對(duì)出院的患者通過微信、電話進(jìn)行隨訪，記錄預(yù)后情況，并將生存者納入生存組，死亡者納入死亡組，本次無失訪病例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比(%)表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，3組間比較采用方差分析，兩兩比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。急慢性肝衰竭患者血清miR-25-3p水平與肝功能指標(biāo)及HBV-DNA的相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)分析，采用Cox多元回歸模型分析預(yù)后危險(xiǎn)因素，繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線分析miR-25-3p評(píng)估預(yù)后的曲線下面積(area under the curve，AUC)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清miR- 25- 3p、肝功能指標(biāo)及HBV- DNA的比較

肝衰竭組、CHB組的血清TBIL、AST、ALT水平高于對(duì)照組，血清miR-25-3p、ALB水平低于對(duì)照組；肝衰竭組血清miR-25-3p表達(dá)水平低于CHB組，血清TBIL、AST、ALT水平高于CHB組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝衰竭組與CHB組HBV-DNA比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組血清miR-25-3p、肝功能指標(biāo)及HBV-DNA比較 例

2.2 肝衰竭組患者血清miR- 25- 3p與肝功能指標(biāo)、HBV- DNA的相關(guān)性

Pearson線性相關(guān)分析顯示，血清miR-25-3p與TBIL、AST、ALT呈負(fù)相關(guān)(分別為r=-0.524、P=0.007，r=-0.768、P<0.001，r=-0.741、P<0.001)，與ALB、HBV-DNA無相關(guān)性(分別為r=0.274、P=0.059，r=0.196、P=0.078)。

2.3 肝衰竭組不同預(yù)后患者血清miR- 25- 3p、肝功能指標(biāo)、HBV- DNA比較

在84例急慢性肝衰竭患者中，3個(gè)月內(nèi)生存55例(65.48%)，死亡29例(34.52%)。死亡組血清miR-25-3p表達(dá)水平低于生存組，血清TBIL、AST、ALT水平高于生存組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組ALB、HBV-DNA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 肝衰竭組不同預(yù)后患者血清miR-25-3p、肝功能指標(biāo)、HBV-DNA比較

2.4 肝衰竭組患者預(yù)后的單因素及Cox多因素回歸分析

單因素分析顯示生存組與死亡組間ALB、HBV-DNA表達(dá)無差異，故此處將這兩項(xiàng)變量排除。以miR-25-3p、TBIL、AST、ALT均值為界賦值，以預(yù)后為因變量Y(生存=0，死亡=1)，Cox多因素回歸分析顯示，血清miR-25-3p水平增高是預(yù)后的保護(hù)性因素，而血清TBIL、AST、ALT水平增高是預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表4。

表4 肝衰竭組患者預(yù)后的單因素及Cox多因素回歸分析

2.5 血清miR- 25- 3p評(píng)估急慢性肝衰竭預(yù)后的價(jià)值分析

ROC曲線顯示，血清miR-25-3p評(píng)估急慢性肝衰竭預(yù)后的AUC為0.768(標(biāo)準(zhǔn)誤0.058，P<0.001，95%CI0.654～0.883)，最佳界值為58.676，敏感度為88.20%，特異度為69.70%，見圖1。

圖1 血清miR-25-3p評(píng)估急慢性肝衰竭預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

急慢性肝衰竭病情進(jìn)展非常快，因受病程、發(fā)病誘因等因素影響，患者存在較大個(gè)體差異，隨著病程延長，可能引起肝性腦病、凝血功能障礙等并發(fā)癥，總體預(yù)后不理想[8]。研究表明miRNA在肝病中發(fā)揮了重要作用，它經(jīng)轉(zhuǎn)錄后能對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，與細(xì)胞凋亡、分化、增殖以及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，在血清內(nèi)存在穩(wěn)定表達(dá)[9]。尋求可靠的miRNA指標(biāo)，可能對(duì)急慢性肝衰竭評(píng)估有一定價(jià)值，從而發(fā)現(xiàn)新治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)miR-25具有抗氧化損傷作用，能減少細(xì)胞凋亡，對(duì)機(jī)體臟器有保護(hù)作用，而一旦其表達(dá)異常，則會(huì)促進(jìn)臟器損傷，例如心、肝、肺等均可能出現(xiàn)損害[10]。miR-25-3p是miR-25的3′端臂加工而產(chǎn)生的一種miRNA，現(xiàn)階段與之相關(guān)的研究較少，尚未完全明確其與肝衰竭之間的關(guān)系。本研究分析miR-25-3p在肝衰竭中的作用機(jī)制，觀察其與患者預(yù)后之間的關(guān)系，為臨床診療提供思路。

本研究結(jié)果顯示，急慢性肝衰竭患者的血清miR-25-3p水平較CHB患者、健康體檢者明顯降低。既往關(guān)于miR-25-3p的報(bào)道較少，且主要集中于腫瘤領(lǐng)域，例如薛亞軍等[11]發(fā)現(xiàn)miR-25-3p能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖參與食管鱗癌轉(zhuǎn)移過程，程燕等[12]研究顯示miR-25-3p對(duì)甲狀腺乳頭癌的診斷有一定價(jià)值。miR-25-3p的生物功能比較復(fù)雜，研究表明miR-25-3p表達(dá)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)下調(diào)可能與免疫系統(tǒng)受損有關(guān)，提示機(jī)體存在免疫功能障礙[13]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-25-3p對(duì)炎癥反應(yīng)有抑制作用，可通過下調(diào)炎癥介質(zhì)表達(dá)減輕機(jī)體炎癥[14]。這表明miR-25-3p可能通過調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)的機(jī)制保護(hù)機(jī)體功能。本研究顯示急慢性肝衰竭患者的血清miR-25-3p下調(diào)，這可能與免疫功能障礙有關(guān)。已有研究[15]證實(shí)免疫紊亂參與了肝衰竭進(jìn)展，因患者出現(xiàn)肝臟損害，繼而可導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)、腸道免疫監(jiān)視等功能受損，削弱機(jī)體免疫，患者可能因免疫系統(tǒng)受損導(dǎo)致miR-25-3p表達(dá)下調(diào)。

本研究結(jié)果顯示急慢性肝衰竭患者血清TBIL、AST、ALT水平在3組中最高，表明患者出現(xiàn)明顯肝損害，與既往結(jié)論[16]基本吻合。肝衰竭的直接表現(xiàn)為肝功能惡化，涉及的機(jī)制比較復(fù)雜，主要與肝內(nèi)炎癥、免疫紊亂、中性粒細(xì)胞失調(diào)等有關(guān)，可導(dǎo)致肝臟的解毒、轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，促進(jìn)肝損害[17]。此外，本研究顯示肝衰竭組的血清ALB下降，這對(duì)肝功能也有較大影響。ALB在血漿中存在表達(dá)，它是機(jī)體所需的一種重要蛋白質(zhì)，在肝臟解毒與運(yùn)轉(zhuǎn)中同樣發(fā)揮了重要作用，一旦ALB水平下降，則可致白蛋白功能、結(jié)構(gòu)改變，削弱肝臟的解毒與轉(zhuǎn)運(yùn)能力[18]。本研究顯示肝衰竭患者的血清miR-25-3p與TBIL、AST、ALT水平有相關(guān)性。miR-25-3p在肝衰竭中可能對(duì)機(jī)體功能有保護(hù)作用，在免疫功能障礙的情況下呈低表達(dá)，而肝衰竭患者機(jī)體處于免疫紊亂狀態(tài)，致血清miR-25-3p表達(dá)下調(diào)，免疫功能削弱不利于肝功能恢復(fù)，甚至可進(jìn)一步加重肝損害。羅杰等[19]研究提示乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝衰竭患者的miR-25-3p表達(dá)下調(diào)超過2倍，其評(píng)估該病的曲線下面積高于0.800，表明miR-25-3p表達(dá)在肝衰竭中評(píng)估價(jià)值較高。miR-25-3p參與肝損傷的機(jī)制比較復(fù)雜，可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性Notch1信號(hào)通路或Wnt、Notch信號(hào)通路，在肝臟疾病中發(fā)揮作用[20]。本研究還提示血清miR-25-3p表達(dá)增高對(duì)急慢性肝衰竭預(yù)后有保護(hù)作用，且對(duì)預(yù)后有一定評(píng)估價(jià)值。miR-25-3p表達(dá)增高可能意味著患者的機(jī)體免疫狀態(tài)較好，能對(duì)臟器功能起到保護(hù)作用，為臟器恢復(fù)提供良好的內(nèi)環(huán)境，對(duì)改善預(yù)后有益。蔡莉等[21]以糖尿病腎病小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，miR-25-3p能通過抑制機(jī)體炎癥保護(hù)小鼠的腎功能，這也提示miR-25-3p可在機(jī)體功能中發(fā)揮正向調(diào)控作用。目前，臨床針對(duì)miR-25-3p與肝病關(guān)系的研究較少見，本研究也尚處于初步探索階段，未來還需對(duì)此進(jìn)行更深入探討。

miR-25-3p在急慢性肝衰竭患者血清中呈低表達(dá)，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，其表達(dá)增高可能對(duì)預(yù)后有保護(hù)作用，臨床有望通過測(cè)定血清miR-25-3p水平對(duì)其預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。本研究局限性為樣本數(shù)據(jù)偏少，且尚未考慮地域、年齡等因素對(duì)miR-25-3p表達(dá)的影響，日后還須綜合考慮多種因素，進(jìn)一步分析miR-25-3p的作用機(jī)制。