吳秋惠,丁碩秋,任天,徐睿婷,周超,趙寶洲,鄧林紅△,劉楊△
(1.常州大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,常州 213164;2.常州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院,常州 213164)
海藻酸鹽[1]由于加工簡(jiǎn)單、生物相容性好、易降解被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、化學(xué)、食品等領(lǐng)域[2-7]。海藻酸鈉(sodium alginate,SA)是海藻酸鹽的主要來源,它是一種高分子多糖,是由β—D—甘露糖醛酸(M)和α—L—古羅糖醛酸(G)通過1—4糖苷鍵連接而成的一種線性聚合物[8]。海藻酸鈉是具有—COO—的陰離子聚合物,容易在鈣離子和其他二價(jià)陽(yáng)離子的存在下形成凝膠[9]。但是,在制備海藻酸鈣支架的過程中,單純的海藻酸鈣支架材料存在力學(xué)性能不佳、易脆等問題[10-12]。
近年來,具有良好力學(xué)性能的絲素蛋白(SF)分子被用來改善海藻酸鈣材料易脆的缺點(diǎn)[13-14]。絲素蛋白(SF)是蠶繭的主要成分,是一種天然生物材料,具有優(yōu)良的生物相容性,韌性和可降解性,被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域[15-19]。絲素蛋白是由十八種氨基酸組成,其氨基酸中含有大量的氨基、羥基和酰胺基團(tuán),海藻酸鈣(CA)中含有大量的羥基和羰基基團(tuán),可利用羥基—羥基、羥基—酰胺基、氨基—羰基間的氫鍵作用來提高SF與CA分子間的作用力,增強(qiáng)材料的力學(xué)性能[20-21]。Eivazzadeh-Keihan等[22]使用海藻酸鈉、聚乙烯醇、絲素蛋白和氫氧化鎂納米棒制備了一種復(fù)合支架。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,絲素蛋白的引入,增強(qiáng)了材料的機(jī)械強(qiáng)度,同時(shí)支架具備良好的生物相容性,復(fù)合支架的細(xì)胞存活率達(dá)92%。李寧寧等[23]采用海藻酸鈉和絲素蛋白組成的生物墨水,以含5%氯化鈣與13%F127的混合溶液作為交聯(lián)劑,利用同軸打印技術(shù)制備具有高度有序排列的可灌結(jié)構(gòu)的血管支架。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,打印出的血管支架具有完全貫通的管道結(jié)構(gòu),有利于細(xì)胞黏附和生長(zhǎng),復(fù)合支架的細(xì)胞存活率可達(dá)95%。
本研究通過Ca2+遷移帶動(dòng)SF分散在SA溶液制成一種具有“鋼筋混凝土”結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/海藻酸鈣支架。不同于傳統(tǒng)支架,該支架特殊的“鋼筋混凝土”結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出更好的力學(xué)性能。同時(shí),它具有良好的吸水率和孔隙率,使得細(xì)胞能在支架中粘附、增殖和分化。
SA(AR,阿拉丁);蠶繭(廣西柳州);溴化鋰(LiBr,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無水碳酸鈉(NaCO3,江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司);無水氯化鈣(CaCl2,AR 98%,阿拉丁);碳酸鈣(CaCO3,江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na,AR98%,阿拉丁);葡萄糖內(nèi)酯(GDL,99%,阿拉丁)。胎牛血清(α-DMEM培養(yǎng)基,Sigma-Aldrich,美國(guó));PBS緩沖液;噻唑藍(lán)(MTT,南京生興生物技術(shù)有限公司);二甲基亞砜(DMSO,賽默飛世爾科技公司);無水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。
精密電子天平(德國(guó)Sartorius);紅外光譜儀(美國(guó)ThermoNicolet);掃描電子顯微鏡(德國(guó)Zeiss);真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Labconco);力學(xué)性能試驗(yàn)機(jī)(美國(guó)BOSE);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(瑞士TECAN);激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss)。
首先將蠶繭剪開,去除蠶繭中的蠶蛹和內(nèi)膜并使用去離子水洗凈。然后置于0.02 mol/L的NaCO3溶液中,再在100℃水浴下加熱脫膠30 min后取出、擰干并用去離子水洗滌2~3次,重復(fù)3次脫膠過程。最后在60℃烘箱內(nèi)烘干,得到絲素蛋白纖維。
先將絲素蛋白纖維放入到9.3 mol/L LiBr溶液中,置于60℃烘箱,每過5 min攪拌一次,直至完全溶解。然后將溶解后的SF溶液倒入截留分子量8~14 kDa的透析袋中,在去離子水中透析3 d,期間每隔4h換一次水。透析期間,使用硝酸銀溶液檢測(cè)透析袋外水溶液,不產(chǎn)生沉淀則透析完成。最后將絲素蛋白溶液置于離心機(jī)中離心,得到純凈的SF溶液,放入4℃冰箱內(nèi)冷藏保存。
先稱取2.22 g無水氯化鈣溶于100 mL去離子水,后加入7.45 gEDTA-2Na,充分螯合形成0.2 mol/LEDTA-CaCl2溶液。再在每13 mLEDTA-CaCl2溶液中加入1 g葡萄糖內(nèi)酯GDL和2 mLSF溶液。接著配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3wt%的SA溶液置于24孔板,每孔1.5 mL。又將EDTA-CaCl2、GDL和SF混合溶液以每滴20 μL,間隔30 s的速度滴入SA溶液中,總約20滴。最后將其冷凍干燥制成支架,記為SF/CA1。
先稱取2g碳酸鈣溶于100 mL去離子水,后加入7.45 g EDTA-2Na,充分螯合形成0.2 mol/L EDTA-CaCO3溶液。再在20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 wt%的SA溶液中加入1 mL SF溶液,攪拌5 min。接著確定P=[Ca2+]/[COO—]=0.18、確定Q=[GDL]/[Ca2+]=2,加入對(duì)應(yīng)量的0.2 mol/L EDTA-CaCO3溶液和GDL粉末,攪拌5 min。最后將其注入24孔板,冷凍干燥制成支架,記為SF/CA2。
先配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3wt%的SA溶液和0.2 mol/L CaCl2溶液。然后在20 mLSA溶液中加入1 mL SF溶液,攪拌5 min。再加入2.7 mL CaCl2溶液,攪拌5 min。最后將其注入24孔板,冷凍干燥制成支架,將其記為SF/CA3。
2.4.1紅外分析 為了獲得SF/CA支架的官能團(tuán)信息,使用紅外光譜儀(美國(guó)ThermoNicolet)進(jìn)行分析。分辨率為2 cm-1,掃描波波數(shù)范圍為500~4 000 cm-1。
2.4.2形貌分析 為了獲得SF/CA支架的形貌,孔徑大小以及絲素蛋白在支架中的分布狀況,使用數(shù)碼相機(jī)、掃描電鏡、共聚焦顯微鏡對(duì)支架進(jìn)行觀測(cè)。
2.4.3孔隙率的檢測(cè) 為了獲得SF/CA支架的孔隙率,使用比重瓶,采用重量法測(cè)量孔隙率。每組支架重復(fù)測(cè)量3次,取其平均值??紫堵使饺缦拢?/p>
(1)
式中,ε為支架孔隙率;w0為比重瓶裝滿乙醇后的總質(zhì)量;w1為支架質(zhì)量;w2為組織支架完全排出氣泡后充滿乙醇后的質(zhì)量;w3為把支架從乙醇中 取出后剩余物的總質(zhì)量。
2.4.4吸水率分析 為了獲得SF/CA支架的吸水率。使用PBS緩沖液測(cè)試不同時(shí)間段吸水后支架的重量。每組支架重復(fù)測(cè)量3次,取其平均值。孔隙率公式如下:
(2)
式中ζ為支架吸水率;wx為不同時(shí)間段支架質(zhì)量;wi為支架初始的質(zhì)量。
2.4.5力學(xué)性能檢測(cè) 為了評(píng)價(jià)SF/CA支架的抗壓性能,使用BoseELF3200生物材料力學(xué)測(cè)試系統(tǒng)對(duì)支架進(jìn)行抗壓強(qiáng)度的測(cè)試。按照GB-T1041-192的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試多孔支架的壓縮強(qiáng)度。加載速度為0.5 mm/sec,每組為5個(gè)樣品。
由于SF/CA 3支架的結(jié)構(gòu)明顯不均勻,故只對(duì)SF/CA1和SF/CA2支架材料進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試。
2.4.6MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性 為了評(píng)價(jià)SF/CA支架的生物相容性,使用MTT法檢測(cè)支架的細(xì)胞毒性。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞制備成密度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液,接種于96孔板,每孔100 μL,置于37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞貼壁后,吸去原培養(yǎng)基,PBS緩沖液洗滌2次。3組分別加入200 μL浸提液,對(duì)照組加入200 μL完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)至1、3、5、7 d后,加入20 μL MTT液,培養(yǎng)4 h后棄去原培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO,低速搖床避光震蕩10 min,用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值,取平均值。
所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,樣品組≥5。單因素方差分析用于評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
為了驗(yàn)證三種絲素蛋白/海藻酸鈣(SF/CA)復(fù)合支架是否成功制備,本研究進(jìn)行了紅外分析,見圖1。
圖1 SF/CA支架的紅外光譜圖
純SA的紅外光譜顯示2 925 cm-1處為C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰;1 617 cm-1處是SA中C—O—C伸縮振動(dòng)峰;在1 416 cm-1處為—COO—的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰,在1 036 cm-1處是SA中O—H彎曲振動(dòng)峰。純SF的紅外光譜顯示1 632 cm-1和1 540 cm-1處的峰分別是β-折疊構(gòu)象(Silk II)的酰胺I和酰胺II的特征吸收峰。同時(shí),在1 234 cm-1峰屬于無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)(Silk I)的酰胺III的特征吸收峰[24]。而且,在1 055 cm-1處的峰歸因C—N拉伸振動(dòng)吸收。
絲素蛋白/海藻酸鈣(SF/CA)復(fù)合支架的紅外光譜顯示,SF在1 632 cm-1處具有較強(qiáng)的吸收峰,使得CA的C—O—C的伸縮振動(dòng)峰的特征吸收峰消失。而SF酰胺II的特征吸收峰在1 540 cm-1處消失,這歸因于SF和CA分子之間發(fā)生氫鍵相互作用[25-26]。在1 234 cm-1出現(xiàn)SF酰胺III的特征吸收峰,表明支架中含有少量SF的成分。SF/CA復(fù)合支架在1 416 cm-1, 1 036 cm-1為CA的特征吸收峰。說明三種SF/CA復(fù)合支架既含有SF成分,又含有CA成分,并且SF的構(gòu)象并沒有發(fā)生變化。
對(duì)于應(yīng)用于組織工程的支架而言,必須具有良好的三維多孔結(jié)構(gòu)以滿足細(xì)胞的生長(zhǎng)等性能,為了研究新型支架“鋼筋混凝土”結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)支架結(jié)構(gòu)的區(qū)別,我們對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,見圖2。圖2(a)、圖2(b)、圖2(c)從左至右分別為支架SF/CA 1、SF/CA 2、SF/CA 3的數(shù)碼圖、熒光圖、低倍SEM圖、高倍SEM圖。
圖2 SF/CA支架的形貌圖
首先對(duì)支架SF/CA1的形貌進(jìn)行分析,數(shù)碼圖顯示該支架表明粗糙,不平整,存在一圈圈的波紋;從熒光圖可看出絲素蛋白在支架中具有一圈圈波紋的分布,中間相互連接,有間隙;由SEM圖可知支架表面存在一圈圈波紋,波紋之間粗糙,不存在孔隙,波紋粗糙,不規(guī)則。
其次對(duì)支架SF/CA2的形貌進(jìn)行分析,數(shù)碼圖顯示該支架表面粗糙,平整,存在有規(guī)律的孔隙。從熒光圖可看出絲素蛋白在支架中分布較均勻,支架呈多孔結(jié)構(gòu)。由SEM圖可知,孔主要為長(zhǎng)圓形和圓形,孔徑大小不一,孔隙較密,孔隙在100~200 μm,孔壁光滑。
最后對(duì)支架SF/CA3的形貌進(jìn)行分析,數(shù)碼圖顯示該支架表面粗糙,不平整,存在無規(guī)則的孔隙,支架松散,不是一個(gè)完整的圓柱形支架。從熒光圖可看出絲素蛋白在支架內(nèi)部分布不均勻。由SEM圖可知,支架表面粗糙,存在不規(guī)則孔隙,孔不規(guī)則,孔壁光滑。
高孔隙率的材料能夠提供足夠的空間并吸收足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),從而有利于體內(nèi)物質(zhì)的交換。支架SF/CA1是通過Ca2+在SA溶液中離遷移帶動(dòng)絲素蛋白分散所制備的支架,具有一種特殊的“鋼筋混凝土”結(jié)構(gòu),有較高的孔隙率。其多孔結(jié)構(gòu)和高孔隙率能夠使其具有高吸水性、高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滲透能力,有利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)。而支架SF/CA2內(nèi)部結(jié)構(gòu)均一,孔隙較小介于100~200 μm。支架SF/CA3在制備過程中,CaCl2的加入,使得SF/SA溶液立即發(fā)生交聯(lián),不存在Ca2+緩慢釋放的過程,導(dǎo)致所制備的支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)不均勻,本研究所測(cè)該支架這一部位的孔隙較小。支架孔隙率見圖3。
圖3 SF/CA支架的孔隙率
吸水率是組織工程支架材料的重要評(píng)價(jià)因素之一。由圖4可知,用PBS緩沖液浸泡支架SF/CA2和SF/CA3,30 min后,吸水率無變化。而支架SF/CA1隨著時(shí)間的增加,吸水率逐漸增加,在6 h時(shí)支架吸水能力達(dá)到飽和。3種支架的吸水率均高于90%,這與絲素蛋白含有大量羧基、羥基、氨基和海藻酸鈣中含有大量羧基、羥基這些親水基團(tuán)有關(guān)。
圖4 SF/CA支架的吸水率
此外,支架SF/CA2和SF/CA3的吸水率均高于支架SF/CA1,這歸因于支架SF/CA1特殊的“鋼筋混凝土”結(jié)構(gòu)。
由圖5可知,支架SF/CA2隨著壓縮程度的增加,應(yīng)力逐漸增加;支架SF/CA1隨著壓縮程度的增加,應(yīng)力逐漸增加,當(dāng)壓縮達(dá)到30%時(shí),應(yīng)力顯著提高。支架SF/CA2與支架SF/CA1的抗壓強(qiáng)度分別為(11.10±2.61) KPa與(72.68±6.73) KPa;楊氏模量分別為(22.20±5.22)KPa與(145.36±13.46) KPa。表明通過離子遷移方式制備的具有“鋼筋混凝土”結(jié)構(gòu)的SF/CA支架相比于傳統(tǒng)機(jī)械共混所制備的支架具有更好的力學(xué)性能。絲素蛋白通過Ca2+遷移,進(jìn)行定向排列,最后支架表面呈現(xiàn)波紋狀。在壓縮過程中,這些定向排列的絲素蛋白起著“鋼筋”的作用,以抵抗壓縮形變,故呈現(xiàn)出更高的抗壓強(qiáng)度和楊氏模量。
圖5 SF/CA支架的力學(xué)性能
為了定量測(cè)定三種絲素蛋白/海藻酸鈣(SF/CA)支架對(duì)細(xì)胞的毒性影響,我們將MC3T3細(xì)胞接種到支架的浸提液中進(jìn)行了MTT測(cè)試,見圖6。海
圖6 MTT法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖情況
藻酸鈉是一種天然的聚陰離子聚合,帶有大量負(fù)電荷。MC3T3-E1細(xì)胞是小鼠胚胎成骨細(xì)胞,其細(xì)胞膜因其磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)而帶負(fù)電荷,與海藻酸鈉發(fā)生排斥反應(yīng),故而不能促進(jìn)細(xì)胞增殖。但支架的浸提液中細(xì)胞都隨著時(shí)間的增加表現(xiàn)出增殖情況,表明支架無細(xì)胞毒性。
本研究以SF和SA為原料,區(qū)別于傳統(tǒng)機(jī)械共混SF和SA溶液的方式,通過離子遷移的方式制備了一種新型絲素蛋白/海藻酸鈣支架。通過FT-IR表征支架的結(jié)構(gòu),表明所制備的復(fù)合支架含有SF和CA成分。通過形貌分析支架的表面形貌,證明了該支架具有“鋼筋混凝土”結(jié)構(gòu)。支架的吸水率和孔隙率表明其具有較高的吸水率和孔隙率,適合細(xì)胞生長(zhǎng)。力學(xué)性能實(shí)驗(yàn)表明該新型支架具有更優(yōu)越的力學(xué)性能。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞能在支架上黏附、生長(zhǎng)、增殖。該支架在骨組織工程中具有良好的應(yīng)用前景。