HPLC 測(cè)定枳實(shí)薤白桂枝湯顆粒中辛弗林的含量

羅 平 范茜茜

（1.武漢市江夏區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430200；2.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院武漢市第六醫(yī)院中藥劑科，湖北 武漢 430015）

《金匱要略》中有記載：“胸痹心中痞，留氣結(jié)在胸，胸滿，脅下逆搶心，枳實(shí)薤白桂枝湯主之”[1]。方劑由枳實(shí)、薤白、瓜蔞、厚樸、桂枝五味藥材組成，具有通陽(yáng)散結(jié)、祛痰下氣之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)本方具有改善心肌缺血、修復(fù)心肌缺血再灌注損傷、調(diào)節(jié)血脂等作用[2-4]。方中枳實(shí)含有辛弗林、乙酰去甲辛弗林、柚皮苷、橙皮苷、N-甲基酪胺和γ 氨基丁酸等多種活性成分，能增強(qiáng)胃腸道及心血管平滑肌的收縮力[5]。鑒于顆粒劑較湯劑有服用方便、穩(wěn)定、口感好等優(yōu)點(diǎn)，且根據(jù)本方出膏率的情況，顆粒劑可最大程度保留藥物成分，因此選擇制成顆粒劑[6]。查閱文獻(xiàn)，目前對(duì)于枳實(shí)薤白桂枝湯顆粒劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究較少，多數(shù)對(duì)其質(zhì)量控制方面主要是對(duì)處方中有效成分厚樸酚、和厚樸酚、柚皮苷等建立含量測(cè)定項(xiàng)目[7，8]，未見對(duì)辛弗林的含量測(cè)定的報(bào)道。筆者通過(guò)建立方法學(xué)考察，對(duì)本方顆粒劑辛弗林含量測(cè)定分析方法進(jìn)行評(píng)估，為進(jìn)一步完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器DIONEX P680 高效液相色譜儀、VWD 檢測(cè)器及Chromeleon 色譜工作站。Agela Technologies Promosil C18色譜柱（5 μm，100 A，4.6×250 mm），賽多利斯BP211D 電子分析天平（德國(guó)賽多利斯股份公司），SK2200H 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），SZ-93 型自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司），HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司），HC·TP11B·10 架盤藥物天平（北京醫(yī)用天平廠），DZF-6050 真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試劑與試藥辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品（110727-200306，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品檢定所）；甲醇（Tedia As1122-001色譜醇），磷酸二氫鉀（上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司批號(hào)20180323）；十二烷基磺酸鈉（上海英鵬化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、冰醋酸均為分析純，蒸餾水為雙蒸水。枳實(shí)薤白桂枝顆粒（自制，批號(hào)20190507、20190516、20190530），枳實(shí)薤白桂枝顆粒陰性對(duì)照系按相同工藝制備的缺少相應(yīng)藥味的顆粒劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件以甲醇-磷酸二氫鉀溶液（0.6g磷酸二氫鉀，1.0g十二烷基磺酸鈉，1mL冰醋酸加水定容至1000mL）50∶50為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)275nm；流速0.84mL·min-1；柱溫34℃；進(jìn)樣量10 μL；Agela Technologies Promosil C18色譜柱（5 μm，100 A，4.6×250 mm）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取辛弗林對(duì)照品1.54 mg，加70%甲醇定容至10 mL，搖勻，備用。既得（154 μg·mL-1）對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取本品顆粒約10 g，研細(xì)，取5 g 細(xì)粉，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，精密量取50 mL 50%甲醇溶液，蓋緊瓶塞，稱定重量，超聲提取30 min 后，靜置放冷，擦干外壁，稱定重量，加溶劑補(bǔ)足減失重量，抽濾，精密吸取10 mL 續(xù)濾液于蒸發(fā)皿中，恒溫水浴鍋60 ℃下?lián)]干甲醇，再加10 mL 蒸餾水溶解，上聚酰胺柱（60～90 目，2.5 g，內(nèi)徑1.5 cm，干法裝柱），繼續(xù)用蒸餾水洗脫，收集洗脫液定容至25 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，既得。作為測(cè)定辛弗林含量的供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備取陰性對(duì)照制劑，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 陰性干擾試驗(yàn)分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜，見圖1。結(jié)果可見，辛弗林色譜峰位置未見其他干擾峰出現(xiàn)。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察精密吸取上述已知濃度的對(duì)照 品溶液（154 μg·mL-1）0.5、0.75、1.5、5mL置于10mL的容量瓶中，用溶劑定容至刻度線，加上母液共制成5 個(gè)濃度對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量均為10 μL。以樣品濃度（μ g·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得線性方程為y=0.0953x-0.1098，r=0.9997。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，辛弗林在7.7～154.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液（23.10 μg·mL-1），進(jìn)樣量均為10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別記錄峰面積，RSD 為1.21%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察取本品同一供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h 后進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。進(jìn)樣量均為10 μL，測(cè)定峰面積，RSD 為1.25%（n＝6），表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)取本品（批號(hào)20190530）6 份，按2.2.2項(xiàng)下方法制樣，進(jìn)樣量均為10 μL 測(cè)定其辛弗林含量。結(jié)果，平均含量為0.3872 mg·g-1，RSD=0.99%，小于2%（n=6），表明本品含量測(cè)定方法重現(xiàn)性較好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn)精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)20190530，辛弗林含量為0.3872 mg·g-1）9 份，每份2.5 g，每份樣品中按低、中、高3 種不同濃度精密加入辛弗林對(duì)照品（0.4791 mg·mL-1）1、2、3 mL，編號(hào)，按方法“2.2.2”制備供試品溶液，計(jì)算樣品含量及加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 耐用性試驗(yàn)為考察該方法的耐用性，我們分別控制樣流動(dòng)相配比、檢測(cè)波長(zhǎng)、溫度、流速以及乙酸含量等因素在小范圍內(nèi)波動(dòng)，以同一品進(jìn)行含量測(cè)定，以每次實(shí)驗(yàn)測(cè)得的辛弗林含量的RSD值為指標(biāo)進(jìn)行考察，結(jié)果及其分析表見表2、表3。由試驗(yàn)結(jié)果可知，流速、柱溫、pH值、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相配比范圍上調(diào)和下調(diào)時(shí)的變化對(duì)本品含量測(cè)定的影響結(jié)果RSD值均小于2%，符合要求，該方法耐用性良好。

表2 辛弗林耐用性考察結(jié)果

表3 辛弗林耐用性考察結(jié)果分析

2.4 樣品含量測(cè)定按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理樣品，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定3 批次樣品中辛弗林的含量（每批次3 次）。結(jié)果3 批樣品中辛弗林平均含量分別為0.39、0.38、0.39 mg·g-1。若允許其含量為最低含量下浮的幅度不超過(guò)20%，則含量限度暫定為：本品含辛弗林不得低于0.31 mg·g-1。

3 結(jié)果

在上述色譜條件下，辛弗林在7.7～154.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好r=0.9997；儀器精密度良好RSD＜2%；重現(xiàn)性RSD=0.99%；穩(wěn)定性RSD＜2%；平均回收率為95.21%，RSD 為2.26%；當(dāng)流動(dòng)相配比、檢測(cè)波長(zhǎng)、溫度、流速以及乙酸含量等因素在小范圍內(nèi)波動(dòng)時(shí)，以同一樣品進(jìn)行含量測(cè)定，每次實(shí)驗(yàn)測(cè)得的辛弗林含量的RSD＜2%，表明此方法耐用性良好。

4 討論

4.1 供試品溶液的制備結(jié)合文獻(xiàn)，對(duì)辛弗林含量的測(cè)定普遍參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版一部中枳實(shí)[含量測(cè)定]項(xiàng)下的制備方法進(jìn)行供試品溶液的制備[9-11]，結(jié)果表明此方法結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，方法可行。但對(duì)樣品的處理步驟相對(duì)較復(fù)雜，后續(xù)可以針對(duì)簡(jiǎn)化樣品處理方法進(jìn)行研究[12]，提高效率。

結(jié)合文獻(xiàn)參考選擇用甲醇、50%甲醇、水作為辛弗林提取溶劑[13]，以峰的分離情況和樣品中辛弗林轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)做平行對(duì)照試驗(yàn)，選擇提取溶劑。結(jié)果顯示辛弗林轉(zhuǎn)移率分別為甲醇39.88%、甲醇（50%）63.42%、水52.9%。因此選擇50%甲醇為提取溶劑。

4.2 研究?jī)r(jià)值筆者采用HPLC 法測(cè)定顆粒劑中辛弗林含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果表明此法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性及耐用性良好?？蔀樵撝苿┵|(zhì)量控制提供一定借鑒，同時(shí)也可為其他中成藥制劑中枳實(shí)的質(zhì)量控制提供參考。