采用立方體取樣法提高小麥根系研究精準(zhǔn)性的探討

楊一晨，楊習(xí)文，吳 寅，黃 源，徐利利，付錦州，郭芳芳，周蘇玫，賀德先

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心/省部共建小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002）

作物根系形態(tài)研究的難點(diǎn)在于如何對(duì)大田作物的根系進(jìn)行有代表性的取樣[1]，且根系研究的準(zhǔn)確性與根系樣品的代表性密切相關(guān)[2]。根系取樣方法顯著影響根系研究質(zhì)量，使用不同的取樣方法獲取的根系樣品，對(duì)大田真實(shí)情況的反映程度不盡一致。使用不同的取樣方法造成根系形態(tài)和生理生化指標(biāo)的測(cè)定值差異較大，從而難以準(zhǔn)確描述根系實(shí)際的生長(zhǎng)發(fā)育和生理狀況，使同類研究結(jié)果或同一指標(biāo)之間差異較大，缺乏可比性[3]。因此，規(guī)范根系取樣方法具有重要的理論與實(shí)踐意義。近幾十年來(lái)，隨著科技發(fā)展，作物根系研究手段取得較大進(jìn)展[4‐6]。目前，國(guó)內(nèi)外采用的作物大田根系研究方法種類繁多[7‐10]，根據(jù)研究目的可分為離體取樣法和原位觀測(cè)法。作物根系原位觀測(cè)法，如微根管法、多層螺旋CT 成像法、核磁共振成像法等[11‐17]，雖然具有無(wú)損傷、非破壞性觀測(cè)根系的優(yōu)點(diǎn)，但其無(wú)法直接獲取根系樣品進(jìn)行離體測(cè)定，亦不能通過(guò)根系實(shí)體研究其性質(zhì)；相較于根系原位觀測(cè)法，離體根系取樣法更有助于開展小麥根系形態(tài)與生理方面的研究，直接獲取的根系樣本可用于測(cè)定根的長(zhǎng)度、體積、形狀、顏色、分布狀態(tài)，也可測(cè)定生理生化指標(biāo)和空間分布指標(biāo)。目前，在作物大田試驗(yàn)研究中，根系的獲取仍以從土壤中分離的方法為主，其中應(yīng)用較廣泛的有挖掘法[9]、土鉆法[1,18]、剖面法[19]等。土鉆法在研究不同土層根系特性時(shí)具有優(yōu)越性，但樣品量小，代表性仍存在爭(zhēng)議；挖掘法由于采用工具、方法以及取樣位點(diǎn)不一，誤差較大；而剖面法取樣面單一、代表性差，而且操作過(guò)于費(fèi)時(shí)費(fèi)力，收集樣品時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。目前，在小麥根系研究中，對(duì)不同取樣方法根系測(cè)定值之間的比較鮮有報(bào)道。為準(zhǔn)確了解小麥根系在實(shí)際土壤中的生長(zhǎng)發(fā)育和生理狀況，根據(jù)小麥種植狀況，選用取樣土體完整且規(guī)格一致的立方體根系取樣法以及目前根系研究中常用的鉆取法和挖掘法，就小麥全生育期不同土層中根系形態(tài)和根系活性的測(cè)定值進(jìn)行比較研究，著重探討不同取樣法的取樣精度、代表性問(wèn)題，以期使小麥田間根系取樣方法規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，提高根系研究結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，同時(shí)也為作物根系研究方法的改進(jìn)和發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況及試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018—2020 年在河南省鄭州市中牟縣河南省農(nóng)業(yè)高新科技園進(jìn)行。試驗(yàn)田土壤為潮土，0～20、20～40 cm 土層土壤有機(jī)質(zhì)含量分別為11.5～16.7、8.7～10.3 g/kg，全氮含量分別為0.81～0.89、0.75～0.78 g/kg，堿解氮含量分別為48.8～50.6、40.6～45.2 mg/kg，有效磷含量分別為21.2～23.4、19.8～20.5 mg/kg，速效鉀含量分別為101.9～111.3、128.6～135.8 mg/kg（表1）。

表1 試驗(yàn)地養(yǎng)分含量狀況Tab.1 Content of nutrients in the experimental field

供試小麥材料為黃淮平原麥區(qū)種植面積較大且具有代表性的品種：弱春性品種西農(nóng)979（國(guó)審麥2005005）和半冬性品種周麥27（國(guó)審麥2011003）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用裂區(qū)設(shè)計(jì)，主區(qū)為2 個(gè)小麥品種，副區(qū)是3種根系取樣方法，分別是立方體取樣法（Cube sampling method，CSM）、根鉆法（Auger sampling method，CK1）和挖掘法（Digging method with a spade，CK2）。取樣土層分為2 層：0～20 cm 和20～40 cm。小區(qū)面積為18 m2（3 m×6 m），15 行區(qū)，行距20 cm。重復(fù)4 次。分別于2018 年10 月13 日和2019 年10 月15 日適墑播種，基本苗為240 萬(wàn)株/hm2，2019 年5 月30 日和2020 年5 月29 日收獲。采用噴灌設(shè)施進(jìn)行灌溉，其他栽培管理同一般高產(chǎn)田。

1.3 根系取樣方法

CSM：根據(jù)小麥的行距，采用邊長(zhǎng)20 cm 立方體取樣盒取樣，材質(zhì)為合金，下部帶刃不封口。田間取樣時(shí)使用重力錘在代表性的取樣位點(diǎn)（圖1）將取樣盒均勻置入小麥行中，完整取出不同耕層的土壤-根系樣品。

CK1：使用內(nèi)徑為5 cm 的根鉆，每組（重復(fù)）在行切①、行上②、行間③處取樣（圖1），三鉆合一[18]，為1個(gè)土壤-根系樣品。

CK2：選擇代表性樣點(diǎn)，在小麥播種行上，規(guī)劃出20 cm×20 cm×20 cm 的土體體積（圖1），用鐵鍬挖掘出土壤-根系樣品。

圖1 不同取樣方法的根系取樣位點(diǎn)Fig.1 Root sampling sites for different root sampling method

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

分別于2018—2019 年小麥越冬前（Prior to wintering，PW）、返青期（Re‐growing stage，RS）、拔節(jié)期（Jointing stage，JS）、開花期（Anthesis stage，AS）、灌漿期（Grain‐filling stage，GS）、蠟熟期（Late dough stage，LS）取0～40 cm 土層土壤-根系樣品，用于根干質(zhì)量和根系活性分析。分別于2019—2020 年小麥越冬前、開花期、灌漿期、蠟熟期取0～40 cm 土層土壤-根系樣品，用于根系形態(tài)、干質(zhì)量及活性分析。將不同處理的土壤-根系樣品，用清水緩慢浸泡后沖洗干凈（去雜質(zhì)），獲得待測(cè)根系樣品。

1.4.1 根系形態(tài) 用根系掃描儀（Epson Expression 12000XL）掃描根樣，獲得圖像；用WinRHIZO 根系分析系統(tǒng)（Regent Instruments Inc.，Canada）進(jìn)行圖像分析，獲得根長(zhǎng)、根體積、根表面積，計(jì)算單位體積內(nèi)的根長(zhǎng)、根體積和根表面積。

1.4.2 根干質(zhì)量和根干質(zhì)量損失率 將根系樣品置于105 ℃下殺青30 min，80 ℃烘至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，并計(jì)算單位體積內(nèi)的根干質(zhì)量。

根干質(zhì)量損失率=（CSM 根干質(zhì)量-CK1 或CK2根干質(zhì)量）/CSM根干質(zhì)量×100%。

1.4.3 根系活性 選取0.5 g 鮮根混樣，采用改良TTC法[20]測(cè)定根系活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 和SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 2018 作圖，采用SPSS 19.0 進(jìn)行方差分析（Duncan’s 新復(fù)極差法）和Pearson 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取樣方法下小麥根系形態(tài)差異

2.1.1 根長(zhǎng) 由圖2 可知，2019—2020 年，隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，小麥根長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，于蠟熟期達(dá)到最大值。在各生育時(shí)期0～20 cm 土層的小麥根長(zhǎng)明顯長(zhǎng)于20～40 cm 土層。CSM 處理小麥根長(zhǎng)與CK1、CK2 處理在20～40 cm土層的差異大于0～20 cm 土層，在0～20、20～40 cm，CSM 處理小麥根長(zhǎng)分別比CK1 處理平均增加了52.15%、144.00%，比CK2 處理平均增加了11.61%、42.29%。不同生育時(shí)期、不同土層2 個(gè)小麥品種根長(zhǎng)表現(xiàn)為CSM>CK2>CK1。在越冬前、開花期、灌漿期、蠟熟期，CSM 處理根長(zhǎng)比CK1 處理平均增加了0.115、0.199、0.180、0.243 cm/cm3，比CK2處理平均增加了0.013、0.086、0.090、0.088 cm/cm3，CSM 處理與CK1 處理的差值在蠟熟期最大，與CK2處理的差值在灌漿期最大。由此可知，采用立方體取樣法獲取的小麥根系樣品根長(zhǎng)更長(zhǎng)，比較而言，立方體取樣法與其他方法在20～40 cm 土層的差異大于0～20 cm 土層，且在小麥生育后期（灌漿期—蠟熟期）的差異相較其他生育時(shí)期更大。

圖2 不同取樣方法下小麥根長(zhǎng)的變化Fig.2 Change of wheat root length under different sampling methods

2.1.2 根表面積 由圖3 可知，2019—2020 年，隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，小麥根表面積呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，于蠟熟期達(dá)到最大值。不同生育時(shí)期、不同土層2 個(gè)小麥品種根表面積均表現(xiàn)為CSM>CK2>CK1。在0～20 cm 土層，CSM 處理根表面積分別比CK1、CK2 處理平均增加了47.72%、10.39%；在20～40 cm 土層，CSM 處理根表面積分別比CK1、CK2 平均增加了97.96%、44.77%，CSM 處理與CK1、CK2 處理在20～40 cm土層的差異大于0～20 cm土層。在越冬前、開花期、灌漿期、蠟熟期，CSM 處理根表面積比CK1 處理平均增加了0.009 3、0.020 8、0.020 3、0.023 5 cm2/cm3，比CK2 處理平均增加了0.002 3、0.007 6、0.010 1、0.008 1 cm2/cm3，CSM 處理與CK1處理的差值在蠟熟期最大，與CK2 處理的差值在灌漿期最大。由此可知，在小麥根表面積研究中，立方體取樣法最優(yōu)，挖掘法次之，根鉆法最差，立方體取樣法與其他方法在生育前期（越冬前）的差異較小，生育后期（灌漿—蠟熟期）差異較大，此外，在20～40 cm 土層的差異相較0～20 cm 土層更大。

圖3 不同取樣方法下小麥根表面積的變化Fig.3 Dynamic change of wheat root surface area under different sampling methods

2.1.3 根體積 由圖4 可知，2019—2020 年，隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，小麥根體積呈現(xiàn)逐漸增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)?？傮w上，不同生育時(shí)期、不同土層2個(gè)小麥品種根體積均表現(xiàn)為CSM>CK2>CK1。在0～20、20～40 cm 土層，CSM 處理根體積分別比CK1 處理平均增加了50.07%、90.70%，分別比CK2 處理平均增加了11.55%、29.50%，CSM 處理與CK1、CK2 處理在20～40 cm土層的差異大于0～20 cm土層。在越冬前、開花期、灌漿期、蠟熟期，CSM 處理根體積分別比CK1 處理平均增加了67.02、186.35、168.37、292.04 cm3/m3，比CK2處理平均增加了18.34、95.80、91.60、11.89 cm3/m3，CSM 處理與CK1 處理的差值在蠟熟期最大，與CK2 處理的差值在灌漿期和蠟熟期較大。由此可見，在大田根體積的研究中，使用立方體取樣法相較于其他取樣方法根體積損失更小，能獲得更大的測(cè)量值，在20～40 cm 土層立方體取樣法與另外2 種方法根體積的差異大于0～20 cm，另外，在生育后期（灌漿—蠟熟期）的差異較生育前期增大。

圖4 不同取樣方法下小麥根體積的變化Fig.4 Dynamic change of wheat root volume under different sampling methods

2.2 不同取樣方法下小麥根干質(zhì)量差異

由圖5 和表2 可知，隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，小麥根干質(zhì)量逐漸升高后趨于穩(wěn)定。相較于CSM 處理，CK1 處理根干質(zhì)量損失率為27.5%～62.4%，CK2 處理根干質(zhì)量損失率為8.2%～49.0%。不同年份、不同生育時(shí)期、不同土層2 個(gè)小麥品種根干質(zhì)量總體表現(xiàn)為CSM>CK2>CK1。CK1 與CK2 處理在0～20 cm 土層的根干質(zhì)量損失率低于20～40 cm 土層。2018—2019 年，CK1 處理平均根干質(zhì)量損失率為49.3%（0～20 cm）、51.7%（20～40 cm），CK2 處理為19.9%（0～20 cm）、33.4%（20～40 cm）；2019—2020年，CK1 處理平均根干質(zhì)量損失率為38.5%（0～20 cm）、53.3%（20～40 cm），CK2 處理為11.2%（0～20 cm）、23.0%（20～40 cm）。在2018—2020 年，0～20 cm 土層，CSM 處理根干質(zhì)量在生育前期（越冬前、返青期）與CK2 處理的差異未達(dá)到顯著水平，在生育后期（灌漿期后）與CK1 處理的差異達(dá)到顯著水平；20～40 cm 土層，CSM 處理根干質(zhì)量在灌漿期與CK1 處理的差異達(dá)到顯著水平。由此可見，在小麥大田根干質(zhì)量的研究中，采用立方體取樣法獲取的根樣損失更小，更接近真實(shí)值，挖掘法與立方體取樣法差異較小，根鉆法最差。

表2 CK1和CK2處理較CSM處理的根干質(zhì)量損失率Tab.2 Loss rate of dry weight of wheat root of CK1 and CK2 treatments compared with CSM treatment%

圖5 不同取樣方法下小麥根干質(zhì)量的變化Fig.5 Dynamic change of dry weight of wheat root under different sampling methods

2.3 不同取樣方法下小麥根系活性差異

由圖6可知，隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，小麥根系活性總體呈逐漸降低的趨勢(shì)。不同土層間，0～20 cm土層根系活性高于20～40 cm 土層；不同年份、不同生育時(shí)期、不同土層2 個(gè)小麥品種根系活性均表現(xiàn)為CSM>CK2>CK1。不同生育時(shí)期，CSM 處理根系活性與CK1、CK2 處理相差較大，在越冬前為8.00～73.19 μg/（g·h），在蠟熟期為0.81～11.19 μg/（g·h），生育前期的差異大于生育后期。在不同土層中，不同取樣方法根系活性差異表現(xiàn)為20～40 cm 土層大于0～20 cm 土層。2 a 2 個(gè)小麥品種各生育時(shí)期CSM處理根系活性分別比CK1 處理平均提高了71.49%（0～20 cm）、91.80%（20～40 cm），比CK2 處理平均提高了25.82%（0～20 cm）、36.89%（20～40 cm）。由此可見，大田試驗(yàn)中采用立方體取樣法所獲取的根樣，新鮮度保持效果好，生理活性測(cè)定值高，更接近田間根系的實(shí)際生理狀態(tài)，尤其是在深層取樣時(shí)，立方體取樣法的效果更好，此外在生育后期不同取樣方法根系活性測(cè)定值差值較小，生育前期差值則較大。

圖6 不同取樣方法下小麥根系活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Dynamic change of wheat root vigor under different sampling methods

2.4 不同取樣方法下小麥根系性狀的相關(guān)性

鑒于不同取樣方法在根系性狀測(cè)定值上的差異，為了進(jìn)一步了解CSM 法測(cè)定值與其他方法測(cè)定值之間的關(guān)系，采用Pearson相關(guān)系數(shù)和回歸方程進(jìn)行相關(guān)性和回歸分析。由表3 可知，不同取樣方法的根系性狀測(cè)定值之間均呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)介于0.955～0.989。就根系活性、根干質(zhì)量和根系形態(tài)的測(cè)定值而言，CSM與CK1、CK2均呈冪函數(shù)的回歸關(guān)系，回歸方程分別是y=1.523 8x1.0080（CSM ＆ CK1，0～20 cm）,y= 2.068 5x0.9947（CSM ＆CK1，20～40 cm），y=1.114 4x1.0017（CSM＆CK2，0～20 cm），y=1.379 9x0.9935（CSM ＆ CK2，20～40 cm）。CSM 與CK1、CK2 的回歸方程P值均小于0.01（R2介于0.994 1～0.999 3）。由此可知，回歸方程的建立可在不同土層分析CSM 與其他方法的關(guān)系，通過(guò)CK1、CK2 的根系性狀測(cè)定值可估算CSM 的根系性狀測(cè)定值。因此，在大田根特性研究中，可使用回歸方程對(duì)根鉆法和挖掘法的植株性狀測(cè)定值進(jìn)行矯正，從而得到更準(zhǔn)確、代表性更好的研究結(jié)果。

表3 不同取樣方法下小麥根系性狀相關(guān)系數(shù)Tab.3 Correlation coefficient between root traits under different sampling methods

3 結(jié)論與討論

3.1 根系取樣方法對(duì)小麥根系研究的代表性和精準(zhǔn)性的影響

作物根干質(zhì)量和根系形態(tài)的分布體現(xiàn)了作物生物量的分配策略[1，21]，是衡量與反映其生長(zhǎng)情況的重要性狀。本研究結(jié)果表明，采用立方體取樣法獲取的根系樣品根干質(zhì)量和根系形態(tài)測(cè)定值較挖掘法和根鉆法高，且根樣損失更小，更接近真實(shí)值，挖掘法與立方體取樣法差異較小，根鉆法代表性最差，在0～20、20～40 cm 土層以及不同品種的不同生育時(shí)期均有體現(xiàn)。前人研究表明，挖掘法測(cè)定的土層根量占總根量的比例規(guī)律性較差，以土層根量估計(jì)小麥總根量的方法可能存在較大的系統(tǒng)誤差；根鉆法測(cè)定的結(jié)果無(wú)論從根系可檢出程度還是從估計(jì)總根量的角度講，均較挖掘法優(yōu)[18]。本研究采用根鉆法雖能獲取一定體積的土壤根系樣品，但體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其他2種方法，因其獲取的根量小，在根系沖洗過(guò)程中損失的根量相對(duì)就多，在試驗(yàn)過(guò)程中的誤差更大，導(dǎo)致其根干質(zhì)量和根系形態(tài)指標(biāo)值小于其他2種取樣方法，此外，根鉆法的取樣點(diǎn)不能均勻代表小麥根系分布狀況是造成測(cè)定值小的另一原因。

小麥根系生理活性可反映根系新陳代謝能力，其與植株性狀、籽粒產(chǎn)量密切相關(guān)[22]。在科學(xué)研究中，常用根系活性來(lái)反映植物的新陳代謝能力和抗性的強(qiáng)弱[23]。本研究結(jié)果表明，不同的根系取樣方法對(duì)根系活性測(cè)定值的影響不同，使用立方體取樣法獲取的根系樣品根系活性測(cè)定值較挖掘法和根鉆法更高。前人研究表明，不同部位根系活力差異明顯[6]。本試驗(yàn)麥壟之間行距為20 cm，根鉆法獲取的土壤樣品根量較少，鉆頭內(nèi)徑?。? cm）導(dǎo)致根系樣品斷根多；挖掘法獲取根系樣品時(shí)需多次挖掘，對(duì)根系損傷大，且取樣量不夠嚴(yán)格一致；立方體取樣法獲取的土壤根系樣品（取樣盒邊長(zhǎng)為20 cm）相較于上述2 種方法更完整更具有代表性，這是造成立方體取樣法的根系活性測(cè)定值更高的原因。

3.2 立方體取樣法在小麥根系研究中的優(yōu)越性

采用合適的取樣方法對(duì)大田作物的根系進(jìn)行有代表性的取樣并對(duì)其進(jìn)行估計(jì)是了解作物生產(chǎn)力的基礎(chǔ)[7，24]。根鉆法和挖掘法都是用于作物根特性研究的常用根系取樣方法。前人研究表明，根鉆法雖分析不同土層根系特性時(shí)具有優(yōu)越性，但其對(duì)于根系密度較小的作物往往會(huì)由于鉆頭直徑太小而導(dǎo)致誤差過(guò)大，同時(shí)由于它獲取的樣本量少不適用于根形態(tài)學(xué)方面的研究[1，21]。根鉆法在獲取根系樣品時(shí)，水平方向選擇不同的取樣點(diǎn)，會(huì)對(duì)根系的估算產(chǎn)生一定的影響[1]。本研究雖采用三鉆合一的方法獲取樣品，但取樣量和取樣代表性仍低于立方體取樣法，且選擇取樣點(diǎn)時(shí)人為誤差較大，精確性易受操作影響。挖掘法省時(shí)省工、工具簡(jiǎn)單、成本低，但在挖掘過(guò)程中土壤易散，取樣困難，往往需要多次挖掘才能夠獲取所需的根系樣品，對(duì)根系損傷大，難以獲取一定體積的完整土樣，不如立方體取樣法獲得的樣品量精確，導(dǎo)致研究結(jié)果的精準(zhǔn)度較低。立方體取樣法的優(yōu)點(diǎn)如下：1）準(zhǔn)確性，立方體取樣法獲取的土體樣品體積精確度高，可減小試驗(yàn)誤差；2）代表性，立方體取樣法根據(jù)小麥行距設(shè)置邊長(zhǎng)為20 cm 的取樣盒，保證了取樣土體和取樣量的代表性；3）完整性，相較根鉆法和挖掘法，立方體取樣法獲取的土樣保持了小麥根系的原狀，對(duì)根系損傷更小，斷根更少；4）一致性，相較于根鉆法和挖掘法，立方體取樣法的具體取樣位置和取樣土層嚴(yán)格規(guī)范且保持一致，人為誤差小，不易受操作的影響。綜合以上因素，立方體取樣法既保證了樣品量的一致性和準(zhǔn)確性，同時(shí)也保證了根系樣品的完整性和代表性，極大地減小了田間取樣的試驗(yàn)誤差，從而使得其在根系活性、根干質(zhì)量以及根系形態(tài)的研究中體現(xiàn)出較大的優(yōu)越性。

本研究根系樣品采用根系掃描儀和WinRHIZO根系分析系統(tǒng)（Regent Instruments Inc.，Canada）進(jìn)行測(cè)定，相較于傳統(tǒng)方法，提高了研究結(jié)果的精準(zhǔn)性，更具有說(shuō)服力。通過(guò)立方體取樣法與其他方法的對(duì)比分析，使得研究者更加了解和關(guān)注由于取樣方法造成同一研究結(jié)果差別大的問(wèn)題，同時(shí)意識(shí)到根系取樣方法規(guī)范化與標(biāo)準(zhǔn)化的重要性。