黃芩抗前列腺癌作用的網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

龍恭偉 葉天潤 張宇聰 李恒

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性中最常見的腫瘤之一[1]，2020年新發(fā)病例數(shù)已躍居美國男性腫瘤第一位[2]。對于局限性PCa，根治性前列腺切除或根治性放療可有效消除腫瘤[3]。對于晚期PCa，根治性的局部治療已不再可行，雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy, ADT)是推薦的治療方式[4]。雖然ADT可以有效延長PCa患者的無進展生存期，但部分患者還是會進展為去勢抵抗型PCa(castration-resistance PCa, CRPC)，對于這些患者，ADT無法提供滿意的腫瘤控制效果，尚需要更多有效的抗腫瘤藥物治療。中醫(yī)藥作為輔助治療手段，毒副作用較小且在提高PCa患者生活質(zhì)量、減輕臨床癥狀、延長生存期等方面顯示出一定的優(yōu)勢[5-6]。

黃芩是一味傳統(tǒng)的中藥，是中藥復方PC-SPES(prostate caner-SPES, SPES在拉丁語中為希望之意)的重要組分[7-8]。PC-SPES已被證實對CRPC有效[9-10]。作為PC-SPES的重要成分，黃芩對多種癌細胞表現(xiàn)出抗癌活性[11]。然而，其潛在的抗腫瘤作用機制還不明確。中醫(yī)藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點。而網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于藥材、成分、靶點、疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)方法[12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學整合多種信息來源，采用生物信息學、網(wǎng)絡(luò)分析等計算方法，進而分析藥物作用靶點及可能的機制。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對黃芩治療PCa的潛在機制及靶點進行了探索性分析，現(xiàn)報告如下。

對象與方法

一、網(wǎng)絡(luò)藥理學分析流程

本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法來探尋黃芩治療PCa的潛在機制及靶點，具體分析流程如圖1所示。該分析過程主要包括黃芩活性成分的篩選及作用靶點的識別、PCa靶點的篩選、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)分析、多重網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及富集分析。

圖1 分析流程圖

二、黃芩活性成分的篩選和作用靶點的識別

黃芩的成分來自中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology, TCMSP)。以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和藥物相似度(drug-likeness, DL)≥0.18對黃芩的有效成分進行篩選。將篩選出的有效成分導入PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，從而得到化合物的三維分子結(jié)構(gòu)。使用SwissTagetPrediction(https://swisstargetprediction.ch)來識別潛在的靶點。沒有三維分子結(jié)構(gòu)信息的化合物被排除，每個化合物匹配度排名前30的靶點被列為作用靶點。

三、PCa靶點的篩選

PCa相關(guān)的靶點基因篩選自 DisGeNet(https://www.disgenet.org)、Genecards(https://www. genecards.org)和OMIM(https:// www.omim.org)數(shù)據(jù)庫。以“stage, prostate cancer”為關(guān)鍵詞從DisGeNet獲得57個靶點。在Genecards中以“prostate cancer”為關(guān)鍵詞搜索，以“relevance score>30”為條件篩選到468個靶點。在OMIM中以“prostate cancer”為關(guān)鍵詞搜索到169個靶點。去除重復后, 597個PCa相關(guān)基因被納入后續(xù)分析。

四、PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將黃芩和PCa的共同靶點導入STRING 11.0(https://string-db.org/)，進行PPI分析。將物種限定為“Homo sapiens”，相互作用分數(shù)設(shè)定為≥0.7以構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)。

五、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

本研究構(gòu)建了以下網(wǎng)絡(luò)：①通過連接化合物和其相應的作用靶點，構(gòu)建化合物-作用靶點網(wǎng)絡(luò)；②黃芩與PCa共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)；③用PPI分析中篩選的靶點重新構(gòu)建化合物-治療靶點網(wǎng)絡(luò)，以確定發(fā)揮抗PCa作用的主要活性成分。網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化使用Cytoscape 3.8.0軟件完成[13]。其中參與度(Degree)定義為該靶點與其他靶點的連接數(shù)，該指標反映了靶點在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵程度。

六、富集分析

用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)進行基因本體論(Gene Ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。GO分析對分子功能(molecular function, MF)、生物過程(biological process, BP)和細胞組分(cellular component, CC)進行了富集，使用R軟件繪制條形圖。KEGG富集結(jié)果使用R軟件繪制氣泡圖進行可視化。

結(jié) 果

一、化合物及靶點篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索獲得143種黃芩活性成分，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件篩選出36種化合物。其中兩種化合物在PubChem數(shù)據(jù)庫無相關(guān)結(jié)構(gòu)信息。使用SwissTargetPrediction進行靶點預測后，一種化合物沒有預測到靶點。最終確定了33種化合物的210個潛在作用靶點，相關(guān)信息見表1。

表1 黃芩有效成分的藥代動力學特征

33種化合物的210個潛在作用靶點及其912條連接組成了化合物-作用靶點網(wǎng)絡(luò)。210個作用靶點中，133個靶點被2個以上藥物作用，27個靶點被10個以上藥物作用。在這27個基因中，有10個基因也是PCa的靶點，包括KIT、ESR2、CYP19A1、MCL1、TERT、ABCG2、PTGS2、CYP1B1、ABCB1和ESR1。ABCG2(Degree=23)、CYP1B1(Degree=23)和ADORA1(Degree=22)3個化合物被20多個化合物作用，其中ABCG2和CYP1B1也是PCa的靶基因。

二、共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

黃芩和PCa有57個共同靶點，將它們導入STRING進行PPI分析。如圖2所示，該PPI網(wǎng)絡(luò)由49個節(jié)點和157條邊組成。Degree排名前4的靶點包括絲氨酸/蘇氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1, AKT1)(Degree=21)、雄激素受體(androgen receptor, AR)(Degree=16)、Src酪氨酸激酶(tyrosine kinase Src, SRC)(Degree=16)和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)(Degree=16)。

三、化合物-治療靶點網(wǎng)絡(luò)

生成PPI網(wǎng)絡(luò)后，分別選擇前15個靶點和前24個靶點來構(gòu)建化合物-治療靶點網(wǎng)絡(luò)。如圖3、4所示，黃芩素、表小檗堿、木蝴蝶素A和漢黃芩素連接的靶點最多。

注：圓圈代表靶點；線段代表靶點間存在相互作用；圓圈大小及顏色代表靶點參與相互作用的數(shù)量圖2 黃芩與PCa共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

注：Wogonin-漢黃芩素；Oroxylin a-木蝴蝶素A；Epiberberine-表小檗堿；Baicalein-黃芩素圖3 使用PPI網(wǎng)絡(luò)中參與度排名前15個靶點構(gòu)建的化合物-治療靶點網(wǎng)絡(luò)

四、富集分析

我們將共同的57個基因?qū)隓AVID網(wǎng)站進行富集分析。GO分析中，得到P值<0.05的1 081條BP通路，31條CC通路，108條MF通路。KEGG分析中，60條P值<0.05的通路被富集。圖5中展示了GO-BP和KEGG分析的前15條通路。

從GO-BP分析的結(jié)果來看，代謝過程、細胞死亡、細胞凋亡、細胞周期等生物學過程都與黃芩的抗腫瘤機制密切相關(guān)。KEGG富集的結(jié)果表明，大多數(shù)靶基因主要作用在物質(zhì)代謝或信號通路，如圖5所示的癌癥中的通路、癌癥中的蛋白多糖、病灶黏附等途徑。包括PI3K-AKT、Ras相關(guān)蛋白1(Rap1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在內(nèi)的信號通路也與黃芩抗腫瘤效應密切相關(guān)。

A：GO-BP富集分析的前15個結(jié)果；B：KEGG富集分析的前15個結(jié)果圖5 黃芩與PCa共同靶點富集分析

討 論

PCa是男性常見的惡性腫瘤，對ADT的抵抗可導致預后不良。黃芩，作為一種中草藥，其成分在多項研究中發(fā)現(xiàn)具有抗PCa的作用[14-15]。然而，由于中藥的多成分和多靶點特性，其抗PCa作用背后的綜合機制仍難以明確。

本研究中，我們利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法來研究黃芩對PCa的作用機制。經(jīng)過對化合物靶點和PCa相關(guān)靶點的篩選，發(fā)現(xiàn)了57個重疊的靶基因。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，有幾個靶點表現(xiàn)出在抗PCa機制中的核心作用，包括AKT1、AR、SRC和EGFR。AKT1作為AKT蛋白激酶的一種同工酶，是包括PCa和乳腺癌在內(nèi)的許多癌癥的重要因子[16]。此外，AKT1激活突變在CRPC中比較常見，可能是一個有效的治療靶點[17]。AR是PCa發(fā)展的關(guān)鍵因子，降低雄激素的ADT是晚期PCa的一線治療方法[4]。即使發(fā)展至CRPC，AR及其剪接異構(gòu)體如AR-V7仍在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用[18]。SRC是非受體蛋白酪氨酸激酶家族的典型分子，該家族調(diào)節(jié)著細胞周期、腫瘤進展、遷移、增殖、分化和細胞生存等重要生物學過程[19],其激活突變在結(jié)腸癌和PCa在內(nèi)的諸多癌癥的進展中起著關(guān)鍵作用[20-21]。EGFR是一種跨膜受體，其功能失調(diào)與包括PCa在內(nèi)的腫瘤生成過程相關(guān)[22]。EGFR的過表達也被認為促進了PCa的骨轉(zhuǎn)移[23]。

本研究篩選了PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要基因來構(gòu)建化合物-治療靶點網(wǎng)絡(luò)，以確定黃芩的潛在主要活性化合物。如圖3和圖4所示，黃芩素、表小檗堿、木蝴蝶素A和漢黃芩素連接了最多的靶點，表明這些化合物可能是黃芩治療PCa的最關(guān)鍵成分。黃芩素已被證明在多種腫瘤中有抗癌效果，包括肺癌、乳腺癌、肝細胞癌和PCa等[24-25]。值得注意的是，AKT激酶和AR信號轉(zhuǎn)導密切參與了黃芩素抗癌作用的機制，這與本研究的分析一致[24,26]。表小檗堿具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用[27]，其抗腫瘤作用也有報道[28]。木蝴蝶素A在結(jié)直腸癌[29]和食道鱗狀細胞癌中顯示出抗癌作用[30]，且能夠抑制口腔鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移[31]。多項研究表明漢黃芩素能明顯抑制不同腫瘤的發(fā)展[32]，在PCa細胞中也具有抗腫瘤作用[33]。

圖4 使用PPI網(wǎng)絡(luò)中參與度排名前24個靶點構(gòu)建的化合物-治療靶點網(wǎng)絡(luò)

KEGG富集分析揭示了參與黃芩抗癌機制的幾個潛在信號通路，包括PI3K-AKT通路、Rap1信號通路和VEGF信號通路。PI3K-AKT信號通路在PCa中有至關(guān)重要的作用。它不僅參與PCa細胞的凋亡和增殖，而且還促進PCa的進展和對ADT的耐藥[34]。研究顯示，抑制PI3K-AKT通路可以逆轉(zhuǎn)其對ADT的耐藥性，為CRPC患者提供更佳的腫瘤控制效果[35-36]。此外，PI3K-AKT和AR也被報道有交叉調(diào)節(jié)作用，對AR通路的抑制可以導致PI3K-AKT通路的激活[37]，對AR和AKT的多重靶向可能是治療CRPC的可行策略[38]。這些證據(jù)說明AKT1和AR是PCa的重要靶點，也是黃芩抗腫瘤作用的關(guān)鍵靶點。

Rap1是Ras家族小G蛋白的一員，調(diào)節(jié)著參與腫瘤形成的若干信號途徑。研究表明，Rap1的激活增加了PCa細胞的遷移和侵襲，將激活的Rap1引入到PCa細胞中，顯著提高了PCa在異種移植小鼠模型中的轉(zhuǎn)移率[39]。抑制Rap1的活性則可以抑制PCa細胞的黏附和侵襲[40]。

VEGF的過度表達可以誘導血管生成，而血管生成是PCa腫瘤發(fā)生、增殖和進展的重要基礎(chǔ)。一些針對VEGF途徑的藥物已經(jīng)使PCa患者獲益[41]。雄激素也可以提高VEGF的表達，AR和VEGF的相互作用是PCa血管生成的機制之一[42]。值得一提的是，SRC也可以調(diào)節(jié)VEGF的表達并影響血管生成[43]。

本研究中，我們從黃芩中獲得了33種活性成分，并預測了210個潛在的靶點，這表明黃芩是一種由多種成分組成的復雜藥劑，并且可以靶向眾多靶點。網(wǎng)絡(luò)分析顯示，黃芩可能通過調(diào)節(jié)包括AKT1、AR、SRC和EGFR在內(nèi)的多個靶點對PCa發(fā)揮藥理作用。分析還表明，黃芩素、表小檗堿、木蝴蝶素A和漢黃芩素可能是黃芩治療PCa的主要活性成分。GO分析表明，黃芩主要通過影響細胞代謝過程、細胞死亡、細胞凋亡和細胞周期等生物學過程來實現(xiàn)對PCa的治療。KEGG富集表明，包括PI3K-AKT信號通路、Rap1信號通路和VEGF信號通路在內(nèi)的信號通路可能與黃芩的抗PCa機制有關(guān)。在下一步研究中，還需要進行更多的實驗來驗證本研究的發(fā)現(xiàn)。