某病毒標本熱滅活處理對血清學檢驗項目結(jié)果的影響*

陳文華，毋崇嶺，鄭 榮，張 玲，高 黝，何寶明

陜西省漢中市中心醫(yī)院：1.檢驗科；2.脊柱外科，陜西漢中 723000

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)傳染力強,人群普遍易感,新型冠狀病毒肺炎(COVID-19) 是由SARS-CoV-2感染引起的一種肺部感染性疾病，目前，該病尚無針對特異性治療藥物。國家衛(wèi)生健康委員會將COVID-19納入乙類傳染病,并按甲類傳染病進行預防和控制[1]。由于COVID-19患者血液、體液標本具有潛在傳染性,實驗室檢測人員存在職業(yè)暴露可能,給實驗室檢測人員帶來極大的心理壓力和較高的院感防控風險[2]。有研究指出SARS-CoV-2在56 ℃ 30 min處理可被滅活,但標本滅活后哪些項目不受影響，哪些項目可以參考使用，哪些項目堅決不可以滅活尚不清楚[3-4]。為此，本研究通過對同一患者的兩份標本作56 ℃ 30 min熱滅活與未滅活處理后所檢測結(jié)果進行分析,旨在探討標本經(jīng)56 ℃ 30 min熱滅活處理后，是否對COVID-19診療方案過程中要求的常用監(jiān)測指標檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1-12月在陜西省漢中市中心醫(yī)院采用陜西瀏陽三力醫(yī)用科技有限公司的負壓真空采血管(黃帽管)采集的SARS-CoV-2篩查標本95例(每例標本均雙管采集，3.0 mL)，標本來源于門診、感染科、腫瘤科、內(nèi)風濕科等科室。其中男68例，女37例,年齡22～70歲。排除感染性、凝血障礙性等疾病志愿者。

1.2儀器與試劑 日立7180全自動生化分析儀(簡稱日立7180)及廠家配套試劑盒,質(zhì)控品(病理水平和正常水平)為美國伯樂公司生產(chǎn)；德國羅氏有限公司電化學發(fā)光設(shè)備(簡稱Cobas e801)及廠家配套試劑、質(zhì)控品(陰性和弱陽性質(zhì)控)。歐蒙公司試劑盒，奧林巴斯熒光顯微鏡；重慶博奧賽斯科技生物有限公司磁微粒化學發(fā)光法檢測設(shè)備(簡稱Axceed 260)及廠家配套試劑、質(zhì)控品(陰性和陽性)；脫帽離心機型號LXJ-IIC(上海安亭科學儀器廠)、恒溫水浴箱型號HH-S6(山東博科科學儀器有限公司)。

1.3標本處理 收集95例雙管臨床標本，將每例標本中的一管室溫放置30 min，作不滅活處理(未滅活組)；另一管置于HH-S6恒溫(56 ℃)水浴箱作熱滅活處理30 min(滅活組)。兩管標本同時進行1 500×g離心10 min,收集上清液，待測。

1.4檢測方法

1.4.1常規(guī)生化項目檢測 在日立7180上同時對兩組標本進行丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、尿素(Urea)、肌酐(Crea)、二氧化碳總量(TCO2)、鈣(Ca)、氯(Cl)、膽固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白T(cTnT)、葡萄糖(Glu)和超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)共15個常規(guī)生化項目檢測。

1.4.2發(fā)光項目檢測 在Cobas e801上采用電化學發(fā)光法同時對兩組標本進行傳染病指標[乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗體(HCV-Ab)和艾滋病病毒抗體(HIV-Ab)]、腫瘤標志物[甲胎蛋白(AFP)和細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)]、炎癥因子指標[降鈣素原(PCT)和白細胞介素-6(IL-6)]和甲狀腺激素[促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)]共10個發(fā)光項目檢測，檢測結(jié)果以定量形式報告。

1.4.3自身抗體檢測 采用間接熒光免疫法以手工加樣方式同時對兩組標本進行抗核抗體(ANA)和抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)檢測，在奧林巴斯熒光顯微鏡下判讀其核型和滴度的結(jié)果。

1.4.4SARS-CoV-2抗體檢測 在Axceed 260上采用磁微?；瘜W發(fā)光法同時對兩組標本進行SARS-CoV-2的IgM和IgG抗體檢測，結(jié)果以S/CO=標本發(fā)光值/cut-off表示。標本結(jié)果S/CO<1.0判為陰性；結(jié)果S/CO≥1.0判為陽性。以上項目檢測前，其室內(nèi)質(zhì)控均在控。檢測過程嚴格按照相關(guān)專業(yè)組的標準操作規(guī)程執(zhí)行，由具有豐富經(jīng)驗并考核過關(guān)的人員負責操作。

2 結(jié) 果

2.1滅活組和未滅活組常規(guī)生化項目檢測結(jié)果比較 滅活組檢測ALT、ALP、TCO2、CK和CK-MB結(jié)果低于未滅活組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。滅活組檢測TP、Urea、Crea、Ca、Cl、CHOL、TG、cTnT、Glu和hs-CRP結(jié)果與未滅活組檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組常規(guī)生化項目檢測結(jié)果比較

組別nTCO2(mmol/L)Ca(mmol/L)Cl(mmol/L)CHOL(mmol/L)TG(mmol/L)未滅活組9524.57±1.392.18±0.2399.00±11.574.80±0.723.03±0.49滅活組9520.99±1.082.19±0.1998.67±10.384.85±0.693.05±0.54t21.3741.2070.6311.5321.338P0.0070.9720.5640.1410.184

組別nCK(U/L)CK-MB(U/L)cTnT(pg/mL)Glu (mmol/L)hs-CRP(mg/L)未滅活組95219.59±38.2426.39±3.1226.11±4.015.44±1.075.32±0.76滅活組9578.22±10.3710.36±1.4825.98±3.595.18±0.985.17±0.82t32.65831.3210.3870.9271.091P<0.001<0.0011.0000.1090.109

2.2滅活組和未滅活組常規(guī)生化項目相關(guān)性分析 ALT、ALP和CK-MB在滅活組和未滅活組間具有相關(guān)性(r值分別0.997、0.976和0.778，P<0.05)，TCO2和CK在滅活組和未滅活組間無相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

表2 滅活組和未滅活組常規(guī)生化項目相關(guān)性分析

2.3滅活組和未滅活組化學發(fā)光法檢測項目的結(jié)果比較 滅活組檢測T3、T4和CYFRA21-1結(jié)果低于未滅活組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。滅活組檢測HBsAg、HCV-Ab、HIV-Ab、AFP、PCT、IL-6和TSH結(jié)果與未滅活組檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組化學發(fā)光法檢測項目的結(jié)果比較

組別nIL-6(pg/mL)TSH(μIU/mL)T3(nmol/L)T4(nmol/L)CYFRA21-1(ng/mL)未滅活組95205.86±77.1412.84±1.021.26±0.4284.78±10.2513.85±1.37滅活組95203.27±79.2512.88±1.391.22±0.3968.02±9.753.02±0.88t0.7051.48523.38721.02516.352P0.6110.0970.0050.0080.012

2.4滅活組和未滅活組自身抗體檢測結(jié)果比較 77例ANA陰性標本和77例ANCA陰性標本，滅活組和未滅活組均呈陰性結(jié)果，一致性為100%。18例ANA陽性標本中，5例核顆粒陽性，6例為核均質(zhì)，3例胞漿顆粒型，2例核點型標本，2例核仁型標本；18例ANCA陽性標本中，11例抗中性粒細胞胞漿抗體核周型(pANCA)，7例抗中性粒細胞胞漿抗體胞漿型(c-ANCA)。滅活組標本熒光核型未發(fā)生改變，熒光強度也未發(fā)生變化。陽性標本在滅活處理后結(jié)果均為陽性，陽性結(jié)果符合率為100%，Kappa值=1>0.75，一致性好。見圖1。

注：A未滅活組核均質(zhì)(1∶1 000);B滅活組核均質(zhì)(1∶1 000);C未滅活組核顆粒(1∶320);D滅活組核顆粒(1∶320);E未滅活組pANCA;F滅活組pANCA。

2.5滅活組和未滅活組SARS-CoV-2抗體檢測結(jié)果比較 滅活組和未滅活組SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。95例患者血標本中,SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測均陽性的有3例，未滅活組血清SARS-CoV-2 IgM抗體檢出2例陽性，47例陰性；SARS-CoV-2 IgG抗體檢出1例陽性，43例陰性。滅活組血清SARS-CoV-2 IgM抗體檢出2例陽性，46例陰性；SARS-CoV-2 IgG抗體檢出1例陽性，43例陰性。滅活組和未滅活組血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測結(jié)果陰陽性符合率為100%。

表4 兩組SARS-CoV-2抗體檢測結(jié)果比較

3 討 論

SARS-CoV-2感染患者的診斷、鑒別診斷及治療過程中要監(jiān)測常規(guī)生化、傳染病、腫瘤標志物、炎癥因子等血清學指標，以及尿液、糞便等體液。如果不作任何處理，就開展相關(guān)血清學指標進行檢測，極易因職業(yè)暴露增加醫(yī)護人員感染風險。除了做好生物安全防護外,在不影響檢測結(jié)果的前提下,若能在檢測前將標本進行熱滅活處理,將極大降低醫(yī)務(wù)人員感染的概率。因此,評估臨床標本經(jīng)熱滅活處理后是否影響COVID-19診療工作開展就顯得極為重要。

常規(guī)生化檢測項目是疾病監(jiān)測的最常規(guī)的基礎(chǔ)指標，是COVID-19診療方案中明確提出的監(jiān)測指標[5-6]。本研究對15項常規(guī)生化指標進行檢測發(fā)現(xiàn)，滅活組TP、Urea、Crea、Ca、Cl、CHOL、TG、cTnT、Glu和hs-CRP檢測結(jié)果與未滅活組檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示可采用56 ℃ 30 min熱滅活方式處理標本。滅活組ALT、ALP、CK和CK-MB檢測結(jié)果低于未滅活組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這結(jié)果與劉長德等[7]和郭旺源等[8]學者的研究結(jié)果一致，認為這些酶學指標均為不耐熱酶，56 ℃加熱30 min處理影響了酶的活性。目前臨床標本在56 ℃ 30 min熱滅活處理下穩(wěn)定性還存在一定的爭議，還需要更大數(shù)據(jù)的支持。滅活組TCO2檢測結(jié)果低于未滅活組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與文獻[9]研究結(jié)果一致。說明加熱可引起血清中CO2丟失,同時與標本采集、運輸及上機時間也有很大關(guān)系。針對標本熱滅活處理后對部分酶學項目及TCO2檢測的影響，文獻[10]建議對滅活前后的數(shù)據(jù)進行直線回歸分析，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，以便于校正后消除影響可參考使用。本研究對上述5個指標回歸分析發(fā)現(xiàn)，ALT、ALP和CK-MB在滅活組和未滅活組間具有相關(guān)性，說明這3個項目的檢測結(jié)果進行校正后可參考使用。但TCO2和CK在滅活組和未滅活組間無相關(guān)性，預示這兩個項目的檢測結(jié)果無法進行校正后使用。

文獻[11-12]證實，對疑似或確診COVID-19患者在各項手術(shù)前、侵入性操作前、輸血前均需要對傳染病、腫瘤標志物、炎癥因子等檢測，便利于病情監(jiān)測和治療，以及排除其他潛在感染因素，減少醫(yī)務(wù)工作人員的職業(yè)暴露，避免醫(yī)源性感染的發(fā)生。目前，傳染病指標、腫瘤標志物、炎癥因子等檢測，通常采用免疫反應(yīng)結(jié)合化學發(fā)光測定技術(shù)即電化學發(fā)光免疫分析技術(shù)(ECLIA)進行檢測,ECLIA具有檢測速度快、線性范圍寬、特異度強、靈敏度高等特點。本研究滅活組T3和T4檢測結(jié)果低于未滅活組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與畢東明等[13]研究結(jié)果相一致。這說明熱滅活可能對T3和T4的抗原抗體結(jié)合位點、蛋白質(zhì)活性或免疫原性產(chǎn)生一定的影響，但目前研究數(shù)據(jù)尚小，還需要多中心大數(shù)據(jù)研究來進一步證實。滅活組CYFRA21-1檢測結(jié)果低于未滅活組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與文獻[14]研究結(jié)果相一致。CYFRA21-1是一種可溶性酸性多肽的細胞角蛋白19的片段,主要出現(xiàn)在肺部，為非小細胞肺癌的首選生物標志物，常常釋放到癌癥患者血清中被檢測出，推測是由于高溫變性導致蛋白或蛋白結(jié)合位點變性,使結(jié)果有顯著差異。滅活組HBsAg、HCV-Ab、HIV-Ab、AFP、PCT、IL-6和TSH檢測結(jié)果與未滅活組檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與孫晶晶等[15]和王輝等[16]研究結(jié)果一致，證明上述指標的抗原抗體結(jié)合位點、蛋白質(zhì)活性或免疫原性不受熱滅活的影響，滅活組和未滅活組該指標檢測結(jié)果具有較好的一致性。故在疫情期間用熱滅活處理標本不影響這些項目的檢測結(jié)果，可以監(jiān)測病情，從而有效保護醫(yī)護工作者。

本研究采用的間接熒光免疫法檢測ANA和ANCA，結(jié)果提示滅活組和未滅活組ANA及ANCA陰陽性符合率、不同滴度、不同核型陰陽性符合率不受影響，但上述研究尚需進一步驗證。

SARS-CoV-2抗體檢測是COVID-19篩查的重要手段，56 ℃ 30 min熱滅活可以有效避免接觸人員感染SARS-CoV-2。滅活組標本采用磁微?；瘜W發(fā)光技術(shù)對SARS-CoV-2 2項抗體進行檢測是目前重要的檢測方法。本研究對血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，95例標本滅活組和未滅活組SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。滅活組和未滅活組血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測結(jié)果陰陽性符合率為100%，與薛雄燕等[17]研究結(jié)果一致，但與劉小政等[18]研究結(jié)果有一定差異，分析其原因可能是方法學的不同導致的，其研究采用膠體金方法檢測。所以在進行標本熱滅活處理前除了關(guān)注檢測項目本身、標本類型外，還需要關(guān)注同一個檢測項目的方法學，以保障檢測質(zhì)量。

檢驗科常用項目進行56 ℃ 30 min熱滅活，在血清學項目中常規(guī)生化項目除TCO2、少量不耐熱的酶類ALT、ALP、CK、CK-MB受較大影響外，其他項目均不受影響。發(fā)光檢測項目中傳染病指標、腫瘤標志物、炎癥因子等不受影響，甲狀腺激素中T3、T4還需要進一步加大數(shù)據(jù)驗證其是否受熱滅活的影響。自身抗體檢測ANA和ANCA滅活前后核型和熒光強度一致性為100%，SARS-CoV-2抗體檢測的結(jié)果也不受56 ℃ 30 min熱滅活影響。因此，在疫情期間建議對疑似SARS-CoV-2感染患者開展診治時，應(yīng)對其標本進行熱滅活處理，以保證檢測結(jié)果質(zhì)量，同時可降低院內(nèi)感染及防控的風險。

本研究不足之處：本研究完全模擬日常檢測流程，檢測過程中的隨機誤差因素未能進行有效的控制。同時由于實驗室的條件限制，因此熱滅活處理的效果降低實驗室檢測生物安全壓力的程度尚不能完全評估。