急性氨氮脅迫和恢復(fù)后中華條頸龜主要器官組織結(jié)構(gòu)的變化

黃祖彬，梁齡月，李維昊，李 娜，丁 利，洪美玲

( 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，海南省熱帶動植物生態(tài)學(xué)重點實驗室，海南 ?？?571158 )

龜鱉養(yǎng)殖在21世紀(jì)初發(fā)展迅猛，大型養(yǎng)殖戶及水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社等各種養(yǎng)殖模式在國內(nèi)快速發(fā)展，形成了多樣化、規(guī)?；?、數(shù)量集約化的產(chǎn)業(yè)模式[1]。中華草龜(Mauremysreevesii)與中華條頸龜(M.sinensis)是目前我國養(yǎng)殖產(chǎn)量較高的經(jīng)濟龜類[2]，據(jù)不完全統(tǒng)計，目前在我國人工養(yǎng)殖的中華條頸龜約有6000萬只，產(chǎn)量約3萬 t[2]。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大、養(yǎng)殖密度的增加、養(yǎng)殖環(huán)境污染的加重，環(huán)境脅迫對養(yǎng)殖龜鱉健康的危害加劇，這嚴(yán)重制約了龜鱉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中最主要的環(huán)境污染物之一，主要來源于未消耗的飼料、糞便等有機廢棄物的礦化過程[3-4]。氨氮在水體中通常以非離子氨(NH3)和離子氨(NH4+)的形式存在。非離子氨是氨氮毒性的主要來源，具有較高的脂溶性，極易穿透細(xì)胞膜，導(dǎo)致其在水產(chǎn)動物體內(nèi)過度積累，使水產(chǎn)動物出現(xiàn)生長減緩、免疫系統(tǒng)被抑制和死亡率高[5-6]等情況。在高密度集約化養(yǎng)殖中，特別是當(dāng)水的交換受到限制時，水中的氨氮會逐漸積累，導(dǎo)致水產(chǎn)動物受到持續(xù)性的氨氮脅迫，甚至水體中的氨氮含量可能會在短時間內(nèi)急劇升高，從而對水產(chǎn)動物造成急性氨氮脅迫損傷[7-8]。

高濃度的非離子氨進入水生動物體內(nèi)，可導(dǎo)致機體的組織器官受損。目前國內(nèi)外關(guān)于氨氮脅迫對水生動物組織結(jié)構(gòu)影響的報道多集中在魚類、甲殼類和頭足類，如尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[6]、虎斑烏賊(Sepiapharaonis)[9]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[10]、日本蟳(Charybdisjaponica)[11]、淇河鯽(Carassiusauratus)[12]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[13]等。然而氨氮脅迫對水生龜類組織結(jié)構(gòu)的影響尚未見報道。筆者通過觀察急性氨氮脅迫對中華條頸龜腦、肝臟、心臟、腎臟和脾臟的組織結(jié)構(gòu)影響以及脅迫后的恢復(fù)情況，揭示氨氮脅迫對中華條頸龜主要器官組織結(jié)構(gòu)的影響程度及脅迫后各器官的恢復(fù)能力，以期評估環(huán)境水體污染對養(yǎng)殖龜類的危害。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和飼養(yǎng)條件

本試驗在海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院龜鱉養(yǎng)殖室進行。試驗所用的中華條頸龜購自?？阢r(nóng)業(yè)養(yǎng)殖有限公司。試驗前，將體型較統(tǒng)一、活力好、健康的1齡個體[體質(zhì)量(218.26±12.65) g]，暫養(yǎng)2周以適應(yīng)養(yǎng)殖室環(huán)境。暫養(yǎng)期間每周投喂2次，每日更換養(yǎng)殖用水，養(yǎng)殖水體pH 7.45±0.26，溶解氧(8.40±0.31) mg/L。正式試驗時，分為脅迫前(自來水)和試驗組(氨氮質(zhì)量濃度200 mg/L)，每組36只，分別在脅迫前、脅迫24 h、脅迫48 h和脅迫48 h后放入自來水中恢復(fù)48 h，在 4個時間點取樣。采用氯化銨每日測定和調(diào)整總氨氮質(zhì)量濃度為200 mg/L。試驗期間停止投喂。

1.2 取樣及固定

取中華條頸龜腦、肝臟、心臟、腎臟和脾臟，用0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液漂洗后放入多聚甲醛中固定。

1.3 蘇木精—伊紅染色

常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度5 μm)，50 ℃烘片，二甲苯脫蠟2次，并在連續(xù)的梯度乙醇(無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、75%乙醇)中進行水合。脫蠟水合結(jié)束后用蘇木精—伊紅染色，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100)下觀察和拍照。

2 結(jié) 果

2.1 氨氮脅迫對中華條頸龜腦組織結(jié)構(gòu)的影響

氨氮脅迫前中華條頸龜腦結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞清晰可見(圖1a)；氨氮脅迫24 h腦組織間質(zhì)增寬，少部分神經(jīng)元出現(xiàn)核偏位現(xiàn)象(圖1b)；脅迫48 h部分神經(jīng)元出現(xiàn)腫脹，細(xì)胞核偏位現(xiàn)象增加，部分細(xì)胞核溶解，僅剩細(xì)胞核輪廓，神經(jīng)元變性、壞死，神經(jīng)間質(zhì)增寬、疏松(圖1c)；恢復(fù)48 h后神經(jīng)間質(zhì)增寬現(xiàn)象依舊存在，但神經(jīng)元腫脹與細(xì)胞核偏位現(xiàn)象有所減少(圖1d)。

圖1 氨氮脅迫對中華條頸龜腦組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of ammonia stress on histological brain structure of Chinese striped-necked turtle M. sinensisa.脅迫前； b.脅迫24 h； c.脅迫48 h； d.恢復(fù)48 h； 標(biāo)尺為50 μm； N.神經(jīng)細(xì)胞； NL.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞； M.神經(jīng)組織間質(zhì)； NO.核偏位； K.核溶解.a.before ammonia stress; b.ammonia stress for 24 h; c.ammonia stress for 48 h; d.48 hours of recovery; bar=50 μm; N.nerve cell; NL.neurogliocyte; M.mesenchyme in neural tissue; NO.nuclear offset; K.karyolysis.

2.2 氨氮脅迫對中華條頸龜肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

氨氮脅迫前中華條頸龜肝臟中肝細(xì)胞和中央靜脈清晰可見且結(jié)構(gòu)完整，肝血竇中分布有少量的色素細(xì)胞(圖2a)；氨氮脅迫24 h少部分肝細(xì)胞出現(xiàn)體積增大、顆粒變性、水泡變性等病理現(xiàn)象(圖2b)；脅迫48 h肝細(xì)胞腫脹現(xiàn)象增多，顆粒變性及水泡變性更為嚴(yán)重，肝血竇縮小甚至消失，部分肝細(xì)胞核溶解甚至消失(圖2c)；恢復(fù)48 h后肝血竇基本恢復(fù)到脅迫前水平，肝細(xì)胞腫脹減少，但顆粒變性、水泡變性現(xiàn)象依舊存在(圖2d)。

圖2 氨氮脅迫對中華條頸龜肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of ammonia stress on histological liver structure of Chinese striped-necked turtle M. sinensisa.脅迫前； b.脅迫24 h； c.脅迫48 h； d.恢復(fù)48 h； 標(biāo)尺為50 μm； H.肝細(xì)胞； HS.肝血竇； CH.色素細(xì)胞； CV.中央靜脈； GD.顆粒變性； VD.水泡變性； K.核溶解.a.before ammonia stress; b.ammonia stress for 24 h; c.ammonia stress for 48 h; d.48 hours of recovery; bar=50 μm; H.hepatocytes; HS.hepaticsinusoid; CH.chromatophore; CV.central veins; GD.granular degeneration; VD.vesicular degeneration; K.karyolysis.

2.3 氨氮脅迫對中華條頸龜心臟組織結(jié)構(gòu)的影響

氨氮脅迫前中華條頸龜心臟組織結(jié)構(gòu)完整，可見心室肌細(xì)胞分支、橢圓形的心肌細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)(圖3a)；氨氮脅迫24 h心肌細(xì)胞間隙增寬，間質(zhì)血管充血(圖3b)；脅迫48 h心肌細(xì)胞間隙持續(xù)增寬，間質(zhì)血管擴張、充血更為嚴(yán)重(圖3c)；恢復(fù)48 h后心肌細(xì)胞間隙縮小趨于脅迫前水平，充血現(xiàn)象消失(圖3d)。

圖3 氨氮脅迫對中華條頸龜心臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of ammonia stress on histological heart structure of Chinese striped-necked turtle M. sinensisa.脅迫前； b.脅迫24 h； c.脅迫48 h； d.恢復(fù)48 h； 標(biāo)尺為50 μm； CM.心肌細(xì)胞； G.間隙血管； B.心肌細(xì)胞分支； BC.血細(xì)胞.a.before ammonia stress; b.ammonia stress for 24 h; c.ammonia stress for 48 h; d.48 hours of recovery; bar=50 μm; CM.cardiac muscle cell; G.interstitial blood vessel; B.branch of cardiomyocytes; BC.blood cell.

2.4 氨氮脅迫對中華條頸龜腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響

氨氮脅迫前中華條頸龜腎臟組織的腎小管和腎小體均完整正常(圖4a)；氨氮脅迫24 h腎小球體積增大，腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)擴張，腎小管管腔縮小，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生顆粒變性，細(xì)胞膜破裂，管腔內(nèi)出現(xiàn)紅染物質(zhì)，間質(zhì)中有少量炎性細(xì)胞浸潤(圖4b)；脅迫48 h腎小管上皮細(xì)胞輪廓不清，從基膜脫落，細(xì)胞膜破裂，核固縮甚至溶解消失，炎性細(xì)胞浸潤加重(圖4c)；恢復(fù)48 h后炎性細(xì)胞基本消失，但腎小管管腔不規(guī)則和顆粒變性等病理現(xiàn)象依舊存在(圖4d)。

圖4 氨氮脅迫對中華條頸龜腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effects of ammonia stress on histological kidney structure of Chinese striped-necked turtle M. sinensisa.脅迫前； b.脅迫24 h； c.脅迫48 h； d.恢復(fù)48 h； 標(biāo)尺為50 μm； G.腎小球； T.腎小管； BC.腎小囊； GD.顆粒變性； IC.炎性細(xì)胞； RT.腎小管管腔縮?。?M.腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞膜破裂； ND.細(xì)胞輪廓不清； K.核溶解； KA.核固縮； BMD.脫離基膜.a.before ammonia stress; b.ammonia stress for 24 h; c.ammonia stress for 48 h; d.48 hours of recovery; bar=50 μm; G.glomerulus; T.kidney tubules; BC.Bowman′s capsule; GD.granular degeneration; IC.inflammatory cells; RT.reduction in space inside renal tubules; M.membranolysis; ND.the cells are not well defined; K.karyolysis; K.karyopyknosis; BMD.basement membrane detachment.

2.5 氨氮脅迫對中華條頸龜脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

氨氮脅迫前，中華條頸龜脾臟組織網(wǎng)狀支架上分布密集的淋巴細(xì)胞，被膜下有由紅髓和白髓交替分布形成的脾實質(zhì)(圖5a)；氨氮脅迫24 h，中華條頸龜脾臟表現(xiàn)為白髓區(qū)域增大,淋巴細(xì)胞明顯增多，紅髓區(qū)域略有減小(圖5b)；脅迫48 h，中華條頸龜脾臟白髓區(qū)域持續(xù)增大，中央動脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，紅髓區(qū)域面積明顯減小(圖5c)；恢復(fù)48 h后，中華條頸龜脾臟組織白髓和紅髓結(jié)構(gòu)趨于正常(圖5d)。

圖5 氨氮脅迫對中華條頸龜脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of ammonia stress on histological spleen structure of Chinese striped-necked turtle M. sinensisa.脅迫前； b.脅迫24 h； c.脅迫48 h； d.恢復(fù)48 h； 標(biāo)尺為50 μm； WP.白髓； RP.紅髓； PALS.動脈周圍淋巴鞘； CA.中央動脈.a.before ammonia stress; b.ammonia stress for 24 h; c.ammonia stress for 48 h; d.48 hours of recovery; bar=50 μm; WP.white marrow; RP.red marrow; PALS.periarterial lymphatic sheath; CA.central artery.

3 討 論

3.1 氨氮脅迫對中華條頸龜腦組織結(jié)構(gòu)的影響

爬行動物的腦組織可分為大腦、間腦、中腦、小腦及延腦5個主要部分。腦組織是機體的神經(jīng)中樞，調(diào)控機體的各種生理機能。吳利敏等[12]對淇河鯽的研究表明，急性氨氮脅迫會導(dǎo)致其腦組織神經(jīng)纖維被破壞，分泌細(xì)胞與支持細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的壞死；而陳思涵等[9]對虎斑烏賊的研究表明，急性氨氮脅迫不會對其腦組織神經(jīng)纖維、分泌細(xì)胞和支持細(xì)胞造成損傷。在本試驗中，中華條頸龜大腦在氨氮脅迫后出現(xiàn)腦組織間質(zhì)增寬，神經(jīng)元腫脹，神經(jīng)元細(xì)胞核偏位，甚至出現(xiàn)神經(jīng)元變性、壞死等現(xiàn)象，說明氨氮脅迫會對中華條頸龜腦組織造成損傷，這種損傷可能與腦細(xì)胞中的神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸合成受阻和谷氨酰胺大量合成導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)平衡被打破有關(guān)[12]。恢復(fù)48 h后其神經(jīng)元腫脹與細(xì)胞核偏位現(xiàn)象有所減少，說明腦組織具有一定的修復(fù)能力，但48 h恢復(fù)不足以完全修復(fù)氨氮脅迫造成的損傷。

3.2 氨氮脅迫對中華條頸龜肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

肝臟是龜類重要的解毒器官，同時也是各種關(guān)鍵代謝途徑的主要器官，化學(xué)物質(zhì)的毒性作用主要出現(xiàn)在肝臟中[6]。王貞杰等[14]對圓斑星鰈(Veraspervariegatus)的研究表明，急性氨氮脅迫后會出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹和溶解，細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞水樣變性及空泡化等現(xiàn)象；郝小鳳等[15]對泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)的研究表明，氨氮脅迫會使其產(chǎn)生肝細(xì)胞腫脹，線粒體數(shù)量減少，核膜破損等現(xiàn)象；而Liang等[5]對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的研究表明，96 h氨氮脅迫后肝胰腺未出現(xiàn)明顯的組織學(xué)損傷。中華條頸龜肝實質(zhì)由許多肝小葉和極少量的間質(zhì)構(gòu)成，肝實質(zhì)內(nèi)結(jié)締組織少，肝小葉分界不清楚[16]。在本試驗中，中華條頸龜肝臟在氨氮脅迫后出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞變性，肝血竇縮小甚至消失，細(xì)胞核溶解甚至消失等現(xiàn)象，說明急性氨氮脅迫會對中華條頸龜?shù)母闻K組織造成損傷，并且損傷與脅迫時間呈正相關(guān)，這可能與機體在高含量氨氮脅迫下超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性被抑制，機體抗氧化能力下降[13]有關(guān)；同時，機體免疫能力的下降可能會影響肝臟正常的解毒及代謝功能，進而導(dǎo)致有毒物質(zhì)在體內(nèi)積累，造成進一步的損傷?；謴?fù)48 h后肝臟肝血竇恢復(fù)到脅迫前水平，肝細(xì)胞腫脹減少，但顆粒變性、水泡變性現(xiàn)象依舊存在，說明肝臟具有一定的修復(fù)能力,但恢復(fù)48 h不足以完全修復(fù)脅迫造成的損傷。

3.3 氨氮脅迫對中華條頸龜心臟組織結(jié)構(gòu)的影響

心臟是機體循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，是促進血液流動的動力泵，通過其收縮和舒張將血液輸入動脈。不同種類的應(yīng)激或脅迫會對心臟產(chǎn)生一定程度的損傷，如雷雯雯[17]的研究表明，鎘暴露會導(dǎo)致長江華溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense)心臟出現(xiàn)心肌水腫、空泡變性、玻璃樣變性和炎癥細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象；王來等[18]對大鼠(Rattusnorvegicus)的研究表明，鎘會引起心臟心肌細(xì)胞腫脹、心肌纖維增多、閏盤受到損傷等病理現(xiàn)象。中華條頸龜?shù)男呐K分為兩心房和兩心室，左右心室由不完全隔膜分開，心肌細(xì)胞呈束狀，核橢圓形，相鄰的心肌細(xì)胞連接處有閏盤結(jié)構(gòu)[16]。在本試驗中，中華條頸龜心臟在氨氮脅迫后出現(xiàn)心室肌細(xì)胞間隙增寬，間質(zhì)血管擴張、充血等現(xiàn)象，說明氨氮脅迫會對中華條頸龜心臟組織造成損傷，可能導(dǎo)致心臟供血能力下降，影響營養(yǎng)物質(zhì)的輸送和吸收?；謴?fù)48 h后間隙縮小趨于脅迫前水平，充血現(xiàn)象消失，說明心臟組織面對氨氮脅迫造成的損傷具有較好的修復(fù)能力。

3.4 氨氮脅迫對中華條頸龜腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響

腎臟是龜類主要的排泄器官，也是解毒器官之一。機體新陳代謝的產(chǎn)物通過腎臟排出體外，同時腎臟還能調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓和離子平衡。吳利敏等[12]研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫會導(dǎo)致淇河鯽腎臟組織出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤、腎小管管腔縮小、腎小囊腔擴大等組織病變；張武肖等[10]研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫會造成團頭魴腎臟組織產(chǎn)生腎小球萎縮，腎小管上皮細(xì)胞腫大、壞死、空泡化，腎小管壞死等組織病變；Mishra等[19]研究發(fā)現(xiàn)，重鉻酸鉀導(dǎo)致翠鱧(Channapunctata)腎臟組織出現(xiàn)腎小管管腔縮小、腎小囊腔擴大、腎小管上皮細(xì)胞腫大等組織病變；Benli等[6]對尼羅羅非魚的研究表明，氨氮脅迫后腎臟組織出現(xiàn)腎小球腎炎和充血等組織病變。本試驗中，氨氮脅迫后中華條頸龜腎臟表現(xiàn)出腎小管管腔縮小，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生顆粒變性，核固縮甚至溶解消失，說明高含量氨氮作用于腎小管上皮細(xì)胞后，導(dǎo)致腎小管發(fā)生損傷，進而可能導(dǎo)致腎臟重吸收和排泄能力下降、破壞機體體液平衡及破壞機體的酸堿平衡；腎臟中炎性細(xì)胞浸潤，說明氨氮誘發(fā)了腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)。恢復(fù)48 h后腎臟中炎性細(xì)胞基本消失，但腎小管管腔不規(guī)則、顆粒變性等病理現(xiàn)象依舊存在；說明腎臟有一定的修復(fù)能力，但48 h恢復(fù)不足以完全修復(fù)脅迫造成的損傷。

3.5 氨氮脅迫對中華條頸龜脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

脾臟是機體最大的淋巴器官，在造血、免疫等方面發(fā)揮著重要作用。王曉杰等[20]研究發(fā)現(xiàn)，鹽度脅迫下許氏平鲉(Sebastesschlegeli)脾臟組織中淋巴細(xì)胞明顯增加，且呈聚集現(xiàn)象；王文博等[21]對草魚(Ctenopharyngodonidellus)的研究表明，擁擠脅迫會導(dǎo)致脾臟出現(xiàn)明顯萎縮；劉奇奇等[22]研究發(fā)現(xiàn)，運輸脅迫會對四指馬鲅(Eleutheronematetradactylum)幼魚脾臟造成損傷，表現(xiàn)為白髓、紅髓和邊緣區(qū)區(qū)域變小，巨噬細(xì)胞中心數(shù)量減少。中華條頸龜?shù)钠⑴K為棕褐色實質(zhì)器官，較小，豆形；被膜較薄，由致密結(jié)締組織組成，表面覆蓋單層扁平上皮細(xì)胞；可分為白髓和紅髓兩部分[16]。中央動脈周圍密集排列大量淋巴細(xì)胞，形成動脈周圍淋巴鞘；動脈周圍淋巴鞘和淋巴小結(jié)組成白髓。紅髓由脾索和脾竇組成。氨氮脅迫后中華條頸龜脾臟白髓區(qū)域增大，淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加，說明氨氮脅迫促使中華條頸龜?shù)拿庖呒?xì)胞增殖，其特異性免疫應(yīng)答能力增強?；謴?fù)48 h后，白髓和紅髓區(qū)域趨于正常，淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)正常，說明機體內(nèi)的有害物質(zhì)減少，脾臟的免疫應(yīng)答能力恢復(fù)到正常水平。

4 結(jié) 論

通過組織切片分析可知，急性氨氮脅迫下，腦、肝臟、心臟及腎臟組織都受到不同程度的損傷，從本試驗來看，損傷相對嚴(yán)重的是肝臟和腎臟；脾臟作為機體的免疫器官，在脅迫發(fā)生后能夠迅速啟動特異性免疫反應(yīng)，清除機體內(nèi)出現(xiàn)的有害物質(zhì)。脅迫后恢復(fù)試驗表明，中華條頸龜腦、肝臟、心臟及腎臟等器官組織均表現(xiàn)出可恢復(fù)性，其中心臟恢復(fù)能力較好，腦、肝臟和腎臟恢復(fù)能力相對較差。綜上所述，在養(yǎng)殖中應(yīng)當(dāng)注意水質(zhì)的監(jiān)測和管理，防止出現(xiàn)氨氮對中華條頸龜?shù)亩拘孕?yīng)。

致 謝

感謝河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物醫(yī)藥學(xué)院康靜靜博士在組織病理讀片中給予的指導(dǎo)和幫助。