Cu2+對(duì)文蛤紅殼色選育系及自然群體抗氧化能力的影響

田 鎮(zhèn)，張志東，陳愛華，吳楊平，陳素華，張 雨，曹 奕，李秋潔

( 1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007； 2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306 )

文蛤(Meretrixmeretrix)，屬軟體動(dòng)物門、瓣鰓綱、簾蛤目、簾蛤科，是一種廣溫、廣鹽性的埋棲型貝類，是我國灘涂養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)貝類之一[1]。近年來，由于重金屬農(nóng)藥使用及工業(yè)廢水排放等原因，養(yǎng)殖海水重金屬含量超標(biāo)。一些自然海域文蛤采苗區(qū)和養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)文蛤富集中毒現(xiàn)象，影響了文蛤產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。

海水貝類重金屬富集程度有所差別，一般通過吸附、濾食等方式，從周圍環(huán)境積累重金屬[3-5]，導(dǎo)致貝類出現(xiàn)中毒反應(yīng)[6]。相關(guān)研究表明[7-8]，重金屬進(jìn)入貝類體內(nèi)，貝類細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)會(huì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，同時(shí)刺激動(dòng)物體內(nèi)某些基因的表達(dá)，產(chǎn)生相關(guān)金屬酶類增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，從而減輕重金屬對(duì)細(xì)胞的損傷；一旦體內(nèi)氧化還原機(jī)制平衡遭到破壞，細(xì)胞造成損傷，機(jī)體會(huì)發(fā)生中毒反應(yīng)。超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧清除系統(tǒng)中的主要抗氧化酶——過氧化氫酶(CAT)是海水貝類對(duì)外界環(huán)境應(yīng)激機(jī)制中重要的抗氧化酶，是清除自由基和活性氧的第一道防線。當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境脅迫時(shí)，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶能迅速應(yīng)答，因此其酶活性的變化在一定程度能反映貝類免疫機(jī)能的變化，已成為貝類免疫、生態(tài)藥理學(xué)等相關(guān)研究的重要指標(biāo)[9]。

筆者對(duì)文蛤自然群體及紅殼色選育系進(jìn)行Cu2+脅迫試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)在不同質(zhì)量濃度Cu2+條件下兩個(gè)文蛤群體存活率變化趨勢(shì)，分析其超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性以及Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)量變化情況，以期為選育抗逆性強(qiáng)優(yōu)良品質(zhì)文蛤新品系提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用自然殼色文蛤(稱自然群體)來源于江蘇省如東縣腰沙—冷家沙海域，紅殼色選育系文蛤(稱紅殼色選育系)為原種文蛤經(jīng)過5代選育所得，平均殼長(3.53±0.34) cm，平均體質(zhì)量(13.32±2.80) g。文蛤清洗干凈后放入試驗(yàn)箱中暫養(yǎng)5 d，每日換水，并定期投喂江蘇文蛤良種場培養(yǎng)的球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)和綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)藻液，水體初始藻密度為1×105個(gè)/mL。

1.2 試驗(yàn)環(huán)境

將試驗(yàn)海水過濾、純化。鹽度29±0.55，pH 8.0±0.3，水溫(18±2) ℃，溶解氧(8.35±0.74) mg/L，少量充氣。利用藥物CuSO4·5H2O(AR)制備質(zhì)量濃度為5 g/L的Cu2+母液。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 文蛤存活率試驗(yàn)

利用Cu2+母液將質(zhì)量濃度設(shè)置為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 6個(gè)梯度，將暫養(yǎng)后的紅殼色選育系和自然群體分別投入到各Cu2+梯度組中，每組各50個(gè)，設(shè)置3個(gè)平行組。試驗(yàn)期間停止投餌，微量充氣持續(xù)觀察試驗(yàn)文蛤活動(dòng)狀態(tài)，及時(shí)清除死亡個(gè)體，48 h后統(tǒng)計(jì)各組存活率。死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為刺激無反應(yīng)，雙殼張開。

1.3.2 Cu2+脅迫試驗(yàn)

根據(jù)1.3.1試驗(yàn)結(jié)果來確定Cu2+質(zhì)量濃度梯度，使得該試驗(yàn)在文蛤存活率高于50%環(huán)境中進(jìn)行。試驗(yàn)箱中Cu2+母液作為脅迫的Cu2+源，使Cu2+的質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L；將選育群體與自然群體分成5組，每組20個(gè)，投放于各質(zhì)量濃度試驗(yàn)箱中，并設(shè)置3組平行。分別于3、6、12、24、48 h時(shí)隨機(jī)選擇3個(gè)個(gè)體取樣，取樣部位為鰓，并將樣品立即置于-80 ℃冰箱，用于熒光定量PCR和酶活性測(cè)定。

1.3.3 抗氧化酶活性測(cè)定

在玻璃勻漿器中加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，冰上勻漿組織2 min，勻漿后于離心機(jī)上2500 r/min(離心半徑8.6 cm)離心10 min，取上清液用于測(cè)定酶活。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性和總蛋白量，酶活性單位為U/mg。

1.3.4 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR

RNA提取采用常規(guī)TRizol RNA 提取方法進(jìn)行，RNA提取完成后立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄步驟參考Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit說明書。逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板稀釋后作為熒光定量PCR的模板，以文蛤β-actin為內(nèi)參基因，Cu/Zn-SOD基因引物(表1)進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，分析選育群體與自然群體在Cu2+脅迫下鰓組織的基因表達(dá)量及表達(dá)變化。

表1 PCR引物信息Tab.1 Primers used for PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用最小二乘法2-ΔΔCt法處理熒光定量PCR數(shù)據(jù)，用SPSS 22.0軟件對(duì)存活率、酶活性和Cu/Zn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性(α=0.05)。通過Origin 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并導(dǎo)出柱狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 不同Cu2+質(zhì)量濃度對(duì)文蛤群體存活率的影響

統(tǒng)計(jì)不同Cu2+質(zhì)量濃度下文蛤的存活率(圖1)。試驗(yàn)結(jié)果表明，紅殼色選育系和自然群體的存活率隨著Cu2+質(zhì)量濃度的升高而逐漸降低，有著共同的趨勢(shì)。在相同Cu2+質(zhì)量濃度下，紅殼色選育系和自然群體的存活率差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)，紅殼色選育系和自然群體的存活率均低于50%。

圖1 不同Cu2+質(zhì)量濃度下文蛤的存活率Fig.1 The survival rate of hard clam M. meretrix at different Cu2+ concentrations

2.2 不同Cu2+質(zhì)量濃度對(duì)文蛤群體超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性的影響

Cu2+質(zhì)量濃度為0 mg/L時(shí)，紅殼色選育系與自然群體的超氧化物歧化酶活性差異不顯著(P>0.05)(圖2a)；Cu2+質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，2組文蛤隨著脅迫時(shí)間延長呈升高趨勢(shì)，超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05)(圖2b)；Cu2+質(zhì)量濃度為0.2～0.3 mg/L時(shí)，2組文蛤超氧化物歧化酶活性前期(3～6 h)變化緩慢，在后期(12～48 h)升高幅度較大(圖2c～d)；Cu2+質(zhì)量濃度為0.4 mg/L時(shí)，2組文蛤超氧化物歧化酶活性隨著脅迫時(shí)間延長逐漸增加(P<0.05)(圖2e)。48 h時(shí)，2組文蛤超氧化物歧化酶活性隨著Cu2+質(zhì)量濃度增加呈上升趨勢(shì)，除對(duì)照組(0 mg/L)外，紅殼色選育系與自然群體差異顯著(P<0.05)(圖2f)。

Cu2+質(zhì)量濃度為0 mg/L時(shí)，紅殼色選育系與自然群體的過氧化氫酶活性無顯著變化(P>0.05)(圖3a)；Cu2+質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，2組文蛤過氧化氫酶活性隨時(shí)間呈先降后升趨勢(shì)，24～48 h時(shí)間段兩者過氧化氫酶活性差異顯著(P<0.05)(圖3b)；Cu2+質(zhì)量濃度為0.2～0.4 mg/L時(shí)，2組文蛤過氧化氫酶活性差異顯著(P<0.05)，隨時(shí)間變化呈先降后升趨勢(shì)(圖3c～e)。在48 h時(shí)，Cu2+質(zhì)量濃度為0.2 mg/L組過氧化氫酶活性開始有上升趨勢(shì)，并且與對(duì)照組(0 mg/L)差異顯著(P<0.05)，除對(duì)照組(0 mg/L)外，其他各組紅殼色選育系與自然群體過氧化氫酶活性差異顯著(P<0.05)(圖3f)。另外，在試驗(yàn)過程中，添加不同質(zhì)量濃度的Cu2+組3 h內(nèi)紅殼色選育系和自然群體均吐出大量黏液，足全部伸展，做掘土狀，3 h后足開始收縮，雙殼逐漸閉緊。

圖3 不同Cu2+質(zhì)量濃度下文蛤鰓組織過氧化氫酶活性隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.3 Variation trend of catalase activity (CAT) in gill tissue of hard clam M. meretrix at different Cu2+ concentrationsa.0 mg/L Cu2+； b.0.1 mg/L Cu2+； c.0.2 mg/L Cu2+； d.0.3 mg/L Cu2+； e.0.4 mg/L Cu2+； f.48 h時(shí)紅殼色選育系和自然群體鰓組織的過氧化氫酶活性隨Cu2+質(zhì)量濃度變化趨勢(shì).a.0 mg/L Cu2+； b.0.1 mg/L Cu2+； c.0.2 mg/L Cu2+； d.0.3 mg/L Cu2+； e.0.4 mg/L Cu2+； f.the change trend of CAT in gill tissue of red shell color breeding lines and natural populations at Cu2+ concentration at 48 h.

2.3 不同Cu2+質(zhì)量濃度對(duì)文蛤群體Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量變化

不同Cu2+質(zhì)量濃度脅迫48 h后Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量變化見圖4。低Cu2+質(zhì)量濃度時(shí)，紅殼色選育系和自然群體的Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量水平差異不顯著(P<0.05)；Cu2+質(zhì)量濃度為0.2～0.4 mg/L時(shí)，Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量水平呈現(xiàn)上調(diào)且紅殼色選育系和自然群體的Cu/Zn-SOD基因表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)。

圖4 48 h時(shí)文蛤鰓組織Cu/Zn-SOD相對(duì)表達(dá)量隨Cu2+質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)Fig.4 Variation trend of Cu/Zn-SOD relative expression level in gill tissue of hard clam M. meretrix with Cu2+ concentration at 48 h

3 討 論

3.1 重金屬Cu2+對(duì)文蛤存活率的影響

隨著沿海工業(yè)的發(fā)展，水體中重金屬污染已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖不可忽視的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。加之貝類多集中分布在沿岸灘涂上，移動(dòng)性差，可通過吸附和濾食的方式，直接從周圍環(huán)境積累重金屬。大量研究表明，重金屬Cu2+對(duì)海水貝類的生長繁殖會(huì)產(chǎn)生不利影響，甚至導(dǎo)致海水貝類的大量死亡[10-11]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)，紅殼色選育系的存活率比自然群體略高，但差異并不顯著(P>0.05)，且48 h后存活率均低于50%。雖然Cu是生物體必需的一種微量元素，在機(jī)體代謝過程中起到重要的作用，但當(dāng)其含量超過一定的限度時(shí)，會(huì)對(duì)機(jī)體造成不可逆轉(zhuǎn)的毒害作用。造成上述結(jié)果的原因可能是，在選擇育種的過程中，雖然僅以“殼色和生長”為目標(biāo)性狀進(jìn)行定向選育，但選育出來的品系可具有其他的特性。杜曉東等[12]以“殼長+殼寬”為選育指標(biāo)，采用群體選育輔以家系選育技術(shù)，經(jīng)連續(xù)5代選育出的馬氏珠母貝(Pinctadamartensi)“海選1號(hào)”，其不但具有較優(yōu)的生長速度，還具有育珠期間母貝的留核率更高、珠層厚度更厚和珍珠產(chǎn)量高的表型差異。本試驗(yàn)中，文蛤紅殼色選育系對(duì)Cu2+的耐受性的適當(dāng)提高，與上述研究結(jié)果類似。因此，需要后續(xù)深入研究才能充分闡述新品系存活率提高的機(jī)理。

3.2 重金屬Cu2+對(duì)文蛤超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性的影響

文蛤作為無脊椎動(dòng)物，體內(nèi)僅有由血細(xì)胞主導(dǎo)的非特異性免疫[13]，溫度、餌料、重金屬等因素均會(huì)對(duì)貝類體內(nèi)的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性產(chǎn)生較大的影響。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是生物體內(nèi)抗氧化物酶體系中重要的兩種酶，在重金屬壓力刺激下的機(jī)體抗氧化免疫反應(yīng)和損傷修復(fù)中起重要作用[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著Cu2+質(zhì)量濃度上升，紅殼色選育系和自然群體體內(nèi)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性明顯上升，這屬于生物機(jī)體對(duì)外界環(huán)境脅迫做出的應(yīng)激反應(yīng)。在較低Cu2+質(zhì)量濃度時(shí)，文蛤過氧化氫酶活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)，后隨Cu2+質(zhì)量濃度上升，又呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。這可能是由于“毒物興奮作用”導(dǎo)致過氧化氫酶活性在生物體受到較為輕微污染的時(shí)候經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)降低趨勢(shì)，當(dāng)增加毒物污染時(shí)間又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[15-16]。這與在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[17]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[18]、紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)[19]中所表現(xiàn)的先抑制后誘導(dǎo)趨勢(shì)相一致。而此次試驗(yàn)中超氧化物歧化酶活性是隨質(zhì)量濃度的增加和時(shí)間的延長而升高，這一趨勢(shì)與在青蛤(Cyclinasinensis)[20]、近江牡蠣(Crassostreaariakensis)[21-22]、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[23]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[24]等中所表現(xiàn)出的先誘導(dǎo)后抑制趨勢(shì)不同，可能是由于此次試驗(yàn)的脅迫時(shí)間過短，未觀察后續(xù)的抑制過程。誘導(dǎo)上升可能是細(xì)胞和組織受到輕度破壞時(shí)，因受到污染物脅迫而不斷產(chǎn)生新的超氧化物歧化酶使得氧化還原體系保持平衡，這是機(jī)體自身正常的應(yīng)激反應(yīng)[25]；而下降趨勢(shì)可能是由于生物受脅迫時(shí)間延長，體內(nèi)自由基過多，抗氧化體系平衡被破壞所致[26]。另外，在試驗(yàn)過程中，添加不同質(zhì)量濃度的Cu2+試驗(yàn)組3 h內(nèi)紅殼色選育系和自然群體均吐出大量黏液，足全部伸展，做掘土狀；3 h后足開始收縮，雙殼逐漸閉緊。這是文蛤受到污染物脅迫，機(jī)體受應(yīng)激后逐步適應(yīng)的生理表現(xiàn)。而文蛤黏液的產(chǎn)生與抗氧化活性之間關(guān)系需進(jìn)一步研究。

3.3 重金屬Cu2+對(duì)文蛤Cu/Zn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量的影響

Cu/Zn-SOD基因在阻止金屬毒性脅迫、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷方面發(fā)揮重要作用，當(dāng)機(jī)體遭受重金屬氧化損傷時(shí)，Cu/Zn-SOD基因高表達(dá)可有效消除過多的氧自由基，降低和阻止細(xì)胞損傷[27-28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，自然群體和紅殼色選育系在不同Cu2+脅迫下，48 h時(shí)間段的Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量變化均呈現(xiàn)質(zhì)量濃度—表達(dá)量線性關(guān)系，與蝦夷扇貝、海灣扇貝(Argopectenirradians)[29]等貝類表達(dá)趨勢(shì)相類似，但與皺紋冠蚌(Cristariaplicata)[30]、湖北釘螺(Oncomelaniahupensis)及中華圓田螺(Cipangopaludinacahayensi)[31]等淡水貝類24 h后表達(dá)量出現(xiàn)下降不同；并且紅殼色選育系Cu/Zn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量在同一Cu2+質(zhì)量濃度下與自然群體相比差異顯著，這與超氧化物歧化酶活性的結(jié)果趨勢(shì)相一致，也說明了紅殼色選育系文蛤在一定Cu2+質(zhì)量濃度下的抗氧化性優(yōu)于自然群體。這可能源于紅殼色選育系是課題組以“殼色+生長”采用閉鎖群繁選育的新品系，在殼色和生長性狀對(duì)某些多功能優(yōu)良基因變異有一定程度累積[12]。

4 結(jié) 論

通過設(shè)計(jì)不同Cu2+質(zhì)量濃度對(duì)文蛤自然群體及紅殼色選育系進(jìn)行脅迫試驗(yàn)，獲得Cu2+質(zhì)量濃度脅迫下紅殼色選育系和自然群體的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性變化，共同表現(xiàn)出相應(yīng)的時(shí)間—效應(yīng)關(guān)系和質(zhì)量濃度—效應(yīng)關(guān)系；同時(shí)采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了Cu2+脅迫下Cu/Zn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量，其在兩組文蛤體內(nèi)與Cu2+質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系。綜上所述，紅殼色選育系的Cu2+抗氧化性在一定程度優(yōu)于自然群體。這可能源于紅殼色選育系是以“殼色+生長”采用閉鎖群繁選育的新品系，在殼色和生長性狀對(duì)某些多功能優(yōu)良基因變異有一定程度累積，如SCD、CPOX基因是文蛤殼色性狀重要控制基因，同時(shí)也是貝類參與免疫反應(yīng)的關(guān)鍵基因[31]。本試驗(yàn)結(jié)果將對(duì)文蛤抗逆性選育和新品種的開發(fā)提供科學(xué)參考基礎(chǔ)。