金錢魚孕激素受體基因的克隆、鑒定與表達(dá)研究

石紅娟，黃健旋，朱晨陽，吳佳鋼，何飛祥，江東能，黃 洋，朱春華，李廣麗

( 1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088； 2.廣東省名特優(yōu)魚類生殖調(diào)控與繁育工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088； 3.湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088 )

孕酮是一種孕激素[1]，屬于甾體激素(含甾體結(jié)構(gòu))，在動(dòng)物的生殖活動(dòng)中具有重要作用，如調(diào)節(jié)性腺中生殖細(xì)胞的發(fā)育、雌性排卵、雄性排精等。孕激素主要通過其特異受體的介導(dǎo)來發(fā)揮其生理作用[2]，目前，已知的孕激素受體包括兩類：分別是膜受體(mPR)和核受體(Pgr)。其中，mPR介導(dǎo)的孕激素信號(hào)，不依賴基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過程[3]；而Pgr介導(dǎo)經(jīng)典的孕激素信號(hào)通路，依賴于下游基因的轉(zhuǎn)錄翻譯[4]。Pgr由核受體亞家族3C組成員3(NR3C3)基因編碼，隸屬于核受體家族(NR)。Pgr是經(jīng)典的NR家族成員，由以下5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：不保守的N末端結(jié)構(gòu)域、高度保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)、鉸鏈區(qū)、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD，其保守性僅次于DBD)和C末端結(jié)構(gòu)域[5]。Pgr是配體活化型轉(zhuǎn)錄因子，能和DNA的特定序列結(jié)合，通過抑制或激活基因的轉(zhuǎn)錄翻譯來調(diào)節(jié)動(dòng)物的生命活動(dòng)。

研究表明，哺乳動(dòng)物Pgr在調(diào)節(jié)乳腺癌[6-7]、宮頸癌[8]、子宮內(nèi)膜癌[9-10]、卵巢癌[11-13]等過程中具有重要作用。乳腺癌患者的病理特征表現(xiàn)為雌激素受體(ER)和Pgr陽性，利用孕激素受體阻斷劑ZXH951能選擇性地有效抑制Pgr陽性乳腺癌細(xì)胞[6-7]。此外，Pgr介導(dǎo)的孕激素信號(hào)在調(diào)控卵泡發(fā)育成熟、誘發(fā)排卵中也必不可少。在Pgr純合敲除小鼠(Musmusculus)中，雌性卵泡正常生長，但排卵期前卵泡破裂失敗，最終導(dǎo)致無法成功排卵和雌性不育[14-15]。近年來，核受體基因(pgr基因)相繼在部分硬骨魚類如斑馬魚(Daniorerio)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、大黃魚(Larimichthyscroce)、青鳉(Oryziaslatipes)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)、大西洋鮭(Salmonsalar)、鯉(Cyprinuscarpio)中被克隆。魚類Pgr的功能研究表明，Pgr介導(dǎo)的孕激素信號(hào)在調(diào)節(jié)魚類性腺分化、配子成熟、雌性排卵和雄性排精過程中發(fā)揮重要功能。在羅非魚中，一方面，利用Pgr抑制劑米非司酮(RU486)處理性腺未分化的XX雌性羅非魚，導(dǎo)致其卵巢分化受阻，雌、雄通路基因表達(dá)紊亂，雌激素E2水平降低，性腺雄性化[16]。而米非司酮處理未分化的XY雄性羅非魚90 d后，導(dǎo)致精巢精子發(fā)生受阻，且外源孕激素成功回救[17]，這些結(jié)果表明，Pgr在性腺的早期分化中具有重要功能。另一方面，在XY雄性羅非魚純合敲除pgr基因?qū)е戮驳纳?xì)胞減少、精巢細(xì)小，性腺成熟系數(shù)降低，排精量減少、精子活力降低[18]。在斑馬魚中，純合敲除pgr基因?qū)е麓启~卵泡成熟后濾泡細(xì)胞破裂失敗，因此排卵失敗和雌性不育，但并未影響雄性的育性[19]。在鯉中，促產(chǎn)素處理能顯著上調(diào)鯉精液、卵細(xì)胞以及受精卵中pgr mRNA的表達(dá)，暗示Pgr可能參與催產(chǎn)素誘導(dǎo)的排精和排卵反應(yīng)[20]。綜上所述，Pgr介導(dǎo)的孕激素信號(hào)在魚類的生殖活動(dòng)調(diào)控中具有重要的作用。

金錢魚(Scatophagusargus)屬鱸形目、金錢魚屬，主要分布于太平洋和印度洋，是我國東南沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)魚類。除了具有觀賞價(jià)值外，金錢魚肉質(zhì)鮮嫩，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，可為人體提供多種不飽和脂肪酸[21]，因此深受消費(fèi)者的喜愛。此外，金錢魚食性廣，適應(yīng)性和抗病抗逆性強(qiáng)[22]。在金錢魚人工養(yǎng)殖過程中，雌、雄魚性腺發(fā)育不同步，卵泡不能充分發(fā)育成熟，需要施加適量催產(chǎn)素進(jìn)行催產(chǎn)[23-24]。因此，筆者開展了金錢魚pgr基因克隆、組織表達(dá)以及性腺發(fā)育過程中的表達(dá)模式研究，有助于深入探索金錢魚的卵泡成熟和排卵機(jī)制，并為金錢魚的人工養(yǎng)殖和催產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用金錢魚購自湛江市東風(fēng)水產(chǎn)批發(fā)市場，雌、雄成魚各3尾，體質(zhì)量260～310 g，體長19.5～22.4 cm。麻醉后，解剖，取下丘腦、垂體、鰓、肝臟、腸、腎臟、肌肉、精巢、卵巢等各組織，將其放入液氮中，操作結(jié)束后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，用于提取各組織RNA，進(jìn)行基因克隆、基因表達(dá)分析等試驗(yàn)。不同性腺發(fā)育時(shí)期的金錢魚樣本均取自廣東海洋大學(xué)東海島生物研究基地，各期的雌、雄魚各6尾，麻醉后，解剖，取卵巢和精巢樣品，所有樣品取2份。其中1份用于提取RNA，液氮中速凍后-80 ℃保存；1份置于波恩氏液過夜固定，用于組織學(xué)切片確定性腺發(fā)育時(shí)期，具體方法參照文獻(xiàn)[25]。

1.2 提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

按照Trizol試劑盒(Invitrogen, 15596108，美國)說明書提取各組織和不同發(fā)育時(shí)期精巢、卵巢的總RNA[11]。取1 μL總RNA用于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，另取1 μL總RNA，利用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白測定儀(Thermo Scientific, 美國)測定濃度和質(zhì)量，其余總RNA置于-80 ℃保存，備用。

分別取1 μg金錢魚各組織和不同發(fā)育時(shí)期性腺樣品總RNA，按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa, RR047A，日本)說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 金錢魚pgr基因的克隆和序列分析

從美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中下載多個(gè)不同物種的pgr基因序列：如金頭鯛(Sparusaurata)、大黃魚、高體(Serioladumerili)、尼羅羅非魚、青鳉和斑馬魚等。在實(shí)驗(yàn)室金錢魚性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行生物信息學(xué)分析和序列比對，分離金錢魚pgr基因轉(zhuǎn)錄本。基于此設(shè)計(jì)引物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。使用2× PCR Mix(東盛生物科技公司)進(jìn)行基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用含16 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。將目的片段用DNA凝膠回收試劑盒(N1072，東盛生物科技公司)進(jìn)行純化。將純化的片段連接到Peasy-T3載體(CT301，北京全式金生物技術(shù)有限公司)中進(jìn)行亞克隆，將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)10～12 h，挑選克隆，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，將篩選陽性克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

利用美國國立生物技術(shù)信息中心在線預(yù)測金錢魚pgr基因的開放閱讀框(ORF)和蛋白序列。利用Lasergene 7.1.0軟件包進(jìn)行多重比對蛋白質(zhì)序列和分析同源性。使用ClustalX 1.83和MEGA 6.0軟件，并用鄰接方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)

采用RT-PCR檢測pgr基因在雌、雄金錢魚各組織中的表達(dá)，金錢魚β-actin作為內(nèi)參基因。使用2× PCR MIX(東盛生物科技公司)進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增，在PCR儀C1000TMTherm Cycler(BioRad，美國)上進(jìn)行，設(shè)定程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用2%瓊脂糖凝膠電泳，再利用凝膠成像分析系統(tǒng)，分析條帶并調(diào)節(jié)亮度，拍照，保存圖片，進(jìn)行分析。試驗(yàn)所用引物見表1。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

采用qRT-PCR檢測金錢魚pgr基因在不同發(fā)育時(shí)期精巢和卵巢中的表達(dá)水平。反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)中進(jìn)行，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系(20 μL)：兩個(gè)引物各0.8 μL；cDNA模板2 μL，無菌水16.4 μL。設(shè)定程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。β-actin為內(nèi)參基因。運(yùn)用2-ΔΔCt方法計(jì)算pgr基因相對表達(dá)量。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較，檢驗(yàn)的顯著性概率臨界值為0.05。試驗(yàn)所用引物見表1。

表1 試驗(yàn)所使用的引物Tab.1 Primers used in the present study

2 結(jié)果與分析

2.1 金錢魚pgr cDNA克隆和序列分析

金錢魚pgr基因的開放閱讀框(ORF)長度為2016 bp，共編碼671個(gè)氨基酸，其編碼的第302～373個(gè)氨基酸構(gòu)成鋅指C4型結(jié)構(gòu)域，第458～622個(gè)氨基酸組成HOLI結(jié)構(gòu)域(圖1)。

圖1 金錢魚pgr基因開放閱讀框序列Fig.1 Open reading frame sequence of pgr gene in spotted scat S. argus 第一部分紅色標(biāo)記部分氨基酸為鋅指C4型結(jié)構(gòu)域；第二部分紅色標(biāo)記部分氨基酸為HOLI結(jié)構(gòu)域.The amino acid in the first part marked by red is zinc finger C4 type domain; in the second part, the amino acid marked by red is the HOLI domain.

2.2 金錢魚Pgr氨基酸序列比對

序列比對結(jié)果顯示，不同物種Pgr N末端氨基酸序列的保守性較差、高度可變，而DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域保守性較高，其配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端氨基酸序列在不同物種間高度保守(圖2)。

圖2 金錢魚Pgr與其他脊椎動(dòng)物的氨基酸序列比對Fig.2 Comparison of pgr amino acid sequences between spotted scat S. argus and other vertebrates虛線所標(biāo)記的序列為金錢魚Pgr的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；實(shí)線所標(biāo)記的序列為金錢魚Pgr的鋅指C4型結(jié)構(gòu)域；▲所標(biāo)記的序列為金錢魚Pgr的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域. Ligand binding domain of spotted scat S. argus Pgr sequence is marked by the dotted line, Zinc finger C4 type domain is marked by the solid line and ▲ indicates the DNA binding domain.

2.3 金錢魚pgr基因同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

pgr基因同源性分析結(jié)果顯示，在硬骨魚類中，金錢魚與大黃魚同源性最高，為86.8%。其次，與金頭鯛、高體、盲曹魚(L.calcarifer)、尼羅羅非魚和青鳉同源性分別為86.1%、85.6%、85.5%、78.8%和76.4%。而與斑馬魚的同源性較低，僅為61.6%。與哺乳類人和鼠的同源性分別為43.9%和42.8%(表2)。

表2 金錢魚Pgr與其他物種的氨基酸序列相似性分析

與序列同源性分析結(jié)果相一致，根據(jù)鄰位相連法構(gòu)建的Pgr系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，金錢魚與同為鱸形目的大黃魚、金頭鯛、高體、盲曹魚等同屬一個(gè)分支，且具有較高同源性，而與另一分支的哺乳動(dòng)物人和鼠的同源性較低(圖3)。

圖3 鄰接法構(gòu)建金錢魚等脊椎動(dòng)物Pgr系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree constructed by neighboring-joining method of the Pgr of spotted scat S. argus and other vertebrates登錄號(hào)：XP_010737027.1 金錢魚；AFV61589.1 金頭鯛；XP_010738016.2 大黃魚；XP_022617230.1 高體；XP_018521030.1 盲曹魚；XP_017271946.1 斑紋隱小鳉；XP_020490515.1 貝氏隆頭魚；AIE56465.1 尼羅羅非魚；NP_001165515.1 青鳉；ALL41462.1 中華烏塘鱧；NP_001159807.1 斑馬魚；AAQ96833.1 人；NP_032855.2 鼠.Accession number：XP_010737027.1 S. argus； AFV61589.1 S. aurata； XP_010738016.2 L. crocea； XP_022617230.1 S. dumerili； XP_018521030.1 L. calcarifer； XP_017271946.1 Kryptolebias marmoratus； XP_020490515.1 Labrus bergylta； AIE56465.1 O. niloticus； NP_001165515.1 O. latipes； ALL41462.1 Bostrychus sinensis； NP_001159807.1 D. rerio； AAQ96833.1 H. sapiens； NP_032855.2 M. musculus.

2.4 金錢魚pgr基因組織分布

組織分布結(jié)果顯示，pgr基因在雌、雄金錢魚各組織中均有表達(dá)。在雌魚中，pgr基因在腸、卵巢、垂體和下丘腦中的表達(dá)量較高，而在心臟、肝臟、腎臟等組織有微弱表達(dá)；在雄魚中，pgr基因主要在精巢、垂體和鰓中表達(dá)，在心臟、肝臟、腎臟等組織中表達(dá)量較低(圖4)。

2.5 qRT-PCR檢測金錢魚pgr mRNA在不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)

組織學(xué)結(jié)果顯示，在Ⅱ期卵巢中，生殖細(xì)胞以Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞為主；在Ⅲ期卵巢中，生殖細(xì)胞以Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，此時(shí)卵母細(xì)胞中開始累積脂滴；在Ⅳ期卵巢中，生殖細(xì)胞以Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，且卵母細(xì)胞中積累了大量的卵黃顆粒和脂滴，趨于成熟(圖5a～c)。在Ⅲ期精巢中，生殖細(xì)胞以次級(jí)精母細(xì)胞為主、開始出現(xiàn)精細(xì)胞；在Ⅳ期精巢中，除了次級(jí)精母細(xì)胞、精細(xì)胞外，在精小葉中充有大量的精子；在Ⅴ期精巢中，輸精管中充滿大量成熟的精子(圖5d～f)。

圖5 不同發(fā)育時(shí)期的金錢魚性腺組織學(xué)觀察Fig.5 Histological analysis of gonads in spotted scat S. argus at different developmental stagesa～c.卵巢組織學(xué)觀察； Ⅱ～Ⅳ.Ⅱ～Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞； LD.脂滴(▲)； YG.卵黃顆粒(▲)； d～f.精巢組織學(xué)觀察； SSC.次級(jí)精母細(xì)胞(黃色虛線內(nèi))； SPT.精細(xì)胞(黃色虛線內(nèi))； SPZ.精子； ED.輸精管.a—c.histological observation of the ovary. Ⅱ—Ⅳ.oocytes in phase Ⅱ—Ⅳ; LD.lipid drops(▲); YG.yolk granules(▲); d—f.histological observation of the testes； SSC.secondary spermatocytes (yellow dotted line); SPT.spermtids (yellow dotted line); SPZ. spermatozoa; ED.efferent ducts.

qRT-PCR結(jié)果顯示，在雌魚Ⅱ、Ⅲ期卵巢中pgr mRNA的表達(dá)無顯著差異，Ⅳ期卵巢中其表達(dá)顯著升高；雄魚精巢中的pgr mRNA的表達(dá)量顯著高于雌魚各期卵巢，且在Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期精巢中持續(xù)高表達(dá)，在Ⅳ期精巢中表達(dá)最高，隨后降低(P<0.05)(圖6)。

圖6 pgr mRNA在不同發(fā)育時(shí)期的金錢魚性腺中的表達(dá)Fig.6 Expression levels of pgr mRNA in the gonads of spotted scat S. argus at different developmental stages數(shù)值為6尾金錢魚性腺樣本的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；誤差線上的不同字母表示pgr基因在卵巢、精巢中的表達(dá)水平有顯著差異(P<0.05)，利用單因素方差分析進(jìn)行差異分析；β-actin為內(nèi)參基因.Data from six gonadal samples of S. argus are presented as mean±standard deviation (SD); different letters above the error bars indicate that the expression level of pgr gene in ovaries and testis is difference at 0.05 level determined by one-way analysis of variance (ANOVA); β-actin is the reference gene.

2.6 雌激素E2上調(diào)金錢魚垂體中pgr基因的表達(dá)

基于前期開展了雌、雄金錢魚活體注射外源雌激素E2[26]，6 h后，轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，外源雌激素E2能顯著升高雌、雄金錢魚垂體中pgr基因的表達(dá)(P<0.05)(圖7)。

圖7 雌激素E2對pgr mRNA在金錢魚垂體中表達(dá)的影響Fig.7 Effects of E2-injection on pgr mRNA expression in the pituitary of spotted scat S. argusa.轉(zhuǎn)錄組(n=3); b.qRT-PCR結(jié)果(n=5)；數(shù)值為金錢魚垂體樣本中pgr基因表達(dá)水平的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差.誤差線上的不同字母表示pgr基因在處理組和對照組垂體中的表達(dá)有顯著差異(P<0.05)，利用單因素方差分析進(jìn)行差異分析； β-actin為內(nèi)參基因.a.transcriptome data (n=3); b.qRT-PCR results (n=5); data from pgr gene expression level in pituitary samples of S.argus are presented as mean ± standard deviation (SD). Different letters above the error bars indicate that the expression level of pgr gene in treatment groups and control group in the pituitaries is difference at 0.05 level determined by one-way analysis of variance (ANOVA)； β-actin is the reference gene.

3 討 論

3.1 金錢魚pgr cDNA克隆與生物信息學(xué)分析

金錢魚pgr開放閱讀框(ORF)長度為2016 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，共編碼671個(gè)氨基酸。其中，第301～378個(gè)氨基酸為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，304～371個(gè)氨基酸構(gòu)成鋅指C4型結(jié)構(gòu)域。它是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重要組成部分，是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，廣泛參與調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能。此外，第424～671個(gè)氨基酸為配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其在不同物種間高度保守，且具有識(shí)別配體作用[4-5]。根據(jù)鄰位相連法構(gòu)建Pgr的系統(tǒng)進(jìn)化樹，同時(shí)進(jìn)行氨基酸序列同源性分析，結(jié)果顯示，金錢魚Pgr與同為鱸形目、同屬一支的大黃魚、金頭鯛、高體、盲曹魚等魚類同源性較高，為85.5%～86.8%，而與同屬鱸形目的斑馬魚同源性較低，僅為61.6%。這主要是因?yàn)榘唏R魚和其他魚類的Pgr蛋白氨基酸序列存在較大差異。研究發(fā)現(xiàn)，雖然斑馬魚和其他脊椎動(dòng)物Pgr蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域高度保守，同源性分別為83.3%～97.2%和65.3%～83.2%，但是，斑馬魚Pgr蛋白N末端的氨基酸序列高度可變，且為截?cái)嘈?，與其他脊椎動(dòng)物的同源性僅為7.1%～23.9%，這導(dǎo)致斑馬魚與其他物種的同源性為43.6%～66.3%[27-28]。

3.2 金錢魚pgr基因的表達(dá)模式與功能

組織分布結(jié)果顯示，金錢魚pgr mRNA在各組織呈泛表達(dá)模式，其中，pgr mRNA在卵巢、精巢、垂體和脾臟中高表達(dá)，在腸、鰓中的表達(dá)具有性別二態(tài)性，在心臟、肝臟、腎臟等其余組織中有微弱表達(dá)。在鯉中，成功克隆到2個(gè)pgr基因，分別命名為pgr1和pgr2。兩種pgr基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，pgr1基因和pgr2基因在各組織也呈現(xiàn)泛表達(dá)模式，其中，pgr1基因和pgr2基因在精巢、卵巢、脾臟、肌肉中高表達(dá)，在腸、肝臟、心臟、腎臟和皮膚中表達(dá)相對較低[20]。魚類pgr基因的泛表達(dá)模式暗示，Pgr可能在多種組織中介導(dǎo)孕激素信號(hào)發(fā)揮其重要的生理功能。

Pgr屬于配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，是核受體超家族中的一員。pgr基因表達(dá)除了受特異配體孕激素的調(diào)控外，還受到其他性類固醇激素如雌激素、雄激素的調(diào)控。在金錢魚中，qRT-PCR和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，在體注射外源雌激素E2能顯著上調(diào)雌、雄魚垂體中pgr mRNA的表達(dá)。此外，前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著金錢魚性腺發(fā)育，雌魚血清中的雌激素E2和雄魚血清中的雄激素11-KT水平逐漸升高[29]，與此相一致，pgr mRNA在精巢、卵巢中的表達(dá)也逐漸升高。在金頭鯛中，研究發(fā)現(xiàn)雄激素11-KT能顯著上調(diào)精巢Sertoli細(xì)胞中pgr基因的表達(dá)。同樣，雌激素E2離體孵育也能顯著上調(diào)精巢Sertoli細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中pgr基因的表達(dá)[30]。在金頭鯛中，利用人胚胎腎細(xì)胞293進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測，結(jié)果顯示，雌激素E2能劑量依賴地激活pgr基因的轉(zhuǎn)錄[31]。

近年來，硬骨魚類Pgr的功能研究主要集中在精、卵巢中，在其他組織中的功能尚不清楚，有待闡明。在雌魚卵巢中，Pgr主要參與早期卵母細(xì)胞的初級(jí)生長、卵母細(xì)胞成熟以及成熟后排卵。在雄性精巢中，Pgr主要調(diào)控精原細(xì)胞增殖和精子發(fā)生過程中生精細(xì)胞的發(fā)育[29]。此外，Pgr在雄魚排精中也具有重要作用[18]。在金錢魚中，pgr mRNA在早期精巢、卵巢中表達(dá)，配子成熟期達(dá)到最高值。這與Pgr在魚類性腺發(fā)育過程中調(diào)控配子發(fā)生及成熟的功能相符合[16-19, 31-34]。在兩棲類中，Pgr參與調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟，注射pgr mRNA能顯著提高卵母細(xì)胞響應(yīng)孕激素的靈敏度和促進(jìn)孕激素刺激下卵泡的成熟。相反，利用反義寡核苷酸抑制pgr基因的表達(dá)，則會(huì)阻滯部分卵母細(xì)胞的生發(fā)泡破裂[35-36]。在哺乳類中，Pgr在調(diào)控卵泡發(fā)育成熟、誘發(fā)排卵中也具有重要作用。在小鼠中，敲除pgr基因?qū)е麓菩孕∈笈怕亚奥雅轃o法破裂，進(jìn)而導(dǎo)致排卵失敗和雌性不育[14-15]。在豬中，利用卵泡刺激素和黃體生成刺激卵丘—卵復(fù)合物，pgr基因表達(dá)顯著升高，進(jìn)而影響卵丘細(xì)胞的增大和卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂起始[37]。

此外，在斑馬魚、金錢魚等硬骨魚類的腦中，pgr mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在成年斑馬魚的端腦、視前葉、下丘腦腹側(cè)和后隱窩等均檢測到pgr mRNA的表達(dá)[38]，暗示Pgr可能也參與魚類腦的發(fā)育調(diào)控。對大鼠研究發(fā)現(xiàn)，Pgr參與調(diào)節(jié)新生大鼠的吸氣神經(jīng)元放電，介導(dǎo)海馬體和大腦皮質(zhì)中孕激素的核途徑起到抗癇作用[39-40]。在人類，Pgr可能在星形細(xì)胞瘤向惡性轉(zhuǎn)化及惡性生長過程中具有重要作用[41]。此外，在金錢魚、鯉魚的肝臟、腸等組織中檢測到pgr mRNA的表達(dá)[20]，然而其功能尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌和肝門部膽管癌患者癌細(xì)胞中，pgr基因的高表達(dá)率有望成為檢測癌癥惡性程度的生物學(xué)指標(biāo)之一[42-43]。在結(jié)直腸癌患者，雖然無法將pgr基因的表達(dá)作為結(jié)直腸癌惡性程度的指標(biāo)，但癌癥組織中pgr基因的表達(dá)高于正常組織[44]。這些結(jié)果說明，pgr基因表達(dá)與肝臟、腸等組織的正常生理活動(dòng)密切相關(guān)。綜上所述，Pgr除參與調(diào)控脊椎動(dòng)物的生殖活動(dòng)外，在腦、肝臟和腸等多種組織中具有重要的生理功能。

4 結(jié) 論

金錢魚是我國東南沿海重要的經(jīng)濟(jì)品種，環(huán)境適應(yīng)性和抗病抗逆性極強(qiáng)[7]。不僅具有觀賞價(jià)值而且具有很高的食用價(jià)值。筆者克隆了金錢魚pgr基因并分析了其表達(dá)模式，金錢魚pgr mRNA在各組織中呈現(xiàn)泛表達(dá)，其中，在性腺和垂體中高表達(dá)。在不同發(fā)育時(shí)期性腺中，pgr mRNA的表達(dá)逐漸升高，性成熟時(shí)達(dá)到最高值，因此，Pgr可能參與調(diào)控金錢魚性腺中生殖細(xì)胞發(fā)育成熟。這對研究金錢魚性腺中Pgr的生理功能和指導(dǎo)配子發(fā)生具有一定的參考價(jià)值。