正常肝細胞和肝癌細胞對鎘暴露毒性響應差異分析

馬嬌陽，保欣晨，張振寧，王成塵，崔道雷，向 萍

西南林業(yè)大學生態(tài)與環(huán)境學院/環(huán)境修復與健康研究院, 云南 昆明 650224

鎘(Cadmium，Cd)是一種普遍存在于環(huán)境中的污染物，且具有較強的生物毒性[1]. 隨著工業(yè)的生產(chǎn)與發(fā)展，土壤和水體中的Cd污染日益嚴重[2-3]，水稻、蔬菜等植物源性食物可以通過根系富集土壤中的Cd，水體中的Cd也可通過食物鏈逐漸富集到魚蝦貝類等海產(chǎn)品中造成食品污染[4-6]. 因此，長期攝入被Cd污染的食品可導致其在體內(nèi)蓄積，從而對人體產(chǎn)生危害. 肝臟作為機體的主要代謝場所，且是人體急性或慢性Cd中毒的主要靶器官，對金屬的毒性敏感性較強，這可能是由于肝臟中可合成金屬硫蛋白，從而減弱Cd對人機體的危害[7-9]. 然而，當肝細胞持續(xù)壞死或凋亡時，將會影響Cd金屬硫蛋白復合物的表達[10].研究表明，低濃度Cd (0.25 μmol/L)可能會促進細胞的增殖[11]，而高濃度Cd (＞5 μmol/L)會誘導許多器官和組織的凋亡[12].

重金屬對肝臟具有明顯的毒性效應，在細胞水平上重金屬可影響細胞的活性、分化和凋亡等[13]. 目前，人正常肝細胞系(HL-7702)和肝癌細胞系(HepG2)均被用于重金屬毒性研究[10,14-17]，且人正常肝細胞系和肝癌細胞系對重金屬的響應不同. 目前，研究者多采用肝癌細胞系(HepG2)來探究Cd對人體肝細胞的毒性效應及其機制[18-19]，但人正常細胞系和癌細胞系中的基因轉(zhuǎn)錄表達水平具有明顯差異，因此兩種不同類型的細胞可能對重金屬毒性的耐受性有所差異[20].Xiang等[21]研究表明，采用人正常肝細胞可準確評估外部污染物對肝臟的毒性效應，與肝癌細胞相比，正常肝細胞與人體內(nèi)組織的生理生化條件更加吻合.

目前，Cd對人正常肝細胞和肝癌細胞的毒性效應及其分子機制的研究較為鮮見. 因此，該研究對正常肝細胞系(HL-7702)和肝癌細胞系(HepG2)經(jīng)Cd暴露后在細胞活力、形態(tài)、凋亡及凋亡相關(guān)基因表達等方面的響應差異進行了深入研究，比較了Cd對兩種細胞的毒性效應，以期為準確評價Cd對肝細胞的毒性效應提供科學的試驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 設(shè)備及試劑

該研究使用的設(shè)備有以下幾種：CO2細胞培養(yǎng)箱(371型，賽默飛，美國)；酶標儀(SpectraMax?Plus 384型，Molecular Devices LLC公司，美國)；倒置顯微鏡(TS-10型，尼康，日本)；流式細胞儀(CyFlow?Cube6型，Sysmex Partec GmbH，德國)；高速冷凍離心機(ST16R型，Thermo，美國)；超微量分光光度計(Nanophotometer N60型，IMPLEN，德國)；梯度PCR儀(Mastercycler Nexus Gradient型，Eppendorf，德國)；聚合酶鏈式反應儀(熒光定量)( LightCycler?480 Ⅱ型，瑞士羅氏).

該研究使用的試劑有以下幾種：DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基、MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素鏈霉素溶液-雙抗(penicillin streptomycin，PS)和0.25%胰蛋白酶溶液，均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、總RNA快速提取試劑、cDNA第一鏈快速合成試劑盒(去基因組)、SYBR green qPCR master mix，均購自南京翼飛雪生物科技有限公司；分析純氯化鎘(CdCl2)，購自上海金山亭新化工試劑廠.

1.2 細胞培養(yǎng)與暴露

人正常肝細胞系(HL-7702)來自中國科學院細胞庫(上海)，人肝癌細胞系(HepG2)來自美國模式培養(yǎng)物寄存庫(American type culture collection，ATCC).HL-7702細胞和HepG2細胞分別生長于含有10%胎牛血清、1%PS的DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基和MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

用純水溶解CdCl2以配置細胞暴露母液，并用0.22 μm濾膜(Milipore-GP，美國)除菌以備用. 在進行細胞暴露前，利用細胞相應的基礎(chǔ)培養(yǎng)基將CdCl2溶液稀釋至目標濃度.

1.3 細胞形態(tài)及活力

為探究重金屬Cd對正常肝細胞和肝癌細胞活力的變化，將HL-7702細胞和HepG2細胞以1×104cells/(100 μL·孔)的密度接種于96孔板中，并于CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育過夜待細胞貼壁. 根據(jù)Aziz等[10]所設(shè)定的Cd濃度對細胞進行暴露，將完全培養(yǎng)基更換為含有不同Cd濃度(0～4 mg/L)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h. Cd暴露后，利用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)并拍照，隨后根據(jù)CCK-8試劑盒說明書進行吸光度測定.

1.4 細胞凋亡

為測定細胞凋亡，將HL-7702和HepG2細胞以1×106cells/(2 mL·孔)的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，將完全培養(yǎng)基吸出并棄掉，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞作為對照組，以含0.25和1 mg/L Cd的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為試驗暴露組. 隨后，將細胞放置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，收集細胞并用預冷的PBS溶液洗滌2次，用1×Binding Buffer懸浮細胞，在細胞懸液中依次加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)孵育細胞. 最后，用流式細胞儀檢測凋亡情況并用FlowJo v10軟件進行數(shù)據(jù)分析.

1.5 RNA提取、轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR

為了探究重金屬Cd對肝細胞凋亡的相關(guān)分子機制，進一步測定其相關(guān)基因的表達. 在HL-7702細胞和HepG2細胞暴露于0.25和1 mg/L Cd溶液24 h后，進行總RNA快速提取，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA. 之后，利用SYBR green qPCR master mix進行實時定量PCR (qRT-PCR)，反應循環(huán)條件：首先為95 ℃ 10 min；然后在95℃ 15 s和60℃ 1 min的條件下循環(huán)40次.以β-Actin作為內(nèi)參基因來計算相關(guān)基因的表達，細胞凋亡相關(guān)的引物序列如表1所示.

表1 細胞凋亡相關(guān)引物信息Table 1 The information of apoptosis related primers

1.6 數(shù)據(jù)分析

研究數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式呈現(xiàn)，利用Microsoft Office Excel 2019軟件計算數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8和FlowJo v10軟件作圖，認為當P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 重金屬鎘對肝細胞活力及形態(tài)影響

細胞活力是反映污染物對細胞毒性效應的重要指標之一. 為探究Cd對正常肝細胞和肝癌細胞活力的差異，該研究將HL-7702細胞和HepG2細胞暴露于不同濃度的Cd中以測定細胞活力的變化，結(jié)果表明，正常肝細胞和肝癌細胞的細胞活力變化趨勢有所差異. 由圖1(a)(c)可見：當Cd濃度為0.25和0.5 mg/L時，正常肝細胞和肝癌細胞活力下降均小于5%，且與對照組無顯著差異；當Cd濃度為1 mg/L時，HL-7702細胞活力降至65% (P＜0.000 1)，而HepG2細胞活力與對照組無顯著差異；當Cd濃度大于1 mg/L時，兩種細胞活力均明顯下降. 結(jié)果說明，Cd所誘導的肝細胞毒性是具有濃度依賴性的，與Aziz等[10]研究結(jié)果較為一致. 基于擬合曲線，兩種細胞對Cd的半致死濃度(LC50)如圖1(b)(d)所示，HL-7702細胞對Cd的半數(shù)致死濃度(LC50)(1.9 mg/L)低于HepG2細胞(2.4 mg/L)，說明兩種細胞對Cd暴露的耐受性不同，正常肝細胞對Cd更為敏感，與Xiang等[21]研究結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)細胞暴露于外部污染物后肝癌細胞比正常肝細胞更具有耐受性. 此外，正常肺細胞(MRC-9)和癌變肺細胞(A549)對Cd暴露的敏感性也有所不同[22]. 因此，正常肝細胞和肝癌細胞對Cd暴露的毒性響應具有差異.

圖1 不同濃度Cd對正常肝細胞（HL-7702）和肝癌細胞（HepG2）活力及半數(shù)致死濃度（LC50）的影響Fig.1 Effects of cadmium exposure on cell viability and the lethal concentration (LC50) of normal (HL-7702) and cancerous (HepG2) hepatic cells

利用倒置顯微鏡觀察不同Cd濃度暴露組下HL-7702細胞和HepG2細胞的形態(tài)差異. 由圖2可見：對照組中，HL-7702細胞形態(tài)呈多邊形狀；當暴露于0.25 mg/L的Cd后細胞形態(tài)與對照組差異不明顯；而當HL-7702細胞暴露于1 mg/L的Cd后，有部分細胞萎縮成圓形并具有明顯的細胞碎片堆積，且該濃度Cd暴露下，細胞活力也顯著下降〔見圖1(a)〕，說明Cd使正常肝細胞產(chǎn)生明顯損傷[23]. 對照組中，HepG2細胞呈堆積生長，單個細胞形態(tài)不明顯；當暴露于0.25和1 mg/L的Cd后，均與對照組細胞形態(tài)無明顯差異，同樣HepG2細胞活力也無顯著下降趨勢〔見圖1(c)〕.

圖2 不同濃度Cd暴露后正常肝細胞（HL-7702）和肝癌細胞（HepG2）的形態(tài)變化Fig.2 Morphology changes of normal (HL-7702) and cancerous (HepG2) hepatic cells after exposure to cadmium

2.2 重金屬Cd誘導的肝細胞凋亡

細胞凋亡是一種嚴格控制的程序性細胞死亡過程，其對生物體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及系統(tǒng)的生長發(fā)育有重要作用，但異常凋亡是一種病理過程[24-26]. 根據(jù)細胞活力及形態(tài)的結(jié)果，將HL-7702細胞和HepG2細胞暴露于濃度為0.25和1 mg/L的Cd中，研究Cd誘導兩種肝細胞凋亡情況的差異. Annexin V-FITC和PI雙染法常被應用于區(qū)分細胞早期凋亡與晚期凋亡[27]，因此對細胞進行雙染后，利用流式細胞儀測定細胞的分布(見圖3)，其中象限Q1～Q4分別代表壞死、晚期凋亡、早期凋亡、活細胞的數(shù)量. 由圖3可見：暴露在濃度為0.25 mg/L的Cd下，HL-7702細胞凋亡率與對照組無顯著差異；而Cd濃度升至1 mg/L時，正常肝細胞凋亡率顯著升高，較對照組凋亡率增加了4倍. 因此，暴露于不同濃度的Cd后人正常肝細胞凋亡率變化規(guī)律與其對應的細胞活力一致，而Cd對HepG2細胞凋亡的影響與HL-7702細胞不同，暴露于0.25和1 mg/L的Cd后，HepG2細胞的凋亡率均增至對照組的2倍〔見圖3(e)～(h)〕. 因此，在該研究檢測濃度(0.25～1 mg/L)下，正常肝細胞的抗凋亡能力顯著高于肝癌細胞，可能與正常細胞相比，癌細胞中有超過500個表達異常的基因，細胞表面死亡受體差異較大，多個輔助細胞抵抗外界刺激的酶活性均顯著降低[20,28-29]. 因此，采用HepG2細胞探究Cd對人體肝臟細胞凋亡的影響將會高估其健康風險. 此外，細胞死亡可通過壞死或凋亡發(fā)生[16]. 該研究中暴露于Cd后，與對照組相比，正常肝細胞活細胞率從97.3%降至85.3%，降幅為12%〔見圖3(a)～(c)〕，而肝癌細胞的降幅為5.3%〔見圖3(e)～(g)〕. 因此，暴露于0.25～1 mg/L Cd中HL-7702細胞的活細胞率降幅明顯高于HepG2細胞，與細胞活力檢測呈現(xiàn)的趨勢較為一致.綜上，不同濃度Cd均能促進兩種細胞的凋亡率或壞死率，從而降低活細胞的比率.

圖3 Cd誘導正常肝細胞（HL-7702）和肝癌細胞（HepG2）凋亡情況Fig.3 Cadmium triggered human normal (HL-7702) and cancerous (HepG2) hepatic cell apoptosis

細胞凋亡在Cd所誘導的肝毒性中是一個極其重要的過程[30]，而目前研究Cd對肝細胞的損傷多采用肝癌細胞(HepG2). 然而，正常肝細胞和肝癌細胞的代謝具有差異，因此可能會影響其對外部脅迫的響應. Wang等[31]研究表明，相同濃度藥物作用下HepG2細胞的凋亡率明顯增加，而HL-7702細胞并無顯著變化. 此外，在正常肝細胞和肝癌細胞暴露于高劑量金屬有機骨架化合物后，HL-7702細胞凋亡率較HepG2細胞更明顯[32]. 因此，在外部脅迫下正常肝細胞和肝癌細胞毒性響應存在差異. 在其他生物體內(nèi)，重金屬Cd也可引起肝臟凋亡的現(xiàn)象. Habeebu等[30]研究表明，Cd暴露組的小鼠肝臟凋亡指數(shù)增至對照組的30倍. 此外，Cd也可誘導斑馬魚ZFL肝臟細胞出現(xiàn)凋亡的現(xiàn)象[33]. 因此，當生物體內(nèi)攝入Cd后會在肝臟積累，從而可能對組織器官產(chǎn)生毒性效應.

2.3 重金屬鎘改變肝細胞凋亡相關(guān)基因

為了進一步闡述Cd誘導不同肝細胞凋亡的分子機制的差異，利用qRT-PCR技術(shù)測定與細胞凋亡相關(guān)基因的表達水平.Bcl-2和Bax屬于Bcl-2基因家族，其中，Bcl-2是一種原癌基因，可抑制細胞的凋亡，其可調(diào)節(jié)多種細胞的增殖和凋亡相關(guān)基因的表達；而Bax是促凋亡基因，其表達過高將會加速細胞死亡[34-36]. 兩種細胞在暴露于不同濃度的Cd后，有關(guān)凋亡基因的mRNA表達水平如圖4所示. 由圖4可見：暴露于1 mg/L的Cd可明顯下調(diào)HL-7702細胞中Bcl-2的表達水平，但可上調(diào)HepG2細胞中Bcl-2的表達水平；而兩種細胞在暴露于0.25和1 mg/L的Cd后，Bax的表達均無顯著性變化. 此外，細胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生也可通過Bcl-2/Bax(表達水平的比值)的降低進行表征[37]，暴露于1 mg/L的Cd可顯著降低HL-7702細胞中Bcl-2/Bax值(降至0.54±0.14)，而Cd對HepG2細胞中Bcl-2/Bax值無顯著影響. 因此，Cd暴露僅誘導人正常肝細胞中Bcl-2家族相關(guān)基因的表達，而對肝癌細胞無顯著影響.Caspase-3作為效應凋亡蛋白酶，在線粒體凋亡途徑中起至關(guān)重要的作用，其過量表達將會介導細胞凋亡[38-39]. HL-7702細胞暴露于1 mg/L的Cd后，Caspase-3的表達上調(diào)至對照組的2倍〔見圖4(a)〕，然而在HepG2細胞中兩種不同濃度的Cd均明顯誘導Caspase-3表達上調(diào)〔見圖4(b)〕，該結(jié)果與流式細胞儀所測細胞凋亡率的結(jié)果較為一致. 綜上，Cd可激活細胞凋亡相關(guān)信號通路，進而使正常肝細胞和肝癌細胞發(fā)生凋亡.

圖4 暴露于不同濃度Cd后正常肝細胞（HL-7702）和肝癌細胞（HepG2）凋亡相關(guān)基因的mRNA表達水平Fig.4 Cell apoptosis related genes expression in both normal (HL-7702) and cancerous (HepG2)hepatic cells after exposure to cadmium

研究[40]表明，重金屬Cd會引起生物體組織/器官凋亡相關(guān)基因表達的改變，其中在U-87 MG人星形膠質(zhì)細胞中，當Cd濃度大于2.2 mg/L時，會誘導下調(diào)Bcl-2的表達，上調(diào)Bax的表達. 同樣，Cd也可降低人支氣管細胞16-HBE中Bcl-2的表達[41]. 對于人或水生生物肝細胞，Cd可通過激活Caspase-3等相關(guān)信號通路誘導細胞凋亡[42-43]. 筆者研究中正常肝細胞暴露于Cd后，不僅激活了Caspase-3的表達，而且降低了Bcl-2表達；但在肝癌細胞，Cd僅誘導上調(diào)Caspase-3的表達. 結(jié)果表明，Cd可通過激活正常肝細胞和肝癌細胞中凋亡相關(guān)基因的表達，從而導致凋亡. 因此，正常肝細胞和肝癌細胞將通過不同的分子機制來響應Cd暴露對細胞產(chǎn)生的毒性效應.

3 結(jié)論

a) 不同濃度的Cd對正常肝細胞(HL-7702)和肝癌細胞(HepG2)活力的影響存在差異，HL-7702細胞對Cd的半數(shù)致死濃度(LC50)為1.9 mg/L，HepG2細胞為2.4 mg/L，正常肝細胞對Cd毒性更為敏感.

b) 當Cd濃度為0.25 mg/L時，僅誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡；而Cd達1 mg/L時，HL-7702和HepG2細胞的凋亡率均明顯升高. 因此，在Cd暴露后，正常肝細胞抗凋亡能力要顯著高于肝癌細胞，而利用肝癌細胞將會高估Cd對人體肝臟的健康風險.

c) 在HL-7702細胞中，Cd通過激活Caspase-3和降低Bcl-2的表達使細胞產(chǎn)生凋亡；在HepG2細胞中，Cd僅激活Caspase-3的表達. 綜上，Cd可通過改變不同凋亡基因的表達促使正常肝細胞和肝癌細胞凋亡.